pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

人SCG10基因原核质粒构建及其重组蛋白表达

目的 构建SCG10的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达.方法 pcDNA3.1-SCG10质粒用BamHI和XhoI双酶切后,克隆至pGEX-5X-1栽体,IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在BL21大肠杆茵中诱导glutathione S-transferase(GST)-SCG10 融合蛋白表达,利用GST-beads纯化诱导的融合蛋白,经Western blot印迹鉴定.结果 SCG10全长编码序列克隆至pGEX-5x-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在BL21大肠杆茵中IPTG诱导融合蛋白的表达分子量为47 kDa,成功纯化出GST及GST-SCGl0蛋白,Wstem blot检测到蛋白表达.结论 构建了SCG10基因原核表达载体,鉴定了GST-SCG10融合蛋白表达.     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

目的：构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6 为模板,PCR扩增出 PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达, 采用Western blotting 法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000 bp）和PAK6 1-55(165 bp)、PAK6 56-210(465 bp)、PAK6 211-410（600 bp）及PAK6 385-681（891 bp） 4个片段。Western blotting检测, PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。     

野生型和失活型PAK1基因自我抑制域的GST标签真核表达载体的构建及表达

目的：构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1 AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义。方法：以pcDNA3.1HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT)PAK1 AID片段,再以此片段为模板采用大引物法扩增其突变体L107F片段,双酶切克隆至GST融合的真核表达载体pEBG。将质粒转染至工具细胞HEK293中,并经免疫印迹鉴定GST融合蛋白的表达。结果：PCR扩增出约200 bp大小的野生型和失活型PAK1 AID片段,双酶切得到与预期大小相符的载体与PAK1 AID片段,野生型与失活型pEBG-PAK1在工具细胞HEK293中表达,蛋白的相对分子质量均为33 000。结论：成功构建野生型和失活型PAK1基因 AID的GST标签真核表达载体,并表达出不同活性的GST-PAK1 AID的融合蛋白。     

GST/RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1.RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coil DH5а,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.eoli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达.鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达.结论 成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础.     

小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化

目的获取小鼠CD36基因片段,并高效表达和纯化GST-CD36融合蛋白。方法设计合成CD36的基因功能片段,测序后,通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果获得小鼠CD36基因片段,测序结果与GenBank的基因序列一致,重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量28.5kDa处,出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论合成小鼠CD36基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST-CD36融合蛋白。     

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的 原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白.结果 重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功.导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符.该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白.结论 构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础.     

C/EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究

目的 构建GST-C/EBPa融合蛋白表达载体,并在大肠埃希茵(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1-C/EBPa为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化E-coliDH5α筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPa全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了C/EBPa原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPa蛋白和研究C/EBPa的生物学功能奠定了基础.     

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的 构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定.方法 应用PCR方法扩增EGFRvⅢECD片段,将其T-A克隆和测序.再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达.采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达.重组融合蛋白GST-vⅢ ECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上.Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究.     

MEKK3蛋白激酶的研究进展

 有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3,MEKK3）是MAP3K（mitogen-activated protein kinase kinase kinase）家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它在哺乳类动物的各种组织中广泛表达。该蛋白激酶能够有效激活有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和NF-κB信号通路,与多种肿瘤的发生与发展密切相关。本文将从其结构、蛋白磷酸化、信号传导、免疫调节及与肿瘤的关系等方面对MEKK3的研究进行相关综述。     

哺乳动物的促分裂原活化蛋白激酶信号途径

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类表达于所有真核细胞的丝氨酸／苏氨酸激酶，能够被诸如细胞因子、生长因子、神经递质、激素、细胞应急以及细胞粘附等各种刺激因素激活。MAPK途径的基本组合包括MAPK、MAPK激酶(MKK)和MAPK激酶激酶(MKKK)三种保守的成分，由此建立一个连续的激活途径。哺乳动物的MAPK可以大致归纳为5类：ERK1／2(MAPK^erkl/2)、P38(MAPK^p38)、JNK(MAPK^jnk)、ERK3／4(MAPK^erk34)和ERK5(MAPK^erk5)。MAPK家族在各种细胞活动中具有重要作用，如增殖、分化、发育、转化及凋亡等。文章讨论了哺乳动物MAPK的功能和调节。     

B-Raf激酶抑制剂的研究进展

原癌基因B-Raf存在于多种肿瘤细胞中,尤其在黑色素瘤和甲状腺癌中。选择性B-Raf激酶抑制剂vemurafenib的上市引起了人们对此类抑制剂的广泛关注。通过分析vemurafenib与B-Raf激酶的结合模式,人们对B-Raf激酶抑制剂提出了新的分类。依据此分类,本文对蛋白质晶体数据库(PDB)出现的B-Raf激酶抑制剂进行了分析,比较每种类型抑制剂的作用模式,分析其构效关系,并对Raf激酶抑制剂的未来进行了展望。     

血清肌酸激酶同工酶MM（CK—MM）亚带动态测定诊断急性心肌梗塞

本文观察了12例急性心肌梗塞(AMI)患者血清CK,CK-MB,CK-MM及亚带的动态变化。结果表明:血清CK-MM亚带MM_3/MM_1比值在梗塞发生后2h内即出现异常(P<0.05),平均3.5h开始升高,幅度为基础值的9—33倍,约10h达峰值,早于CK和CK-MB。血清MM_3峰值与CK,CK-MB和CK-MM峰值及相应累积释放(∫_0~Tf(t)·d_t)均呈显著正相关(P<0.01)。另外还比较了各同I酶Ka和Kd值大小,表明MM_3和CK-MB最大,MM_1最小。这提示血清CK-MM亚带MM_3/MM_1比值是AMI早期诊断的最敏感指标,动态测定CK-MM亚带亦有助于估计AMI的预后和了解心肌酶的释放情况。     

肌钙蛋白对病毒性脑炎合并心肌炎患儿的诊断价值

目的探讨病毒性脑炎时血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）对心肌损伤的诊断价值。方法对2005年8月～2008年12月64例病毒性脑炎患儿与对照组为同期入住非脑炎其他疾病抽搐患儿22例,分别于入院后第1、2天采集静脉血测定血清cTnI、CK、CK-MB,并进行分析。结果在研究中发现cTnI对病毒性脑炎合并心肌损伤有较高的敏感性,且比CK-MB及CK更具有特异性,是治疗和判断预后的指标之一。结论病毒性脑炎患儿心肌损伤与脑损伤密切相关,即脑损伤越重,心肌损伤也越重,外周血cTnI的检测能早期诊断心肌损伤,从而可以早期干预治疗,改善预后。     

蛋白激酶CK2B的相互作用蛋白筛选

目的研究与蛋白激酶CK2B发生相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交系统,以人蛋白激酶CK2B为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,利用生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交等提供的信息,筛除假阳性。结果经过酵母双杂交共获得211个克隆,经过验证分析,最终确定12个相互作用蛋白,其中3个是已知的,9个是新发现的相互作用。结论获得的9个新的相互作用蛋白可能揭示CK2新的作用机制。     

精氨酸血管加压素抗失血性休克作用及其与Rho kinase的关系

目的 观察精氨酸血管加压素(arginine vasopressin,AVP)抗失血性休克作用与Rho kinase的关系.方法 采用大鼠失血性休克模型,整体动物观察AVP对失血性休克大鼠去甲肾上腺素(NE)的升压反应和对肠系膜上动脉收缩反应性的影响,同时观察Rho kinase在其中的作用;离体血管环观察AVP对失血性休克大鼠肠系膜上动脉反应性和钙敏感性的影响,并观察Rho kinase在其中的作用.结果 失血性休克后大鼠对NE的升压反应性和肠系膜动脉对NE的收缩反应性明显降低,AVP0.4 U/kg可明显增加休克大鼠NE升压反应和肠系膜动脉的收缩反应性,Rho kinase特异性抑制剂Y-27632可明显拮抗由AVP引起的休克大鼠血管反应性的增加.在离体血管环研究表明,休克后血管反应性和钙敏感性明显降低,AVP在浓度为5 nmol/L和0.5 nmol/L可明显增加休克后血管反应性和钙敏感性,Y-27632可明显拈抗由AVP引起的血管反应性和钙敏感性的增加.结论 AVP可通过增加休克血管平滑肌细胞的钙敏感性和血管反应性发挥抗休克作用,通过激活Rho kinase发挥其抗休克作用.     

两种酪氨酸激酶抑制剂对结肠癌细胞增殖的影响

目的:研究两种酪氨酸激酶抑制剂对体外培养的HT-29结肠癌细胞生长的影响及可能机制.方法:用MTT比色法观察不同浓度的Genistein及Tyrphostin AG1478对体外培养的结肠癌细胞生长的影响;免疫细胞化学法检测两种酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)对肿瘤细胞PCNA表达的影响;Western blot技术分析Genistein及Tyrphostin AG1478对结肠癌细胞ERK-1及pERK表达的影响.结果:不同浓度的Genistein及Tyrphostin AG1478对HT-29结肠癌细胞的增殖均具有抑制作用,并具有良好的量-效关系.免疫细胞化学检测表明,Genistein及Tyrphostin AG1478明显下调HT-29细胞PCNA表达.蛋白质印迹检测发现,两种酪氨酸激酶抑制剂不抑制ERK表达,但能够抑制ERK磷酸化.结论:酪氨酸激酶抑制剂Genistein及Tyrphostin AG1478能有效抑制HT-29结肠癌细胞生长,其作用机制与抑制肿瘤细胞ERK表达及磷酸化有关.     

淫羊藿苷介导MAPK信号通路促进间充质干细胞株C3H10T1／2成骨分化的体外研究

目的：探索补肾中药淫羊藿有效成分淫羊藿苷对间充质干细胞株C3H10T1／2的促成骨分化作用,及该作用与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的相关性。方法：体外培养间充质干细胞株C3H10T1／2,给予淫羊藿苷（0、10^-7、10^-6、10^-5和10^-4mol／L）联合成骨诱导液干预26d后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色观察成骨分化情况。10^-5mol／L淫羊藿苷干预C3H10T1／2细胞2、8、24与48h后,实时荧光定量聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction,PCR）检测p38、细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,p42／44）mRNA的表达。10^-5mol／L淫羊藿苷干预C3H10T1／2细胞10、30、60和120min后,蛋白质印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated proteinkinase,p38）、p42和p44,以及翼式转录因子氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及其磷酸化产物的蛋白表达情况。结果：10^-5mol／L淫羊藿苷联合成骨诱导液的促进C3H10T1／2细胞成骨分化能力最强。PCR结果显示,淫羊藿苷作用2h后p38基因表达显著下调（P〈0．01）;p42和p44mRNA水平在淫羊藿苷干预2h后均显著下调（P〈0．01）,而在淫羊藿苷干预48h后表达均上调（P〈0．05,P〈0．01）;其他时间点各通路基因表达情况均无显著变化（P〉0．05）。10^-5mol／L淫羊藿苷作用10min后,磷酸化p42／44蛋白表达减弱,磷酸化p38蛋白表达增强,并持续到30min,但对JNK蛋白的表达无明显影响。结论：淫羊藿苷促进间充质干细胞株C3H10T1／2向成骨细胞分化,其作用可能与激活p38和抑制ERK蛋白的表达有关。     

bFGF对NIH3T3细胞TPK,PKC,ERK活性的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NIH3T3细胞酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)及胞外调节蛋白激酶(ERK)活性的影响,探讨其信号转导机制.方法:分别加入bFGF及PKC抑制剂H-7、MEK1抑制剂PD98059孵育细胞,利用[γ-32P]ATP掺入外源性底物的方法测定活性.结果:bFGF可使细胞膜TPK、细胞质PKC及ERK活性明显升高.H-7 bFGF、PD98059 bFGF组与只加bFGF组比较TPK活性保持不变,而PKC及ERK活性均下降.结论:TPK、PKC、ERK介导bFGF的信号转导.ERK与PKC是TPK受体下游的两个分支,PKC与ERK可以互相激活.