大鼠胚胎神经干细胞分离培养及基因感染研究

目的建立基因工程化神经干细胞(neural stemcells,NSCs)以便为治疗感音神经性聋的研究创造条件。方法分离、培养胎鼠海马组织神经干细胞,并用巢蛋白(nestin)免疫荧光组织化学染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光组织化学染色鉴定分化细胞。通过细菌内同源重组方法构建携带有报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组腺病毒(Ad-GFP),并将其感染神经干细胞。结果①获得了大量未分化、呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代后仍具干细胞特性;②97%以上的神经干细胞能被腺病毒感染;③被腺病毒感染的神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞后仍可有效表达GFP报告基因。结论本实验成功构建了携带GFP基因的重组腺病毒。从胚鼠海马组织分离、培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞,经基因工程化及传代后,仍具干细胞特性,可以作为细胞移植治疗感音神经性聋试验研究的供体细胞。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养和鉴定及标记

目的:探索胚胎大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记的方法.方法:分离胚胎大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;5-溴脱氧尿嘧啶(BrDU)掺入试验,并用免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况.采用荧光染料Hoechest33342标记神经干细胞并诱导其分化,用神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞.结果:①获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养8代后仍具干细胞特性;②荧光染料的标记率可达97%,细胞传8代后荧光亮度无明显衰减,并且分化后的细胞核中仍有荧光表达.结论:成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及核多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞;荧光染料的标记可获得较高的标记率,可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞.     

脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞在受损耳蜗内的生存和分化

目的探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor gene,BDNF)基因转染的骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSC)在受损耳蜗内的生存和分化情况。方法将转染了BDNF基因并在体外诱导分化的BMSC(BDNF-BMSC)标记后,通过鼓阶注射植入阿米卡星致聋的豚鼠耳蜗内(BDNF-BMSC组,18只),并设注射未诱导分化的BMSC的豚鼠为对照组(BMSC组,18只)。在注射后1、2、4w取耳蜗组织石蜡切片,HE染色和荧光染色观察注射细胞的分布;神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protien,GFAP)抗体免疫组化染色观察注射细胞在耳蜗内的分化。结果 BDNF-BMSC和BMSC在耳蜗内均能成活并分布到一定的区域,鼓阶和前庭阶较多,中阶和蜗轴较少。NSE和GFAP免疫化学可见BDNF-BMSC部分细胞阳性染色,而BMSC阳性细胞较少。BDNF-BMSC在1、2w时平均光密度(AOD)值较高,在4w时显著下降(P<0.05);在各时间点,BDNF-BMSC组AOD值均显著高于BMSC组(P<0.01)。结论诱导分化前后的BMSC耳蜗移植后均能成活并分布到一定的区域,在耳蜗内BDNF-BMSC分化能力明显强于BMSC,但随时间延长分化能力下降。     

前庭学

20011707豚鼠一侧前庭损毁后前庭内侧核GFAP表达/吴子明…//第四军医大学学报一2001,22(6)一518~521 目的:观察左侧迷路切除后前庭内侧核(MVN)胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化。方法:左侧迷路切除后,不同存活时间行前庭内侧核GFAP二步法免疫组化染色。结果:一侧迷路切除(UL)后可诱导双侧MVN区星形胶质细胞GFAP免疫反应增强,且术侧大于未损侧,GFAP反应在术后10h已较正常对照增强,ZOh强于loh,此后4oh至ZOdGFAP反应处于下降趋势。结论:UL后可诱导MVN区胶质细胞GFAP免疫反应增强。初级前庭传入或中枢前庭神经元的静息放电降…     

大鼠内淋巴囊与肾脏集合管神经分布研究

目的从形态学上验证内淋巴囊上存在神经分布，并将这些神经纤维的分布与肾脏集合管的神经分布进行比较，为梅尼埃病的病因病理学研究及耳肾相关性研究提供新的思路。方法成年大鼠15只，经活体心脏灌注，取双侧颞骨和肾脏，常规石蜡包埋切片。利用免疫组织化学方法观察神经特异性烯醇化酶（neuronal specific enolase，NSE）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及神经微丝（neurofilament，NF）蛋白在内淋巴囊和肾脏集合管上的表达，通过图像分析仪对切片阳性染色的分布密度和灰度进行分析，比较二者神经纤维有无类似分布。结果光镜下NSE、GFAP、NF在内淋巴囊上皮及上皮下表达为棕黄色颗粒；肾脏集合管的主细胞胞膜、胞质有稳定、清晰的阳性染色反应，但在肾脏阳性染色并非表现为神经纤维染色，而更像是某种神经物质的染色。内淋巴囊和肾脏集合管在GFAP、NSE、NF的阳性表达上，只有NSE的分布密度差异有统计学意义（P〈0．05），其余指标在灰度和分布密度上差异无统计学意义（P值均〉0．05）。结论内淋巴囊近侧段、中间段和远侧段均有神经纤维分布，以中间段最为丰富；其分布与肾脏集合管上皮主细胞存在的神经染色在灰度和分布密度上并无差别。     

BRMS1基因蛋白在声门上型喉癌中的表达及临床意义

目的 探讨乳腺癌转移抑制基因（breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1）在声门上型喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法 免疫组化法检测60例原发性声门上型喉癌组织(肿瘤组)和其相邻的癌旁正常喉黏膜(对照组)石蜡标本组织细胞中BRMS1蛋白的表达。结果 对照组均有较强的BRMS1蛋白的表达,肿瘤组阳性表达率为35.0%(21/60),且均为低表达,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。BRMS1蛋白在病理高分化标本中阳性表达率为43.6%（17/39）,在中、低分化标本阳性表达率19.0%（4/21）,两者之间差异有统计学意义（P＜0.05）;在临床Ⅱ期标本阳性表达率为72.7%（8/11）,临床Ⅲ+ Ⅳ期标本阳性表达率26.5%（13/49）,两者之间差异有统计学意义（P＜0.05）;颈部淋巴结N0组标本阳性表达率72.7%（16/22）,颈部淋巴结N+组阳性率13.7%（5/38）,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。BRMS1蛋白阳性组患者与BRMS1蛋白阴性组患者的术后生存率无统计学差异(P＞0.05)。结论 BRMS1蛋白在声门上型喉癌中低表达或不表达,且其表达可能与声门上型喉癌的临床分期、病理分化以及颈部淋巴结转移有关。     

豚鼠胚胎神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的：从胚胎豚鼠端脑组织中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法：分离胚胎豚鼠端脑组织，用含碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达及细胞分化后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。采用荧光染料Hoechst33342标记神经干细胞。结果:从胚胎豚鼠端脑组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin和分化成神经元和神经胶质细胞；荧光染料的标记效率可达96．7％，细胞传代6次后荧光亮度仍无明显衰减。结论:从胚胎豚鼠端脑分离的细胞具有明显的增殖能力及多分化潜能，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

6种基因蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及意义

目的:探讨p15、p16、Rb、p27、p53及PCNA基因蛋白在不同分期、不同部位和不同分级的喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达和临床意义。方法:用免疫组织化学染色SP法对65例LSCC进行染色,30例正常黏膜为对照组,检测p15、p16、Rb、p27、p53及PCNA基因蛋白的表达,并进行统计学分析。结果:6种基因蛋白的表达在正常黏膜和LSCC中的差异有统计学意义(均P<0.01)。且p15和p27表达不仅和LSCC生长部位相关,而且和临床分期、分化程度相关。p16蛋白表达与LSCC的病理分级呈负相关,PCNA蛋白的表达与LSCC的病理分级呈正相关,两者的表达均与临床分期和肿瘤生长部位无关。而LSCC生长越晚期,Rb、p53蛋白的表达,前者呈下降,后者呈上升状态,且p53蛋白的表达和恶性程度呈正相关。结论:p15和p27基因表达的缺失是LSCC发生发展的重要过程,对两者的检测在LSCC的治疗和预后方面有一定意义。p16和PCNA反映肿瘤细胞的增殖状态,与肿瘤的发生有关,与肿瘤的发展过程无关。而Rb、p53基因表达多与肿瘤的发展过程相关。     

胚胎大鼠神经干细胞体外培养及分化为类毛细胞的研究

目的探讨体外培养和鉴定胚胎大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)及诱导其分化为类毛细胞。方法从SD系胚鼠大脑分离NSCs,在无血清培养基中培养,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导其分化为神经元和星形胶质细胞:将NSCs球放到含鼠尾胶原包被的盖玻片6孔培养板中培养,然后将乳鼠基底膜体外培养后汲取其上清液与NSCs一起培养,14～21天后通过免疫荧光和免疫组化法检测毛细胞标志物肌球蛋白(myosin)Ⅶa和钙视网膜蛋白(calretinin)。结果培养的NSCs胞体透亮,折光性好,分化后的细胞免疫组化示神经元特异性烯醇化酶、胶原纤维酸性蛋白、myosinⅦa和calretinin阳性。结论在无血清条件下能培养出活性很好的NSCs,并且能诱导其分化为神经元、星形胶质细胞和类毛细胞。     

脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞对豚鼠受损耳蜗螺旋神经节细胞的影响

目的 探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因转染的骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSC)对氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside antibiotics,AmAn)损伤的耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC)的保护作用.方法 采用兔抗鼠巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体免疫组化检测在体外转染了BDNF基因的BMSC(BDNF-BMSC)分化结果 .将BDNF-BMSC植入阿米卡星致聋豚鼠的耳蜗,并设单纯植入人工外淋巴组、BMSC植入组及BDNF基因植入组作为对照.分别在移植后1、2及4周取耳蜗组织,石蜡包埋切片,HE染色观察耳蜗病理改变、计算SGC密度;免疫组化染色计算相对吸光度值,比较各组对耳蜗SGC的保护作用.结果 转染后BDNF-BMSC的Nestin、NSE、GFAP阳性率均高于未转染的BMSC(P值均<0.01).耳蜗注射后在相同时间点各组间SGC密度和吸光度值差异均具有统计学意义(P值均<0.05),其中BDNF-BMSC组SGC密度最大、吸光度值最大;各组SGC密度和吸光度值在术后4周时比术后1周和2周时下降(P值均<0.05).结论 豚鼠耳蜗内移植BMSC、BDNF基因、BDNF-BMSC均可拮抗阿米卡星对SGC的损伤,其中BDNF-BMSC的保护作用最强.     

神经特异性烯醇化酶及嗅标记蛋白在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达

目的　探讨神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)及嗅标记蛋白 (olfactorymarkerprotein ,OMP)在不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。方法　以免疫组化方法检测NSE及OMP在1 2、1 6、2 0、2 4、2 8和 34周 6例不同胎龄胎儿嗅黏膜中的表达。结果　NSE免疫阳性反应在孕 1 2～ 34周的胎儿嗅黏膜中均有表达 ,各胎龄胎儿嗅黏膜切片中均可见大量阳性着色的双极嗅神经细胞。孕1 2周时 ,阳性细胞数量很多 ,排列紧密 ,胞体多位于嗅上皮中下部且阳性嗅神经上皮占据胎儿鼻腔上2 /3的黏膜 ,随着孕龄的增大 ,阳性细胞逐渐成多层次排列 ,所占鼻腔黏膜面积却逐渐减小 ,至孕 34周时 ,仅局限于鼻腔上 1 /3黏膜。OMP免疫反应在孕 1 2周胎儿鼻腔上 2 /3黏膜切片中仅发现少量阳性着色的双极神经细胞 ,明显少于同龄胎儿NSE阳性反应细胞。随着胎龄的增加 ,OMP阳性细胞逐渐增多 ,且胞体多位于嗅上皮中上部 ,但其数量仍相对少于同龄NSE阳性细胞。结论　人胚胎 1 2周时嗅黏膜中已有大量的嗅神经细胞 ,其中少数嗅神经细胞已开始发育成熟。随着胎龄的增大 ,嗅上皮面积逐渐缩小 ,但成熟的嗅神经细胞逐渐增多 ,胚胎发育后期的胎儿嗅化学感受器发育已趋于成熟     

Changes in glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in the rat facial nucleus following various types of nerve lesions

We report about changes on astrocytes in the facial nucleus of the rat following various types of peripheral nerve lesions. Astrocyte-specific glial fibrillary acidic protein (GFAP) was labeled by immunohistochemistry and served as a marker for these changes. Increased GFAP immunoreactivity was found in the facial nucleus on the lesioned side within 2–3 days after axotomy. This change lasted longer (up to 1 year) when axon regeneration was prevented or delayed by placing a metal clip on the proximal nerve stump. Lesion of the trigeminal nerve prior to axotomy reduced the degree of GFAP immunoreactivity. No side differences were observed after botulinum toxin application.     

大鼠嗅上皮神经干细胞的分离及培养

目的：从新生及成年大鼠嗅上皮分离培养嗅上皮神经干细胞（NSC）,研究其增殖及分化特性。方法：采用含10％胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培养液,分离、培养生后第3天和硫酸锌原位创伤后6d的成年大鼠嗅上皮NSC,应用间接免疫荧光染色鉴定培养的NSC及分化的特异性神经细胞类型,四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定嗅上皮NSC的生长曲线及生长因子的影响。结果：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮分离、培养出巢蛋白免疫反应阳性而细胞角蛋白免疫反应阴性,并能分化为神经元和星形胶质细胞的NSC。生后第3天和成年大鼠嗅上皮NSC生存能力的差异无统计学意义（P〉O．05）,细胞克隆形成率为0．05％～0．10％。碱性成纤维细胞生长因子可以显著促进嗅上皮NSC的增殖。结论：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮可培养出具有自我复制和多向分化潜能的NSC。     

面神经损伤后星形胶质细胞塑形活动的实验研究

目的 研究面神经损伤修复过程中面神经核内胶质塑形活动的变化。方法 大鼠面神经断伤吻合后1、7、21、60天时,观察面部运动情况,同时用神经逆行示踪结合免疫荧光组织化学的双重标记技术以及透射电镜技术,观察外周损伤后面神经核内胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达以及星形胶质细胞超微结构的塑形变化。结果 面神经再生修复后面部运动功能逐渐恢复,但难以完全恢复正常,且常伴有联带后遗症。荧光金逆行示踪标记出面神经核内面运动神经元有严格的躯体定位分布特征。正常状态下面神经核内GFAP表达强度极弱,术后7天时患侧表达强度显著增强,至再生修复晚期减弱,但仍高于健侧水平。超微结构观察显示,术后50天时塑形活化的星形胶质细胞形成板层状突起包裹隔绝面运动神经元。结论 本研究观察了外周损伤后面运动神经元周围星形胶质细胞塑形活动的一些规律性变化,其晚期塑形活动很可能与联带等后遗症的产生机制关系密切。     

大鼠嗅球神经干细胞培养

目的建立大鼠嗅球神经干细胞(neural stem cells，NSC)体外培养方法，研究其增殖和分化特性。方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养新生第1天和成年大鼠嗅球NSC，应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSC及自然分化为特异性神经细胞的类型，四甲基偶氮唑盐(MTY)法测定嗅球NSC的生长曲线。结果从生后第1天和成年大鼠嗅球分离、培养出表达巢蛋白(nestin)，并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSC。生后第1天和成年大鼠嗅球的神经球形成率分别为20％～30％和0．1％。嗅球NSC的增殖依赖表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor—basic，bFGF)，其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论从生后第1天和成年大鼠嗅球可以培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSC。     

Differential diagnosis of pleomorphic adenoma by immunohistochemical means.

Immunohistochemical study of major salivary gland tumours was performed on 60 pleomorphic adenomas, five basal cell adenomas and 10 adenoid cystic carcinomas to determine the diagnostic value of each antigen. Immunoreactivity examined were intermediate filaments (keratin, vimentin, desmin and glial fibrillary acidic protein [GFAP]) and related substances (actin, S-100 protein and secretory component). In pleomorphic adenomas, there was positive immunoreactivity for GFAP which was not observed in normal tissue or other neoplastic tissues. Immunoreactivity of GFAP was closely related to myxomatous and early chondromatous differentiation in pleomorphic adenoma. It is considered that GFAP immunoreactivity should be assessed in the occasional differential diagnostic dilemma of pleomorphic adenoma versus adenoid cystic carcinoma and basal cell adenoma, because of its ability to show potential and definite myxochondromatous differentiation.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究

目的 探讨并建立一种体外定向诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells ,hUC-MSCs)向内耳毛细胞样细胞分化的方法.方法 采用组织贴壁法培养获得hUC-MSCs,流式细胞仪鉴定其表面标记物;神经干细胞诱导阶段分为对照组(DFNB基础诱导培养基)、实验1组(DFNB基础诱导培养基+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)、实验2组(DFNB基础诱导培养基+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF+琼脂糖包被),培养3~5天后采用免疫荧光法检测各组标记蛋白Nestin的表达;内耳毛细胞样细胞诱导分化阶段,分为对照组(DFNB基础诱导培养基+明胶包被)、诱导组[DFNB基础诱导培养基+20 ng/ml EGF+1 μM全反式维甲酸/全反式维生素A酸(all trans retinoic aid,ATRA)],培养4周后采用qRT-PCR和免疫荧光法检测各组毛细胞标记物Math1、MyosinⅦa、Brn3c的表达.结果 在神经干细胞诱导阶段,对照组、实验1组均无神经球结构,实验2组中hUC-MSCs分化3 d后细胞有明显神经球样结构,且Nestin阳性细胞数更高(P<0.05);而向内耳毛细胞样诱导分化4周后,诱导组毛细胞标记物Math1、MyosinⅦa、Brn3c的mRNA和阳性细胞数的表达水平明显升高(P<0.05).结论 体外诱导人脐带间充质干细胞先向神经干细胞方向分化再向内耳毛细胞分化方向诱导,可有效提高毛细胞标记物MyosinⅦa、Brn3c、Math1的表达水平,促进hUC-MSCs向类毛细胞样细胞分化,可能为将来感音神经性聋的内耳移植治疗提供更为适合的种子细胞.