乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3024bp的乳糖酶基因,利用生物软件分析,推测乳糖酶基因共编码1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4．9,氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征,为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的基因克隆及生物信息学分析

目的 构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp 16.3蛋白,并应用生物信息学软件,分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3(Hsp16.3)的多种蛋白质性质,以及获取该基因的相关信息.方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp 16.3基因,PET28a为载体,构建重组质粒PET28a-Hsp16.3并表达,利用Pmtparam、Protseale、HMMTOP、TMHMM、GOR4、ProtFun 等软件预测和分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3的氨基酸组成、理论等电点、结构域、活性位点、疏水性、跨膜区、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构及系统进化分析.结果 成功构建了Hsp16.3原核表达载体PET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达.推测结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3白分子式为C716H1131N197O225S4,分子量为16227.2,理论等电点为5.00.该蛋白氨基酸序列中含有α-螺旋(Alpha helix)46处,延伸链(Extended strand)25处,无规则卷曲(Random coil)73处及5个磷酸化位点;4个O-糖基化位点;1个前肽裂解预测位点.结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达;该蛋白推测是一个亲水性不稳定蛋白,无跨膜区,可能参与重要的能量代谢及免疫反应.     

尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析

目的:获得尘螨变应原Der f 2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Der f 2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-T simple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a( ),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Der f 2 cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87 bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Der f 2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.     

肝螺杆菌MCSTP的基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆肝螺杆菌(H.hepatieus)基基团接受趋化信号转导蛋白(MCSTP)全基因,并应用生物信息学方法对其进行分析.方法 以肝螺杆菌全基因组作为模板,设计肝螺杆菌MCSTP c1977特异性引物,利用PCR方法扩增目的 基因片段,连接至原核表达载体pET22b(+).从而构建原核表达质料pET22b+/MCSTP并测序鉴定.廊用牛物信息学方法分析MCSTP基囚的序列同源性及其结构特征.结果 克隆的MCSTP基因经测序可知与GenBank公布的肝螺杆菌标准株ATCC51449序列一致性达99%,仅第1 160 bp处由A变为T.利用生物信息学方法进行分析可发现此基因与空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌具有非常低的相似性,表明其在微生物界巾具有一定的特异性.结论 成功构建pET22b+/MCSTP重组质粒,并通过生物信息学技术进行序列及结构分析,为进一步研究其生物学功能及致病机制提供了线索和依据.     

一条人类砷相关新cDNA基因的克隆及生物信息学分析

目的 :探讨砷化物与基因的相互作用 ,克隆砷相关基因 ,利用生物信息学技术分析克隆基因。方法:采用 SMART方法构建 c DNA文库 ,杂交筛选并克隆基因 ,利用生物信息学手段对克隆基因进行结构和功能的分析。6 μm ol/ L Na As O2 处理人正常肝 L- 0 2细胞 2 h,抽提 RNA做基因芯片杂交。结果:成功克隆一条新基因 ,生物信息学分析发现在 7到 4 5 6碱基范围内有一个完整的 ORF,在编码起始区有典型的 Kozak序列 ,编码 14 9个氨基酸的蛋白质。核酸同源性比对发现与人类 1p36 .2 - 36 .3染色体 DNA序列同源性达 98% ,编码蛋白质同 Alu亚家族 SB序列同源性达 85 %。染砷细胞基因芯片杂交发现克隆基因表达增高。结论:克隆的人类砷相关基因 ,编码蛋白质与Alu亚家族 SB序列同源性高。     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

梅毒螺旋体Hsp40蛋白的生物信息学分析及基因克隆

目的分析梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Hsp40蛋白的生物学特性并克隆其基因。方法通过GenBank查到Hsp40蛋白的序列,利用生物信息学软件分析其生物学特性。根据Tp Hsp40基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增Hsp40基因,并把该DNA片段连接到pMD19-T载体,转化大肠杆菌后挑取阳性克隆采用PCR和DNA测序进行验证。结果 Tp Hsp40基因能够编码374个氨基酸的蛋白质,其分子量为40.1 k Da,无信号肽,呈亲水性。Swissmodel预测得到Tp Hsp40的三级结构与嗜热杆菌(Thermus thermophilus)Hsp40结构最接近。从Tp基因组中扩增得到1125 bp的Tp Hsp40基因并将其连接到pMD19-T载体。结论本文预测了梅毒螺旋体毒力因子Hsp40蛋白的结构和克隆得到Tp Hsp40基因。     

食管癌组织STRBP8基因克隆及其生物信息学分析

目的:克隆食管癌组织核基质蛋白类视网膜母细胞瘤结合蛋白8(STRBP8)CDS编码序列,为建立其免疫学检测技术奠定基础。方法:从GenBank中获取STRBP8的基因序列,并根据其CDS区序列设计全长引物。利用Trizol法从食管癌组织中提取总RNA,通过逆转录获取STRBP8的cDNA,再利用梯度升温PCR方法对目标基因进行扩增。结果:本实验成功从食管癌组织中克隆出STRBP8的CDS序列。结论:STRBP8在食管癌组织均存在表达,为下一步建立其免疫学检测技术打下基础。     

幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果 克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p. E381D、p. A409S、p. L556V和p. A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

两种提取液对黄粉虫抗菌肽提取效率的比较

目的:比较两种提取液对黄粉虫抗菌肽的提取效率及其抑菌活性。方法:用大肠杆菌DH-5α菌液(1×108/ml)腹部注射黄粉虫5龄幼虫,72 h后分别以两种提取液破碎全虫提取抗菌肽。提取液A为5%乙酸,提取液B为0.05mol/L乙酸铵缓冲液,pH 5.0、35μg/ml苯甲基磺酰氟、2‰巯基乙醇、0.2 mg/L EDTA、1 mg/ml苯基硫脲;两种提取液提取后分别测定未诱导和诱导抗菌肽浓度后,4样品均配制成80μg/ml的抗菌肽溶液,对大肠杆菌DH-5α进行体外抑菌实验。结果:两种提取液提取到的未诱导组间抗菌肽浓度分别为(114.48±10.95)μg/ml和(124.85±9.31)μg/ml,组间无统计学意义(P>0.05),诱导组间抗菌肽浓度分别为(436.98±11.62)μg/ml和(612.73±9.49)μg/ml,差异具有统计学意义(P<0.01);将上述两组抗菌肽溶液配制成相同浓度(80μg/ml)分别对大肠杆菌DH-5α体外抑菌试验,结果显示:未诱导组间抑菌作用具有统计学意义(P<0.05),诱导组间的抑菌作用亦具有统计学意义(P<0.01)。结论:提取液B提取到的抗菌肽不管在抗菌肽提取效率上,还是在抑菌效果方面均优于提取液A,从而为抗菌肽提取工艺的优化提供参考。     

冬虫夏草中虫草素相关基因的克隆及生物信息学分析

目的：虫草素是冬虫夏草和蛹虫草的有效成份之一,根据野生型虫草菌的虫草素相关基因片段,利用PCR技术在冬虫夏草中扩增获取相似基因片段。方法：根据已公开专利报道的野生型虫草菌的虫草素相关基因片段,设计引物在冬虫夏草DNA中PCR扩增目的序列,测序并用生物信息学分析相关片段。结果：在冬虫夏草的DNA中利用PCR扩增到一条613 bp虫草素相关基因片段,与NCBI基因数据库比对显示,与蛹虫草的中ATCC34164序列相似性达到96%。利用ORF Finder共查询到6个ORF片段,其中最大的为294 bp;利用ProtScale分析最大ORF序列翻译成的蛋白质,发现该翻译蛋白质为亲水性蛋白;利用TMpred预测到该翻译蛋白质存在2种跨膜模型,推荐相对膜的取向由内到外,N端处在膜外。结论：本研究为冬虫夏草中虫草素相关基因功能的后续研究提供了可靠基础数据。     

Role of remote sensing, geographic bioinformatics system and bioinformatics in kala-azar epidemiology

Visceral leishmaniasis or kala-azar is a potent parasitic infection causing death of thousands of people each year. Medicinal compounds currently available for the treatment of kala-azar have serious side effects and decreased efficacy owing to the emergence of resistant strains. The type of immune reaction is also to be considered in patients infected with Leishmania donovani (L. donovani). For complete eradication of this disease, a high level modern research is currently being applied both at the molecul...     

黄粉虫抗菌肽Tenecin基因的克隆、原核表达及其抑菌活性

目的为研究黄粉虫体内抗菌肽表达调控的分子机制,克隆黄粉虫抗菌肽Tenecin基因,并研究其原核表达产物的抑菌活性。方法用大肠杆菌DH-5α菌液(1×108/ml)腹部注射黄粉虫5龄幼虫,72 h后提取其总RNA,RT-PCR克隆Tenecin基因,测序并进行生物信息学分析;构建原核表达重组载体pET-28a(+)-Tenecin并转入大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导观察其表达情况;将4种不同浓度的原核表达产物Tenecin蛋白作用于大肠杆菌DH-5α,测量抑菌圈直径大小,观察其抑菌作用。结果电泳及测序结果显示:Tenecin基因的大小为255 bp左右;用1 mmol/L IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳检测在9 000附近有目的条带,与理论值大小相符;体外抑菌试验表明:试验设3个重复,浓度为80、60、40、20μg/ml的Tenecin蛋白与大肠杆菌DH-5α共培养18 h后,抑菌圈直径(mm)分别为25.1±0.03、20.7±0.06、17.2±0.11、9.3±0.04。结论成功克隆黄粉虫抗菌肽Tenecin基因,并成功表达Tenecin蛋白,该蛋白对大肠杆菌DH-5α有明显抑制作用,为后期临床应用奠定基础。     

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的　克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法　提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果　获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论　我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究 BPI生物学功能奠定了基础     

结核分枝杆菌higA基因的扩增及生物信息学分析

目的 对结核分枝杆菌的higA基因进行扩增,同时利用生物信息学方法分析其编码蛋白的结构和功能.方法 从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增higA基因,对扩增产物进行测序.利用生物信息学网站和软件分析higA蛋白的理化性质、信号肽、空间结构、抗原表位等.结果 higA基因扩增产物与预期一致,大小为450 bp.higA蛋白共149个氨基酸,理论等电点7.93,脂溶性系数94.30,不稳定系数36.57,预测该蛋白为稳定蛋白.higA蛋白无信号肽,含10个磷酸化位点和多个潜在的抗原表位.结论 成功扩增出结核分枝杆菌higA基因.     

miR-363靶基因预测及生物信息学分析

目的:初步明确hsa-miR-363潜在的生物学功能?方法:首先通过miRbase?UCSC等在线数据库对hsa-miR-363的碱基序列?基因位点及序列保守性进行分析;其次选择miranda?miRDB?PicTar及TargetScan四个在线数据库预测hsa-miR-363的靶基因并取交集,筛选后的靶基因用于后续分析;最后通过基因GO功能注释?富集分析和KEGG信号转导通路富集分析,初步阐明hsa-miR-363靶基因参与调控的细胞功能与信号通路?结果:根据生物信息学分析的结果显示,hsa-miR-363的功能较广泛,其多个潜在靶基因均参与子宫内膜异位症发生?发展过程中的多个生物学进程?结论:hsa-miR-363很可能与子宫内膜异位症的发病机制密切相关,并有可能为临床的靶向治疗提供潜在的新靶点?