SARS流行期间高暴露医护人员SARS病毒抗体检测分析

目的探讨在2003年SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)流行期间,曾经参加救治SARS病例的医护人员(高暴露人群)SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体产生情况,为防范SARS提供指导意义。方法运用酶联免疫(ELISA)方法,同时检测95例SARS患者、313例高暴露人群和90例正常对照组血清SARS病毒抗体,包括IgM和IgG。结果95例临床确诊的SARS患者IgM抗体总阳性率为91.6%,IgG抗体总阳性率为97.9%,所有高暴露人群和正常对照组抗SARS-CoVIgM和抗SARS-CoVIgG均为阴性。结论对SARS流行期间不同人群SARS病毒血清抗体检测表明,313名医护人员和90名正常健康人中,未发现隐性感染者,SARS病毒抗体检测,可以为临床诊断、预防和流行病学调查等提供指导意义。     

SARS冠状病毒单克隆抗体制备及在肺尸检标本染色中的应用

目的制备抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,用于SARS的实验室诊断。方法灭活SARS冠状病毒(PUMC01)全病毒免疫BALB／C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)及免疫印迹法对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,并用其中一株(M2)杂交瘤诱生的腹水单克隆抗体对SARS患者尸检肺组织切片进行免疫组织化学染色。结果共筛选出6株杂交瘤细胞,ELISA及IFA法证实其分泌的单克隆抗体与SARS冠状病毒有特异性反应,与其他常见呼吸道病原体均无交叉反应。免疫双扩散方法鉴定1株杂交瘤细胞(M2)为免疫球蛋白IgG3型,其余5株均为IgG1型。免疫印迹试验显示1株杂交瘤细胞(M2)分泌的抗体与相对分子质量68000的蛋白有特异性反应;4株杂交瘤细胞分泌的抗体与相对分子质量27000的蛋白有特异性反应,1株在免疫印迹上未见到结果。SARS患者尸检肺组织病理切片免疫组织化学染色阳性,在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及巨噬细胞的胞浆均可见阳性颗粒。结论我们制备的6株单克隆抗体是抗SARS冠状病毒的特异性单克隆抗体,用于SARS尸检肺组织免疫组化染色,结果阳性。     

ELISA法检测SARS病毒特异性抗体

目的:研究SARS患者特异性抗体IgG、IgM动态变化规律,评价应用酶联免疫吸附试验(ELISA)在SARS诊断中的可靠性,为科学地防治SARS提供理论依据。方法:采用ELISA方法检测不同发病时间的临床确诊SARS病人234例420份血清,疑似病例127例和其他人群200例的血清SARS病毒抗体,并对45例SARS病人进行了长达1.5a的追踪。结果:在发病10d内抗体的阳性率较低,10d后阳性率较高;IgM的灵敏度是52.80%,特异性是99.40%,符合率78.82%。IgG的灵敏度是73.23%,特异性是98.10%,符合率87.15%。IFA法与ELISA法检测血清抗体的比较,IgM的符合率是68.60%,IgG的符合率是76.74%。对45例SARS患者追踪1.5a,SARS-IgG抗体的滴度仍维持较高的水平。结论:ELISA法适合于SARS发病10d后作为实验室辅助诊断方法。但对弱weak阳性的患者要注意追踪,排除假阳性。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

SARS患者血清特异性抗体的检测及临床诊断意义

目的 :评估临床诊断SARS患者血清特异性抗体产生规律对疾病诊断的意义。方法 :随机选取不同病程临床诊断为SARS的患者 15 6例 ,通过酶联免疫吸附的方法分别检测患者血清中特异性IgG型和IgM型抗体水平 ,分析SARS特异性抗体的产生与疾病病程的关系及对临床诊断的意义。结果 :血清IgG型抗体阳性 118例 ,阳性率为 75 .6 %。IgM型抗体阳性 6 5例 ,阳性率为 4 1.7%。IgG、IgM均为阴性 37例 ,占 2 3.7%。IgG型抗体产生阳性率随病程延长而逐渐增高 ,病程为 5 0～ 6 0d组阳性率最高达到了 94 .5 %。IgM型抗体阳性率也随病程延长而逐渐增高 ,但在病程 4 0～ 5 0d抗体阳性率即达最高 ,随后迅速下降。IgG与IgM抗体阳性率在其各自不同病程差异均十分显著 (P <0 .0 1)结论 :SARS患者血清特异性抗体检测可以作为SARS临床诊断的重要参考指标 ,但目前尚不宜作为诊断的金标准 ,SARS特异性IgG、IgM抗体同为阴性不能完全排除SARS诊断     

SARS病房工作的医护人员血清中特异抗体测定分析

目的检测密切接触SARS患者的医护人员血清中SARS病毒IgM及IgG抗体的水平,对SARS病毒有无隐性感染作初步调查.方法分别用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,ⅡFA)检测200例正常人,200例在SARS病房工作1个月的医护人员血清中SARS病毒IgM及IgG抗体的水平.结果正常人及医护人员血清中未检测到SARS病毒IgM及IgG抗体.结论不同于普通的流行性传染性疾病,SARS病毒可能不具有隐性感染性.     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

非SARS患儿体内SARS冠状病毒抗体的检测分析

目的 探讨非急性重症呼吸综合征(SARS)患儿体内是否存有SARS冠状病毒相关抗体。方法采用国家药品生物制品检定所正式检定通过的2种SARS抗体诊断试剂(间接免疫荧光检测试剂和双抗原夹心ELISA试剂)，对广州地区l060例非SARS患儿血清样本进行检测。结果 1060例非SARS患儿血清样本，间接免疫荧光法检测IgM、IgG均为阴性。双抗原夹心ELISA法检测也仅有2例出现弱阳性。结论 非SAILS患儿体内并未存在SAILS病毒相关抗体。     

严重急性呼吸综合征患者核壳蛋白和刺突蛋白S1区的特异性抗体研究

目的研究严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清中抗SAPS冠状病毒(SAPS-CoV)核壳蛋白(N)及刺突蛋白(S)S1区特异性抗体的产生规律,评价这两种蛋白在SAPS诊断研究中的作用。方法采用ELISA法检测86例确诊SAPS患者血清中针对N和S1蛋白IgG(N-IgG和S1一IgG),并与SAPS-CoV IgG水平进行比较。结果两种蛋白的特异性抗体的阳性率均随着病程的延长而增高。N-IgG在发病第1周检出阳性率为14％(6／44),第2周为56％(10／18),第3周达到100％(24／24);S1-IgG第1周检出阳性率为5％(2／44),第2周为39％(7／18),第3周阳性率达到83％(20／24)。两种蛋白抗体的检测结果分别与SAPS-CoV IgG结果比较,检测符合率分别为88％(76／86)和83％(71／86)。结合免疫印迹和ELISA两种方法检出正常人群SAPS-CoV N-IgG阳性率为1．88％(14／745)。结论SAPS-CoV N和S1重组蛋白对于SAPS诊断试剂的研究具有重要价值。     

SARS冠状病毒N蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS—CoV N基因,产生无感染性的核蛋白,作为诊断抗原,用于检测血清中SAILS特异性抗体。方法 从一例输入性SARS病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SAILS—CoV N基因,将它插入昆虫杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染sf 9昆虫细胞,经丙酮固定,制成SARS特异性诊断抗原,建立检测病人血清抗SARS-CoV抗体的免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)。结果 此抗原仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常人及其他发热病人血清不起反应。经双盲试验,与空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)阳性的2003年SAILS病人血清的符合率为97．8％;检测2004年广东新发4例SAILS病人进展期血清均阳性,发病后第6天即可检出抗体1：40阳性,至第9天,升至1：640.结论 此法用于检测病人血清中SARS抗体,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,不需P3实验室,为诊断与研究SAILS提供新的途径和手段。     

SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity

Objective To develop a specific SARS virus-targeted antibody preparation for emergent prophylaxis and treatment of SARS virus infection. Methods By using phage display technology, we constructed a naive antibody library from convalescent SARS patient lymphocytes. To obtain the neutralizing antibody to SARS virus surface proteins, the library panning procedure was performed on purified SARS virions and the specific Fab antibody clones were enriched by four rounds of repeated panning procedure and screened by highthroughput selection. The selected Fab antibodies expressed in the periplasma of E. coli were soluble and further purified and tested for their binding properties and antiviral function to SARS virus. The functional Fab antibodies were converted to full human IgG antibodies with recombinant baculovirus/insect cell systems and their neutralizing activities were further determined. Results After four rounds of the panning, a number of SARS-CoV virus-targeted human recombinant Fab antibodies were isolated from the SARS patient antibody library. Most of these were identified to recognize both natural and recombinant SARS spike （S） proteins, two Fab antibodies were specific for the virus membrane （M） protein, only one bound to SARS-CoV nucleocapsid protein. The SARS-CoV S and M protein-targeted Fab or IgG antibodies showed significant neutralizing activities in cytopathic effect （CPE） inhibition neutralization test, these antibodies were able to completely neutralize the SARS virus and protect the Vero cells from CPE after virus infection. However, the N protein-targeted Fab or IgG antibodies failed to neutralize the virus. In addition, the SARS N protein-targeted human Fab antibody reacted with the denatured N proteins, whereas none of the S and M protein specific neutralizing antibodies did. These results suggested that the S and M protein-specific neutralizing antibodies could recognize conformational epitopes which might be involved in the binding of virions to cellular receptors and the fusion activity of the virus Conclusion The SARS-CoV spike protein and membrane proteins are able to elicite efficient neutralizing antibodies in SARS patients. The neutralizing antibodies we generated in this study may be more promising candidates for prophylaxis and treatment of SARS infection.     

SARS病人SARS冠状病毒核壳抗原抗体的变化规律

OBJECTIVE: To assess serum antibody responses of patients with severe acute respiratory syndrome (SARS) to nucleocapsid (N) antigen of SARS-associated coronavirus. METHODS: The serum levels of IgM and IgG antibodies to N antigen were measured in 200 healthy blood donors and 13 SARS patients at different time points of acute and convalescent phases using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with N fusion proteins of SARS-associated coronaviruses. RESULTS: The IgM positive critical value of 0.233 and IgG of 0.239 were selected as the threshold value for positive results that equals the product of 2.1 and the mean IgM and IgG levels of 200 healthy blood donors. In 13 patients with SARS, the antibody responses to N antigen were not detectable in the first week after the onset of symptoms. The IgM and IgG seroprotection rates were 83.3% and 66.7% respectively in the second week, both reaching 100% at the third week. IgM seroprotection rates was 61.5% in the second month, and 38.5% at third month. The IgG peaked one month after the onset and remained at high levels in the following 2 months. CONCLUSION: The antibody responses suggest that N protein of SARS is immunodominant and plays an important role in viral pathogenesis. This ELISA-based test for detecting anti- N antigen may be of significant value for SARS diagnosis.     

恒河猴感染SARS-CoV的病毒学、血清学检测

目的对感染SARS-CoV的8只恒河猴进行病毒学、血清学指标检测。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐处死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。结果RT-PCR证实感染病毒检出时间为5~16d,8只猴中的5只分离到了病毒,感染15d后可检测到抗体。结论感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。     

非SARS患儿体内SARS冠状病毒抗体的检测分析

目的探讨非急性重症呼吸综合征(SARS)患儿体内是否存有SARS冠状病毒相关抗体。方法采用国家药品生物制品检定所正式检定通过的2种SARS抗体诊断试剂(间接免疫荧光检测试剂和双抗原夹心ELISA试剂),对广州地区1 060例非SARS患儿血清样本进行检测。结果1 060例非SARS患儿血清样本,间接免疫荧光法检测IgM、IgG均为阴性。双抗原夹心ELISA法检测也仅有2例出现弱阳性。结论非SARS患儿体内并未存在SARS病毒相关抗体。     

间接免疫荧光法检测麻疹抗原在麻疹早期诊断中的临床应用

目的:探讨间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence Assay,IEA)检测麻疹病毒抗原对儿童麻疹病毒(measles virus,MV)感染的早期诊断价值.方法:观察86例临床诊断麻疹的患儿,在发病的不同阶段IFA检测痰液MV抗原和酶联免疫吸附试验(engymelinked imgmunosorbent assay,ELISA)检测血清中MV特异性LgM抗体,采集30份上呼吸道感染患者痰液进行IFA麻疹病毒抗原检测,比较分析检测结果.结果:86例中发病7 d内IFA测抗原ELISA测抗体两种方法的阳性率为分别为97.1%和16.2%;7 d后为33.3%和88.9%,P均＜0.01.IFA测抗原阳性率与检测时间的相关系数为-0.91,P=0.02;ELISA测抗体阳性率与检测时间的相关系数为0.97,P=0.04.30份对照组的标本MV抗原检测均为阴性,IFA测抗原的特异性与敏感性分别是100%和97.1%.结论:IFA测抗原在疾病早期检出阳性率高,阳性检出率与检测时间成负相关,IFA测抗原痰液麻疹病毒抗原是一种早期快速、特异敏感的实验室检测方法.     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。     

SARS相关抗肺自身抗体产生机制的初步研究

目的:检测严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清中抗SARS病毒抗体与肺组织的反应性.方法:采用酶联免疫吸附法检测SARS患者恢复期血清中抗SARS病毒抗体,并采用肺组织与抗体共同孵育的方法,吸附抗SARS病毒抗体中同肺组织反应的SARS相关抗体.结果:与肺组织共同孵育后,抗SARS病毒抗体被部分中和,中和率为13.6％～32.2％.结论:部分抗SARS病毒抗体可以与肺组织反应,SARS病毒抗原同肺组织抗原有部分同源性.机体对SARS病毒抗原和肺组织的交叉免疫性可能是SARS相关抗肺自身抗体产生的原因.     

SARS病人SARS冠状病毒核壳抗原抗体的变化规律

目的通过监测SARS冠状病毒感染患者的抗体水平,阐明SARS冠状病毒感染机体免疫应答的机制并探讨血清学诊断的意义。方法采用基因重组SARS冠状病毒核壳抗原(N)建立间接ELISA法,检测健康人和SARS患者急性期和恢复期多点血清中特异性IgG和IgM抗体。以D450值=2.1×200例健康人血清中特异性IgG和IgM抗体均值作为抗体阳性判断的临界值。结果IgM和IgG的阳性临界值分别为0.233 和0.239。以此对13例SARS病人急性期和恢复期IgM和IgG抗体检测结果进行判断,结果发现:发病1周内,IgM和IgG抗体检测均为阴性;发病第2周,IgM和IgG检出阳性率分别为83.3%和66.7%;第3周均为100%;发病第2个月,IgM检出阳性率为61.5%,至第3个月,IgM检出阳性率为38.5%;IgG至第1个月时达到高峰,第3个月仍维持在高水平。结论机体产生针对SARS冠状病毒核壳抗原的抗体持续时间长,提示SARS冠状病毒核壳抗原具有强免疫原性,在SARS冠状病毒致病机制中可能起重要的作用、在SARS的血清学诊断方面具有重要的价值。     

间接法ELISA检测流行性出血热抗体

用间接法ELISA检测流行性出血热IgG抗体。54份EHF病人血清全部阳性,32份正常人、19份发热病人和18份误诊为EHF病人的血清全部阴性,与IFA检测结果相同。检测EHF病人系列血清,发病3d就可检出抗EHF IgG,抗体滴度随病程升高,表明间接法ELISA可用于EHF临床诊断。将间接法ELISA与IFA、RPHI和HI平行检测30份EHF病人血清,抗体几何平均滴度(GMT)分别为1:43 211、1:413、1:253和1:143,有高度相关性,且ELISA比RPHI和HI更能检测出早期抗体。检测疫区人群血清4134份,间接法ELISA检出490份阳性,而IFA仅检出470份。结果表明间接法ELISA有较好的敏感度和特异度,尤其适用于血清流行病学研究。     

三种特殊群体血清中SARS抗体检测分析

目的 了解新生儿、1～10岁儿童以及与SARS患者密切接触的医护人员血清中出现SARS病毒抗体的情况,并加以分析。方法 应用间接ELISA法,对15例新生儿、30例1～10岁儿童以及我院50例在SARS病房工作15天以上的医护人员的血清进行了SARS相关冠状病毒抗体IgM、IgG水平的检测。结果 15例新生儿以及50例医护人员中未检测到SARS抗体IgM、IgG,30例1～10岁儿童中,检测出3例SARS抗体IgG阳性,阳性率为10％,无一例SARS抗体IgM阳性。结论 我院一线医护人员中可能无SARS病者隐性感染者,儿童中SARS抗体IgG阳性率较高,这可能是此次SARS爆发中儿童感染率较低的原因之一。