HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

小鼠高迁移率族蛋白B1启动子的构建与转录活性检测

【目的】构建小鼠高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子全长序列的荧光素酶报告基因用于药物筛选。【方法】采用PCR技术扩增小鼠HMGB1基因启动子全长序列,用GV238载体构建报告质粒GV238-HMGB1-P-Luc,以pGL3-basic作为阴性对照质粒,与内参质粒pRL共转染Hela细胞,以内毒素(LPS,0.2μg/mL)作为激活剂,以正丁酸钠(SB,10 mmol/L)作为抑制剂,分组处理24 h后检测荧光素酶活性。【结果】经酶切、PCR及测序鉴定证实克隆的HMGB1基因启动子全长2 140 bp,DNA序列正确无突变。与pGL3-basic组比较,GV238-HMGB1-P-Luc组荧光素酶活性显著增强(P0.05);与GV238-HMGB1-P-Luc组比较,LPS组荧光素酶活性显著增强(P0.01);与LPS组比较,SB组荧光素酶活性显著降低(P0.01)。【结论】HMGB1基因启动子报告基因构建成功,LPS可以增强其表达,SB则可以抑制LPS刺激下的HMGB1启动子表达增强,可为下一步筛选具有调控HMGB1启动子活性的药物奠定基础。     

人PSMA基因启动子表达载体pGL3-PSMP的构建

目的：构建含人前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）基因启动子表达载体pGL3-PSMP。方法：PCR扩增人PSMA上游1175bp启动子序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic,构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP,重组子经双酶切、测序鉴定。将构建载体用脂质体转染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3M,应用双荧光素酶测定系统检测荧光素酶的表达活性。结果：序列测定表明,克隆获得的1175bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人PSMA基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高,比pGL3-Basic高10倍多。结论：成功构建了含人PSMA基因启动子的荧光素酶表达载体。     

Noxl基因启动子表达载体的构建

目的克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox）上游启动子序列,为研究Noxl基因的转录调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1415bp（-1415-0）、1276bp（-1415～-140）、997bp（-1415～-419）、839bp（-1415～-577）、470bp（-1415～-946）大小的Noxl启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性。结果在A549细胞中,各Noxl启动子片段均有活性;-140～-419bp和-577～-946bp区域可能存在Noxl启动子核心区域。结论成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Noxl启动子序列,为进一步研究Noxl基因的转录调控机制奠定了基础。     

MDR1启动子的活性研究

目的:克隆编码多药耐药基因-1（MDR1）中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性。方法: 利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段。pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn。以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性从而比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性。结果:通过酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变。将表达载体转染细胞后活性检测结果显示pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03 2.35)%、(14.60 3.57)%和(10.27 1.89)%;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26 6.84)%、(59.08 4.95)%和(62.39 5.76)%。结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P。启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性。     

肺癌细胞中CD59 rs79077373 遗传变异 对其转录活性的影响

目的 探讨肺癌细胞中CD59 启动子区rs79077373 遗传变异对其转录活性的影响。方法 利用 TRANSFAC 预测可能影响CD59 转录活性的启动子区遗传变异，然后构建含有不同等位基因的CD59 启动子 区报告基因载体，分别命名为pGL3-rs79077373C 和pGL3-rs79077373T，将重组质粒与内参质粒pRL-SV40 共转染于肺癌细胞A549、NCI-H23、NCI-H2030 后，检测报告基因活性。结果 生物信息学分析发现当 CD59 rs790773737 增加转录因子TBP 的结合。荧光素酶报告基因结果显示，在肺癌细胞A549、NCI-H2030、 NCI-H23 细胞中pGL3-rs79077373T 组的相对荧光素酶活性分别是pGL3-rs79077373C 组的2.00、1.82 和 1.42 倍（P <0.05）。结论 CD59 启动子区rs79077373 C>T 变异可增加CD59 的启动子的活性。     

CYP3A4＊1G基因多态性及功能的初步探讨

采用双荧光素酶报告基因系统分析CYP3A4＊ 1G多态性对CYP3A4基因转录活性的影响.构建含CYP3A4＊ 1G突变位点的荧光素酶基因表达载体,用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞,化学发光法检测荧光素酶活性. 应用双荧光素酶报告基因系统检测显示,pGL3-promoter-A质粒转染后荧光素酶活性显著高于pGL3-promoter-G（P=0.022＜ 0.05）. CYP3A4＊ 1G能够增强荧光素酶基因的表达,可能增强CYP3 A4基因的转录活性.     

人MUC5AC基因启动子荧光素酶报告 基因载体的构建及其转录活性分析

目的：克隆人黏蛋白/黏液素5AC(MUC5AC)基因启动子并构建该启动子的荧光素酶报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性。方法：运用Vector NT1软件包对MUC5AC基因5′端1 348 bp进行启动子特征分析;以人A549细胞基因组DNA为模板分离出人MUC5AC基因5′端非翻译区大小为1 348 bp的片段并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板对启动子进行5′端删除分析,分别扩增737 bp(-689/+48),372 bp(-324/+48),112 bp(-64/+48)的片段,与荧光素酶报告基因载体重组构建,通过双荧光素酶活性进行转录活性分析。应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区SP-l结合位点和核因子（NF）-κB结合位点单独突变体,并测定中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导的转染细胞荧光素酶的相对活性。结果：序列分析发现人MUC5AC基因5′端1 348 bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功构建了4个不同长度的MUC5AC启动子报告基因载体。双荧光素酶活性分析372 bp片段为有活性的最小片段。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导SP-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究MUC5AC基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。MUC5AC 5′上游序列中-324/-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件SP-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用。     

糖皮质激素诱导A549细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用

目的 探讨糖皮质激素诱导11β-羟基类固醇脱氢酶1型表达,其选择性启动子的使用情况,为进一步研究糖皮质激素诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础.方法 糖皮质激素皮质醇（100 nM）和地塞米松（100 nM）预先处理A549细胞,通过半定量-RT-PCR和荧光报告基因检测方法,检测A549细胞中HSD11B1 mRNA表达水平和报告基因蛋白表达水平.结果 半定量-RT-PCR结果显示A549细胞中HSD11B1mRNA表达显著增加经由P1和P2两个启动子,但HSD11B1 mRNA表达主要来自于P2;荧光报告基因表达结果显示A549细胞中糖皮质激素诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加,然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化.结论 糖皮质激素诱导A549细胞HSD11B1表达经由选择性启动子P2.     

基于报告基因能筛选下调p66shc基因转录的药物普筛系统的建立

将p66shc基因的启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,然后将重组质粒pGL3B-neo-p66shc转染入人的肺癌细胞A549中,通过单集落分离法得到含有重组质粒的稳定细胞系A549/p66shc。利用这个以报告基因为基础的药物普筛系统,筛选了数百种中药提取物及单体化合物,发现抑制率达到50%以上的2种中药提取物和8种单体化合物。     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的:探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的词控机制。方法:以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1--1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc，采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS—Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞，用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞，检测并比较荧光素酶／β-半乳糖苷酶活性，以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果：(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确；(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达；(3)在LPS刺激下．人eNOS启动子的转录活性降低，而在tPNS和TGFβ1刺激下，其启动子的转录活性增强，其中，TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论：正确构建了人eNOS基因启动子区(-1-1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS—Luc；tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

缺氧对Egr-1启动子辐射诱导活性的影响及机制的初步探讨

目的　探明缺氧对早期生长反应基因 1(earlygrowthresponsegene 1,Egr 1)启动子辐射诱导活性的影响及机制。方法　利用基因重组构建Egr 1启动子调控的荧光素酶报告质粒 ,脂质体介导转染肺癌A5 49细胞 ,在 0 .1%、0 .5 %、1%、2 .5 %、5 %等氧浓度下给转染细胞以 2、4、6、8、10Gyγ 线照射 ,观察照射后荧光素酶表达水平及过氧化氢产量变化 ;观察过氧化氢浓度对Egr 1启动子转录活性的影响。结果　成功构建了Egr 1启动子报告载体 ,转染A5 49细胞 ,发现当氧浓度 <2 .5 %时 ,Egr 1启动子活性明显低于常氧对照组 (P <0 .0 1) ,并随氧浓度的下降而降低。照射后的过氧化氢产量呈现类似的变化特征 ,结果还表明Egr 1启动子的活性与过氧化氢浓度密切相关。结论　缺氧 (O2 <2 .5 % )导致Egr 1启动子辐射诱导活性下降 ,可能与氧自由基产量减少有关。     

细胞周期素D2启动子曲古菌素A效应区域的研究

目的 研究在曲古菌素A(trichostatin A,TSA)处理条件下细胞周期素D2的调控机制.方法 细胞周期素D2的mRNA水平通过RT-PCR方法 检测.细胞周期素D2的启动子片段以A549细胞基因组DNA为模板,通过高保真PCR扩增获得,并克隆到pGL3-BASIC载体中;并以此为基础通过高保真PCR扩增出不同...     

稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究

目的 构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞系并分析其活性.方法 提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA,以其为模板,PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中,构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10,将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照,带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照),经G418进行稳定表达株的筛选,用1μmol/L维甲酸处理细胞4d后检测其荧光活性.结果 成功扩增到438 bp的adam10基因启动子,pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确.SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株,经检测具有较强的转录活性;1μmol/L雏甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达.结论 成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体,adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达,为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础.     

含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测

目的构建含有人肠三叶因子(intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性。方法采用PCR技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5kb的含hITF基因启动子片段(-2331/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293细胞并在48h后检测其荧光素酶活性。结果插入的hITF启动子片段测序结果显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.0032～0.0042之间,明确了最小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用。结论成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域。