bcl-2转基因表达载体的构建对脑缺血再灌注损伤保护机制的意义

目的：构建人Bcl-2基因的转基因表达载体用于转基因动物模型的建立，以便深入探讨脑缺血再灌注损伤中的基因机制。方法：利用RT-PCR技术，用包含bcl-2 cDNA的引物从慢性淋巴细胞白血病患的血液扩增得到一约为708bp的DNA片段，克隆后测序和同源性分析。结果：经RT-PCR扩增获得的产物大小与预计的目的片段大小一致，目的基因测序与国外报道的参考序列相比，序列同源性为99％。结论：以pEGF-C1载体作为真核表达载体，形成以绿色荧光蛋白作为报告基因的融合基因，可以用于转基因的研究。     

自噬相关基因Beclin-1的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆并构建自噬相关基因Beclin-1原核表达载体.方法 根据Beclin-1编码区DNA序列设计引物,用前列腺癌细胞LNCaP作为模板进行RT-PCR,扩增Beclin-1编码区全基因片段,与pQE-80质粒连接后进行测序鉴定.结果 RT-PCR扩增出Beclin-1目的基因,限制性内切酶证实其已插入表达质粒中,DNA测序证实Beclin-1编码区全基因片段与GenBank公布的相应基因核苷酸序列的同源性为完全一致.结论 成功克隆并构建了自噬相关基因Beclin-1原核表达载体,为研究Beclin-1蛋白的细胞自噬作用奠定了基础.     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆和鉴定

背景:dystrophin基因是人类常见的X染色体连锁隐性遗传的神经肌肉系统疾病,dystrophin基因缺失集中在两个热点区域即外显子2～20和44～53,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现.然而对dystrophin基因缺失的18个常见易缺失外显子片段的系统检测却鲜有报道.目的:拟对dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定.方法:以人类基因组DNA为模板,应用18对引物对dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增.将扩增产物与pGEM-TEasy载体连接,转化E.coli JM109感受态细胞.通过平板培养,挑选阳性克隆.提取重组质粒,Notl酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定.通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性.结果与结论:PCR扩增出18个片段,与dystrophin基因预期扩增片段大小相一致.重组克隆质粒的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致.经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的dystrophin基因片段具有极高的同源性.克隆产物确为dystrophin基因常见易缺失外显子片段.     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的 构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3，制备肿瘤DNA疫苗，为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法 从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA，进行RT-PCR扩增出全长cDNA，并克隆入PUCl9载体，经DNA测序证实序列无误后，将MAGE-3基因克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体。结果 经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段，成功克隆人PUCl9载体，经DNA测序证实为MAGE-3，编码MAGE-3基因全部947bp序列，读框正确，进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3．1／MAGE-3。结论 成功构建了MAGE-3真核表达质粒，为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础，对提供有效治疗方案，提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。     

重组人载脂蛋白A5原核表达载体的构建及分析鉴定

目的构建重组人载脂蛋白A5(apoA5)原核表达载体,为进一步制备抗apoA5的单/多克隆抗体奠定基础。方法从人肝癌组织中抽提总RNA,以此为模板,逆转录降度PCR扩增载脂蛋白A5编码区基因全长,构建含有目的片段的克隆载体pPCR-ScriptampSK(+)-apoA5及原核表达载体pET16B-apoA5,通过酶切、测序及诱导表达等验证重组质粒的准确性。结果PCR扩增出1.1kb特异性片段,克隆至pPCR-ScriptampSK(+)后测序,结果表明序列同源性与genebank报道一致,重组质粒pET16B-apoA5经双酶切后电泳显示约为5.7kb和1.1kb的片段,酶切图谱与预期一致,诱导表达蛋白的大小与预期一致。结论成功构建了重组人载脂蛋白A5的原核表达载体。     

RHD基因不同转录子表达载体的构建

RHD基因存在多种不同的另路剪接的转录子,本研究分别构建正常mRNA及DEL9和DEL89转录子的表达载体。从Rh(D)阳性新生儿脐血网织红细胞中提取总RNA,分别采用一步法和两步法RT-PCR获取完整目的转录子片段,然后分别克隆至pCR4 TOPO测序载体并测序验证和筛选。用正常RHD cDNA筛选质粒为模板,PCR扩增全长目的基因,然后亚克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO表达载体;DEL9和DEL89转录子直接克隆至表达载体,通过测序验证目的基因序列及插入方向。结果表明,序列分析证实了不同目的基因片段序列和方向正确,表明3种不同RHD转录子的表达载体构建成功。结论:RHD不同转录子表达载体已成功构建,为进一步研究Rh(D)抗原膜表达机理奠定了基础。     

组织因子途径抑制物2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人组织因子途径抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor2,TFPI-2)基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,并对其进行酶切鉴定。方法:实验于2006-09/12在安徽省立医院中心实验室完成。实验方法:①从人胎盘组织中提取总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增TFPI-2基因全长mRNA。②扩增产物回收纯化后用限制性内切酶酶切,与经同样处理的载体pEGFP-C1进行连接反应,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。③碱变性法提取质粒进行限制性内切酶酶切分析,并进行DNA序列测定。结果:①成功克隆了708bp的TFPI-2基因片段。②构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,经限制性内切酶酶切,电泳分析后得到了大小分别为708bp的目的基因片段和4.6kb的载体片段,测序结果与TFPI-2mRNA的cDNA序列吻合。结论:通过基因重组技术,构建了稳定表达TFPI-2的人TFPI-2的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。     

前癃通胶囊对人前列腺组织bcl-2、bax表达的影响

目的:检测前癃通对前列腺组织bcl-2、bax表达的影响。方法:(1)免疫组化法检测前癃通对体外培养BPH患者前列腺组织bcl-2、bax蛋白表达的影响。(2)RT-PCR法检测前癃通对体外培养BPH患者前列腺组织块细胞bcl-2mRNA、baxmRNA基因表达的影响。结果:前癃通高、中剂量组对前列腺组织bcl-2蛋白、bcl-2mRNA基因的表达有不同程度的抑制作用,对bax蛋白、baxmRNA基因的表达有不同程度的增强作用。结论:前癃通对前列腺组织能抑制bcl-2的基因表达,增强bax的基因表达,从而抑制前列腺增生。     

反义bcl-2—正义bcl-Xs逆转录病毒重组体的构建

构建一种反义抗细胞凋亡基因-正义促细胞凋亡基因相连结的新型表达质粒,以探讨其对细胞凋亡的影响。用分子克隆方法,成功地构建了反义bcl-2-正义bcl-Xs逆转录病毒重组体,初步结果显示此重组体比反义bcl-2或正义bcl-Xs逆转录病毒重组体具有更强的促细胞凋亡作用。该新型表达质粒的构建为探讨细胞凋亡提供了新工具,新思路。     

RT-PCR检测bcl-2在急性髓细胞白血病的表达及其临床意义

白血病是造血系统的恶性肿瘤,造血干细胞增殖失控及正常凋亡机制的受抑或丧失在白血病的发生中起重要作用。白血病患者对多种药物耐受是其临床化疗失败的主要原因,除多药耐药基因mdr等作用外,阻止肿瘤免于经凋亡而致死亡能力的降低与临床MDR有密切关系。bcl-2是调控细胞凋亡的重要基因,在血细胞的发育、成熟和衰亡中有重要意义,并且参与了肿瘤的发生、发展和衍变过程。为了评估bcl-2在急性髓细胞白血病(AML)中治疗预测的作用,探讨其在临床化疗耐受的作用,本文采用半定量RT-PCR方法检测20例AML患者表达水平。     

嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤后bcl-2、bax基因表达的影响

目的:探讨嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后脊髓组织bcl-2、bax基因表达的影响。方法:64只SD大鼠随机分成生理盐水组(A组)和嗅鞘细胞移植组(B组);采用AllenWD法致伤力损伤T8脊髓,B组术后即刻给予嗅鞘细胞局部注射,A组局部注射等量生理盐水。采用RT-PCR和免疫组织化学染色(SABC方法)分别检测SCI后基因bcl-2、bax的mRNA水平和蛋白表达变化。结果:B组bcl-2mRNA和蛋白较A组在各时间点的表达均明显升高,P<0.01;B组baxmRNA较A组在各时间点的表达均明显降低,P<0.01。结论:嗅鞘细胞移植可以促进脊髓损伤后bcl-2基因表达和蛋白产物的增加,抑制bax基因的表达和蛋白产物的增加,这可能是嗅鞘细胞移植对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。     

慢病毒表达双报告基因载体系统的构建及病毒制备

本研究旨在构建萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLUC)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双基因表达的慢病毒载体,并转染特定细胞系(HeLa),观察双基因的表达。采用PCR技术分别扩增FLUC和RFP报告基因,再将报告基因连接到慢病毒表达载体pLenti-Bi-cistronic中,获得具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-FLUC-RFP。然后,用脂质体将该慢病毒重组质粒转染293T细胞,收集纯化慢病毒颗粒。最后,测定病毒滴度,并用所获慢病毒感染HeLa细胞,采用荧光显微镜和荧光素酶报告基因检测试剂盒检测RFP和FLUC的表达。结果表明,酶切和测序证明RFP和FLUC基因成功连入目的载体,所构建的pLenti-FLUC-RFP慢病毒重组质粒序列符合预期。经纯化获得的慢病毒滴度为1×107TU/ml。将pLenti-FLUC-RFP转染HeLa细胞系后,在荧光显微镜下可见大量细胞表达RFP,荧光发光检测仪也检测到转染细胞具有较高的荧光素酶活性。结论:本研究成功构建了具有双报告基因的慢病毒重组质粒pLenti-Ⅲ-FLUC-RFP,经纯化获得了高滴度的慢病毒颗粒,该病毒颗粒具有很好的感染活性,为研究间充质干细胞在体内的动态分布奠定了基础。     

股骨头骨骺缺血性坏死模型兔构建及组织病理学变化和p53与bcl-2的表达

背景:研究表明儿童股骨头骨骺缺血性坏死(Perthes病)的发病与儿童股骨头血液供应、髋关节周围病变、外伤、内分泌因素、遗传等多种原因有关。目的:建立可靠的Perthes病的动物模型,并观察其股骨头组织学变化、细胞凋亡情况及p53和bcl-2基因的表达,并探讨凋亡基因p53和bcl-2与Perthes病的的相关性。方法:采用C型臂透视下经右侧股骨颈注射TH胶致骺板缺血,建立幼兔Perthes病模型,并以同样方法用经右侧股骨颈给予注射生理盐水的兔作对照,于建模后4,6,8,10,12周分别取模型组和对照组两组右侧股骨头做病理切片,观察两组髋关节骺板细胞凋亡情况,并观察两组右侧股骨头p53和bcl-2等凋亡基因表达阳性率的变化。结果与结论:建模后4周开始出现模型组右侧髋关节关节间隙增宽,出现点状出血变性区并逐步扩大,随后关节软骨与骨骺的黏附强度下降,骨质松脆,干骺端疏松变软。模型组右侧股骨头骺板细胞凋亡率与p53基因表达阳性率呈明显正相关性(r=0.68,P<0.05),与bcl-2基因表达阳性率之间呈明显负相关性(r=-0.75,P<0.01)。实验建立的perthes病动物模型稳定,简单,无反复现象。结果证实了Perthes病的发生与p53和bcl-2凋亡基因相关。     

5-氮杂脱氧胞苷对白血病细胞生长作用及相关基因表达的影响

目的　探讨甲基化抑制剂 5 氮杂脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine,5 aza CdR)去甲基化治疗白血病的作用机制。方法　采用MTT实验、硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验和DNA凝胶电泳的方法 ,观察 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞增殖、分化和凋亡的影响 ;通过RT PCR和甲基化特异性PCR方法检测DNA甲基转移酶 (DNMT)、p15、p5 3、bcl 2基因表达变化和p15基因的甲基化状态。结果　 5 aza CdR对HL 6 0、K5 6 2细胞和白血病原代细胞的生长抑制有明显的剂量依赖性和时间依赖性。 0 .5 μmol/L 5 aza CdR对HL 6 0细胞有较明显的促分化作用。不同浓度 5 aza CdR处理细胞后 ,有不同程度的p15、p5 3mRNA表达上调和bcl 2mRNA表达下调 ,DNMTmRNA表达水平在处理前后无明显变化。在原代白血病细胞中 ,p15基因甲基化程度随着 5 aza CdR浓度的增加逐渐减低。结论　 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞的增殖均有明显的抑制作用 ,其作用机制可能与p15、p5 3基因的上调以及bcl 2基因的下调有关 ,p15 INK4B基因甲基化程度的降低 ,主要与 5 aza CdR的竞争性抑制有关 ,而不是由DNMT基因的下调所致     

逆转录病毒介导的反义bcl—2序列促进足叶乙甙诱导的白血病？…

探讨逆转录病毒介导的反义ｂｃｌ－２序列对细胞凋亡的诱导作用,方法：ＰＡ３１７细胞包装逆转录病毒,病毒转导Ｊｕｒｋａｔ细胞后用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ及蛋白表达水平;用流式细胞仪计数及ＤＮＡ电泳检测细胞凋亡。     

CagA+幽门螺杆菌与胃黏膜上皮细胞凋亡的分子研究

目的：观察CagA^ Hp对胃黏膜上皮细胞凋亡的影响，进而探讨CagA^ Hp增加胃癌发生危险性的机制。方法：以TUNEL染色法研究30例CagA^ Hp阳性患者Hp根除前后胃黏膜上皮细胞凋亡的情况；通过免疫组织化学法和RT－PCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果：CagA^ Hp阳性患者胃黏膜上皮细胞凋亡指数为13．42％，Hp根除后，胃黏膜上皮细胞凋亡指数降为4．8％，较治疗前明显减少（P＜0．01），而CagA^ Hp仍为阳性患者胃黏膜上皮细胞凋亡指数无明显减少（P＞0．05）；bcl-2蛋白表达阳性的CagA^ Hp阳性患者Hp根除后，胃黏膜上皮细胞bcl-2蛋白表达阳性明显增多（P＜0．01），且胃黏膜上皮细胞bcl-2的mRNA表达明显增强（P＜0．01），而CagA^ Hp仍为阳性患者胃黏膜上皮细胞bcl-2蛋白表达和mRNA表达无明显增强（P＞0．05）；bax蛋白表达阳性的CagA^ Hp阳性患者Hp根除后，胃黏膜上皮细胞bax蛋白表达阳性明显减少（P＜0．01），且胃黏膜上皮细胞bax的mRNA表达明显减少（P＜0．01）；而CagA^ Hp仍为阳性患者胃黏膜上皮细胞bax蛋白表达和mRNA表达无明显减少（P＞0．05）。结论：诱导胃黏膜上皮细胞凋亡是CagA^ Hp参与胃癌发生的机制之一，CagA^ Hp通过下调bcl-2的表达、促进bax的表达诱导胃黏膜上皮细胞凋亡。