RNA干扰抑制Aurora A表达对胶质瘤U251细胞化疗敏感性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNU)作用下转染Aurora A siRNA前后U251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNU对转染Aurora A siRNA后U251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNU作用下转染后U251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。     

枸杞多糖联合卡铂对人胶质瘤U251细胞生长抑制和凋亡作用

目的观察枸杞多糖联合卡铂对神经胶质瘤U251细胞生长抑制和凋亡作用。方法将U251细胞随机分为四组,A组（空白组）加常规培养液,B、C、D三组分别加枸杞多糖、卡铂、枸杞多糖＋卡铂联合组;通过细胞形态学、噻唑蓝法（methylthiazdyl tetrazolium,MTT）、DNA断端末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）及流式细胞仪,观察U251细胞生长抑制及凋亡情况。结果 B、C、D三组细胞生长抑制率及凋亡率均升高,但D组升高更明显,P〈0.05。结论枸杞多糖联合卡铂更易使U251胶质瘤细胞生长受抑制,且诱导其凋亡。     

shRNA干扰MIPU1基因对脑星形细胞瘤U251细胞生物学行为的影响

目的： 探讨特异性短发夹RNA(shRNA) 干扰心肌缺血预适应上调基因1(myocardial ischemia preconditioning upregulated gene 1,MIPU1)对人脑星形细胞瘤U251 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的影响。方法： 采用瞬时转染MIPU1 shRNA干扰质粒,蛋白质印迹检测其干扰效率,MTT法检测各组细胞的增殖情况,Hoechest 染 色法和caspase-3 活性检测细胞凋亡程度,划痕实验及Transwell 实验检测细胞迁移及侵袭能力。结果： 转染MIPU1 shRNA 可明显降低MIPU1 蛋白的表达(P<0.05);与对照组比较,MIPU1 shRNA 组的U251 细胞增殖能力下降,凋亡 明显增加,细胞迁移及侵袭能力减弱(均P<0.05)。结论： MIPU1 shRNA能有效降低U251 细胞中MIPU1 蛋白的表达, 干扰MIPU1的表达可促进U251细胞凋亡,抑制U251细胞的增殖、迁移及侵袭。     

ING4蛋白对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨ING4(inhibitor of growth family4)蛋白对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法 用PEI转染ING4蛋白过表达(pEGFP-C2/ING4转染组)及阴性对照载体(pEGFP-C2转染组)至人胶质瘤U251细胞,G418筛选后建立ING4蛋白稳定表达细胞株;RT-PCR、免疫...     

miR-136对胶质瘤U251细胞生物学功能的影响

目的: 初步探讨miR 136对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法: 选取胶质瘤U251细胞系,分别转染miR 136 mimic(模拟物组)和miR 136模拟物阴性对照(对照组),采用qRT PCR法检测转染效率,观察2组细胞miR 136表达差异;显微镜下观察转染24 h后细胞密度,并拍照记录;CCK 8法检测转染后细胞增殖活性;Transwell和划痕实验分别检测转染后细胞侵袭及迁移能力;检索miRnada生物信息学数据库,预测并分析miR 136下游靶基因;qRT PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞中FZD4 mRNA和FZD4蛋白的表达。结果： 与对照组相比,模拟物组细胞miR 136表达水平明显升高(P<0.05);转染24 h之后,模拟物组细胞密度低于对照组;CCK 8检测显示模拟物组细胞增殖活性较对照组明显降低(P<0.05);Transwell和划痕实验显示模拟物组细胞侵袭和迁移能力较对照组降低;miRnada数据库分析显示FZD4是miR 136的下游靶基因;与对照组相比,模拟物组FZD4 mRNA和FZD4蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05)。 结论： miR 136可能通过靶向调控FZD4基因的表达抑制胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和转移。     

PTEN基因重组腺病毒载体对脑胶质瘤U251生长和凋亡的影响

目的探讨PTEN基因对人脑胶质瘤细胞株U251生长及凋亡的影响。方法携带PTEN基因的重组腺病毒载体转染U251细胞株,采用RT-PCR技术和Western blot方法检测Ad-PTEN-GFP组及Ad-GFP及Control组中PTEN mRNA及蛋白水平表达,用MTT及流式细胞仪检测各组细胞生长、周期及凋亡率等变化,Western blot检测细胞蛋白水平表达的变化。结果 Ad-PTEN-GFP转染U251细胞后,经荧光显微镜、PCR和Western blot证实转染成功。Ad-PTEN-GFP转染U251细胞后,细胞生长明显受抑制（P〈0.05）。Ad-PTEN-GFP转染组中p-Akt及P65蛋白水平下降,与Control组相比差异有统计学意义。结论 PTEN基因转染后能抑制人脑胶质瘤U251的生长,调控细胞周期,可能通过PTEN-Akt-NF-кB促进细胞凋亡。     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

肠道病毒71型对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响

  目的  探讨肠道病毒71型（EV71）对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响。  方法  采用非洲绿猴肾细胞Vero对EV71进行增殖,用Reed-Muench公式计算病毒液的50%细胞感染剂量（50% tissue culture infective dose,TCID₅₀);将EV71接种于U251细胞,光学显微镜下观察细胞形态,激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态,透射电镜观察线粒体超微结构的改变;Western blot检测线粒体分裂蛋白Drp1、p-Drp1(S637)和融合蛋白Opa1的表达水平;ATP试剂盒检测线粒体ATP水平;MitoSOX染色检测线粒体超氧化物水平。  结果  EV71的TCID₅₀为10－5.4/ 0.1 mL; EV71感染U251细胞24 h、48 h后细胞明显出现皱缩、变圆或死亡。激光共聚焦显微镜和透射电镜结果显示,EV71感染后细胞线粒体明显延长,线粒体嵴模糊不清;Western bolt结果显示,EV71感染U251细胞24 h和48 h后,Drp1、Opa1表达降低,而p-Drp1（S637）在48 h表达升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。EV71感染48 h后,与未感染EV71的U251细胞相比,线粒体ATP生成减少,线粒体超氧化物水平升高（P<0.05）。  结论  EV71感染U251细胞后,能引起线粒体形态及动力学改变,进而导致线粒体功能的变化,这可能是其引起神经系统功能紊乱的机制之一。     

2－甲氧基雌二醇诱导胶质瘤细胞凋亡及机制的研究

目的探讨2－甲氧基雌二醇（2ME）对体外培养的U251胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法将不同浓度的2ME作用于U251不同时间,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测2ME对U251细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果2ME可抑制U251细胞的活性并诱导其凋亡,且在一定范围内呈剂量和时间依赖性,作用组与对照组之间的差异有统计学意义（P〈0．05）。细胞周期检测发现作用组Go／G1及S期细胞减少,G2／M期细胞增多,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论2ME可抑制U251胶质瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。     

雷公藤甲素对U251细胞自噬活性的影响及机制研究

目的 探讨雷公藤甲素对U251细胞自噬活性的影响及机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测雷公藤甲素对U251细胞的增殖抑制率、半数抑制浓度(IC50);免疫荧光化学法测定细胞中LC3-Ⅱ表达,Western blot法测定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk、磷酸化AKT蛋白的表达.结果 雷公藤甲素作用于U251细胞后,细胞增殖受抑制,24 h的IC50为0.73 μmol/L,48 h的IC50为0.27μmol/L.免疫荧光法测定6、12、24 h后LC3-Ⅱ水平增高;Western blot法测定LC3-Ⅱ水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随时间增高;Beclin-1水平增高,磷酸化P70、磷酸化Erk表达降低、磷酸化AKT无明显变化.结论 雷公藤甲素可抑制U251细胞增殖并促进自噬,并可通过上调Beclin-1表达和抑制mTOR的活性来促进自噬.     

Survivin反义寡核苷酸增强U251人胶质瘤细胞对顺铂的敏感性研究

目的研究Survivin反义寡核苷酸对U251人胶质瘤细胞顺铂治疗敏感性的影响。方法脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞，Western blot法检测内源性Survivin表达水平的变化，MTT法检测顺铂对细胞生长情况的影响，流式细胞仪（FCM）观察顺铂诱导各组U251细胞的凋亡。结果反义Survivin脂质体复合物能有效下调Survivin表达水平，并且能抑制U251细胞的生长，提高U251细胞对顺铂的敏感性。流式细胞仪检测凋亡率明显提高。结论Survivin反义寡核苷酸能增强顺铂诱导的U251细胞凋亡。Survivin反义寡核苷酸和顺铂联合用药对U251细胞生存具有协同抑制效应，可改善治疗效果。     

Stra 6基因的克隆及其在U251细胞中的表达定位

目的:从人胎盘cDNA文库中获得Stra6基因的全长阅读框架,通过融合GFP蛋白的表达观察其在人脑胶质母细胞瘤细胞株U251中的表达定位及形态学影响。方法:应用高保真PCR技术从人胎盘cDNA文库中扩增出特异片段,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-Stra6,转染U251细胞,荧光倒置显微镜观察蛋白表达定位及对形态学影响。结果:获得含人Stra6基因全长阅读框架的重组质粒pEGFP-Stra6,融合GFP的Stra6蛋白大多表达于细胞质和细胞膜。可观察到转染后的细胞呈现分化状态。结论:Stra6基因过表达使U251细胞形态改变,可能在细胞分化中起作用。     

氯通道ClC-2反义寡核苷酸对顺铂作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响

目的：探讨氯通道ClC-2 反义寡核苷酸(AON)抑制ClC-2基因表达对顺铂(DDP)作用下神经胶质瘤U251细胞侵袭力的影响,为ClC-2成为神经胶质瘤综合治疗的新基因靶点提供理论依据。方法：U251细胞按处理方法不同分为对照组（转染无义寡核苷酸）、AON组（转染ClC-2反义寡核苷酸）、DDP组（无义寡核苷酸与顺铂联用）和AON +DDP组（ClC-2反义寡核苷酸与顺铂联用）。应用RT-PCR检测相关基因ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell 小室侵袭实验检测各组细胞侵袭力;Transwell 小室迁移实验检测各组细胞迁移率。结果：与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组ClC-2、cyclin D1 、MMP-2、MMP-9 mRNA表达率降低（P＜0.05）;Transwell 小室侵袭实验中对照组、AON组、DDP组和AON +DDP组侵袭细胞数分别为81.00±4.58、42.01±4.36、48.33±2.52和12.67±5.13;与对照组比较,AON组、DDP组和AON +DDP组穿透细胞数明显降低（P＜0.05）。Transwell 小室迁移实验中AON 组、DDP组、AON +DDP组细胞迁移率（%）分别为72.40±2.20、51.48±1.29、37.87±1.50,与对照组比较均明显降低（P＜0.05）。结论：①转染ClC-2反义寡核苷酸能有效抑制ClC-2 mRNA表达;②抑制ClC-2 mRNA能降低U251细胞的迁移力和侵袭力;③ClC-2 mRNA表达降低可促进顺铂对U251细胞迁移力和侵袭力的抑制作用。     

siRNA特异性"沉默"Bim基因对胃腺癌细胞凋亡的影响

目的研究BH3-only蛋白Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用。方法流式细胞仪PI单染法检测细胞凋亡率;JC-1染色检测线粒体膜电位的变化;在紫杉醇相对敏感SGC-7901胃腺癌细胞株中采用小干扰RNA(siRNA)技术特异性"沉默"Bim基因;Western blot分别检测紫杉醇诱导siRNA"沉默"Bim基因前后Bim蛋白的表达水平变化。结果紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性,SGC-7901较BGC-823胃腺癌细胞株对紫杉醇更为敏感。紫杉醇诱导SGC-7901及BGC-823胃腺癌细胞很大程度依赖线粒体途径凋亡。特异性"沉默"Bim基因的转录,紫杉醇诱导凋亡敏感细胞株SGC-7901的凋亡率明显降低。结论Bim在紫杉醇诱导胃腺癌细胞凋亡中发挥关键调节作用。     

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的：探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用，建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法：构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒，转染A549肺肿瘤细胞，观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果：针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达，并当比例为1：1时效果最佳，而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论：以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段，并且为研究基因功能的一条有效途径。     

胶质瘤细胞系U251中Nanog基因的研究

目的 Nanog作为全能性或多能性干细胞标志物,在胶质瘤细胞系中的研究甚少。本研究通过免疫组织化学来探讨Nanog基因在U251胶质瘤细胞系中的表达情况,以及全反式维甲酸(ATRA)对胶质瘤细胞系U251的诱导分化情况。方法采用免疫组织化学染色法从蛋白质水平检测U251胶质瘤细胞系Nanog的表达情况,以及应用化疗药物全反式维甲酸(ATRA)作用前以及作用后1、2、3d Nanog蛋白的表达情况。结果 ATRA作用前免疫组化结果显示大量细胞表达Nanog蛋白,主要位于胞浆内,胞核内有少量表达,少数细胞完全不表达;ATRA作用1、2、3d后的的细胞爬片结果显示有些许细胞变圆,少量的细胞漂浮于培养基内,Nanog蛋白的表达情况同ATRA作用前相比有了减少,并且随着作用时间的延长表达愈来越少。结论 Nanog基因在胶质瘤细胞系U251中表达,诱导分化剂ATRA能够降低Nanog的表达,并且随着作用时间的延长表达越来越少。