XAF1基因对胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响

目的探讨Ad5／F35腺病毒介导的X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（XAFl）基因对胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响。方法构建和包装Ad5／F35-XAF1重组腺病毒并感染胰腺癌细胞SW1990（Ad5／F35-XAF1组）,设立对照病毒感染组（Ad5／F35-Null组）和空白组。运用RT—PCR技术和Western blotting分析对感染细胞进行鉴定。流式细胞仪检测细胞凋亡并分析细胞周期,TUNEL法测定细胞凋亡率;MTT法检测细胞增殖。结果Ad5／F35-XAF1组SW1990细胞XAF1mRNA和蛋白表达水平均明显上调。与空白对照组和Ad5／F35-Null组比较,Ad5／F35-XAF1组细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低,G2／M期细胞比例显著增加,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论Ad5F35-XAF1重组腺病毒感染胰腺癌细胞SW1990后,能促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。     

胰腺癌组织中XAF1基因启动子区甲基化状态及XAF1蛋白的表达

目的:探讨胰腺癌组织中X染色体连锁凋亡抑制因子相关因子1(XAF1)基因启动子区甲基化状态及蛋白的表达。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)及免疫组化SP法检测胰腺癌组织(48例)、胰腺良性疾病组织(26例)和正常胰腺组织(15例)中XAF1基因启动子区甲基化状态及蛋白的表达。结果:胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺组织中,XAF1基因启动子区甲基化率分别为31.3%、7.7%和0%,XAF1蛋白的阳性表达率分别为52.1%、84.6%及88.9%,3组比较差异均有统计学意义(P=0.005;χ2=11.169,P=0.004)。XAF1基因启动子区甲基化状态及蛋白的表达均与胰腺癌的TNM分期、分化程度及淋巴结转移关系密切(P<0.05)。胰腺癌组织中XAF1基因启动子区甲基化状态与蛋白表达呈负关联(rP=-0.463,P<0.001)。结论:XAF1基因启动子区甲基化是该基因失活的重要机制之一,XAF1甲基化修饰水平在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。     

siRNA沉默EPAS1基因对胰腺癌细胞凋亡和增殖的影响

目的 研究由2型重组腺相关病毒(rAAV2)介导的靶向缺氧诱导因子2(EPAS1/HIF-2)的小干扰RNA(siR-NA)对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡和增殖的影响.方法 将人胰腺癌细胞株PANC-1分为实验组、阴性对照组(阴性组)和空白对照组(空白组),实验组和阴性组分别转染rAAV2-EPAS1-siRNA和rAAV2-EGFP病毒,空白组不转染病毒,进行常氧和缺氧培养.RT-PCR和Western blot检测EPAS1基因表达,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力.结果 在常氧和缺氧状态下,实验组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达受抑制,显著低于阴性组和空白组,差异均有高度统计学意义(p<0.001).在缺氧状态下,实验组细胞的凋亡率明显升高,增殖受抑制,与阴性组和空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 通过siRNA抑制缺氧状态下胰腺癌细胞中EPAS1基因表达,能诱导胰腺癌细胞凋亡,抑制胰腺癌细胞增殖.     

胰腺癌细胞凋亡相关基因的研究进展

细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡方式,参与肿瘤的发生发展,在胰腺癌组织中,多种基因参与了胰腺癌细胞的凋主恨过程.随着其机制的进一步阐明,从基因水平上诱导细胞凋亡有望成为综合治疗胰腺癌的一个重要内容.     

TGF-β1对胰腺癌细胞BxPC-3增殖的影响及机制

目的观察不同浓度梯度及不同时间梯度下外源性TGF-β1对胰腺癌细胞株BxPC-3增殖的影响,并探讨其可能的机制。方法以正常培养的BxPC-3细胞为空白对照,分别采用1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ng/mL的TGF-β1干预BxPC-3细胞4d。MTT法观察各组胰腺癌细胞的生长情况,并计算肿瘤生长抑制率。同时以正常培养的BxPC-3细胞为对照组,以2.0ng/mL的TGF-β1分别干预BxPC-3细胞1～7d,MTT法绘制两组细胞生长曲线。另外,以2.0ng/mL的TGF-β1干预培养至第4天时分别采集两组细胞,用FCM检测细胞周期,Western blot方法检测细胞周期蛋白CyclinD1的表达。结果与空白对照组相比,TGF-β1干预组BxPC-3增殖受抑,并呈时间及浓度依赖。2.0ng/mL的TGF-β1干预组的最大生长抑制率为12.5%,出现在第4天;细胞周期阻滞在G1/S期;CyclinD1的蛋白表达也明显下调。结论外源性TGF-β1可轻度抑制Smad4纯合子缺失的BxPC-3胰腺癌细胞的生长,机制与细胞周期G/S阻滞及Cyclin D1下调有关。     

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

5-Aza-CdR对人肝癌细胞株SMMC7721生长及XAF1基因启动子异常甲基化的影响

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC7721生长的影响以及对具有促凋亡作用的X染色体连锁凋亡抑制因子相关因子1(XAF1)的基因表达和甲基化的影响.方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞后,RT-PCR法检测XAF1 mRNA的变化,MSP检测XAF1基因甲基化的变化,用MTT法检测5-Aza-CdR对SMMC7721细胞增殖活性的影响,流式细胞仪检测其对SMMC7721细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率的影响.结果 经过5、10μmol/L 5-Aza-CdR处理后,RT-PCR检测显示,SMMC7721中XAF1mRNA表达比对照组增加,差异有统计学意义(分别是P=0.034,P=0.002).MSP检测结果XAF1的甲基化得到了逆转.用1、5、10μmol/L的5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞24、48、72 h后,MTT检测到细胞的生长受到抑制,且呈时间和剂量依赖性.流式细胞仪分析表明,各药物浓度处理72 h后凋亡率均明显增加,5、10μmol/L组细胞凋亡率分别为(7.23±0.92)%、(12.62±1.30)%,与对照组(3.53±0.40)%相比差异有统计学意义(分别是P=0.013,P=0.001).其细胞周期阻滞于S期.结论 5-Aza-CdR抑制SMMC7721细胞的生长,使XAF1基因异常甲基化状态得到逆转,XAF1基因转录水平上调,为其应用于肝癌治疗提供了实验依据.     

X射线对胰腺癌细胞株SW1990和Capan-2细胞增殖及凋亡的影响

目的探究不同剂量的x射线对胰腺癌细胞株SW1990和Capan-2增殖和凋亡的影响。方法取处于对数生长期的SW1990和Capan-2细胞,经不同剂量的x射线（2、4、6、8和10Gy）照射后分别培养24、48和72h.CCK培法检测细胞增殖;采用AnnexinV／PI双染的方法检测SW1990和Capan-2细胞的凋亡;Westernblotting检测细胞凋亡相关蚩白的表达变化;RT—PCR检测细胞凋亡相关蛋白的mRNA表达。结果相比正常对照组,x射线能明显抑制SW1990和Capan-2细胞的增殖,井且这种,抑制作用呈剂量依赖性。细胞凋亡率在x射线的作用下也明显增加,并呈现剂量依赖性。Westernblotting结果显示x射线能增加两种细胞中促凋亡蛋白Bax的表达。RT-PCR结果显示x射线能降低抗凋亡蛋白Bel-2mRNA表达,上凋抗凋亡蛋白Bax mRNA表达。结论x射线能抑制胰腺癌细胞株SW1990和Capan-2的增殖并提高其凋亡率,呈现一定的剂量依赖性,其机制可能与诱导胰腺癌细胞凋亡有关。     

鞘鞍醇激酶-1对胰腺癌SW1990细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响.方法 培养的胰腺癌SW1990细胞株,实验分为DMS组、PMA组和对照组,各组细胞接种于孔板中,每组设3个复孔,每个实验至少重复3次.DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS,50μmol/L),PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100 nmol/L),对照组按常规培养,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达,Western blot检测SPK1蛋白的表达.结果 PMA组细胞的增殖活力[OD值:(1.37±0.03),细胞克隆数目:(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01),细胞克隆数目:(215.34±12.23)]显著增加,DMS组细胞的增殖活力[OD值:(0.65±0.02),细胞克隆数目:(130.56±15.6)]较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降,DMS组细胞凋亡率[(31.7±1.32)%]较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA:(0.148±0.006),蛋白:(0.182±0.044)]显著增加,而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡.     

鼻咽癌组织中XIAP和XAF1的表达及意义

[摘要] 目的 采用组织芯片技术研究鼻咽癌组织中凋亡抑制蛋白XIAP与其拮抗蛋白XAF1的表达及其意义。方法 以50例鼻咽癌患者鼻咽部活体组织石蜡标本和20例鼻咽部慢性炎症组织石蜡标本为研究对象,利用组织芯片技术同时采用S-P免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织芯片中XIAP和XAF1的表达。结果 （1）鼻咽癌中XIAP的阳性表达明显高于鼻咽部慢性炎症组织,差异有统计学意义(P <0.05)。鼻咽癌中XAF1的阳性表达均明显低于鼻咽部慢性炎症组织,差异有统计学意义(P <0.05);（2）XAF1在XIAP阳性的鼻咽癌石蜡标本中的阳性表达率低于在XIAP阴性的鼻咽癌石蜡标本中,XIAP和XAF1表达均呈明显负相关（P <0.05）。结论 XIAP在鼻咽癌中高表达,XAF1在鼻咽癌中低表达,鼻咽癌中XIAP和XAF1表达呈负相关。XIAP和XAF1可能是鼻咽癌细胞凋亡信号传导网络中的重要一环,其与鼻咽癌的发生、发展密切相关。     

异甘草素抑制胰腺癌SW1990细胞增殖及对survivin表达的影响

目的:研究异甘草素对人胰腺癌SW1990细胞增殖及细胞内survivin表达的影响?方法:体外培养SW1990细胞,给予不同浓度的异甘草素处理,MTT法检测异甘草素对SW1990细胞增殖的影响,实时定量PCR技术检测肿瘤细胞survivin基因mRNA的表达,蛋白免疫印迹法检测survivin蛋白的表达?结果:在一定浓度范围内,异甘草素能显著抑制人胰腺癌SW1990细胞的增殖,并呈时间与剂量依赖性,且异甘草素能显著抑制人胰腺癌SW1990细胞内survivin基因mRNA及蛋白的表达?结论:异甘草素对人胰腺癌SW1990细胞增殖有明显的抑制作用,且可能与下调survivin基因mRNA及蛋白的表达有关?     

阿司匹林引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药及其机制研究

目的探讨阿司匹林是否引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药及其可能机制。方法通过四氮唑蓝(MTT)和HOCHEST33258染色方法检测药物对人胰腺癌耐药株SW1990细胞的生长情况以及凋亡的影响;并应用蛋白免疫印迹方法检测细胞信号通路PI3K/AKT的变化。结果阿司匹林能明显降低吉西他滨对细胞的抑制率并提高IC50。0.4μmol/L吉西他滨干预细胞后,凋亡率达56%,明显高于吉西他滨与阿司匹林合用时细胞的凋亡率(28%,P<0.01)。磷酸化AKT和PI3K水平明显增高。PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002能明显逆转阿司匹林引起的SW1990细胞耐受吉西他滨的现象。结论阿司匹林通过激活PI3K/AKT信号通路引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药。     

Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用

目的 探讨Beclinl基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用.方法 采用RNA干扰技术抑制Beclinl表达,Beclinl被抑制后细胞的存活能力通过MTT实验评估;结直肠癌细胞SW620在血清剥夺状态下自噬活性通过LC3蛋白水平评估;分别经血清剥夺、星孢菌素及依托泊苷处理的SW620凋亡率通过流式细胞仪检测;Beclinl表达情况经Western blot评估.结果 pSUPER-Becl组细胞血清剥夺后存活能力显著降低(P＜0.05),在血清剥夺24 h后,空白对照组和pSUPER-non组抗凋亡能力比pSUPER-Becl组更强(P＜0.05),星孢菌素处理后,pSUPER-Becl组细胞凋亡最为显著(P＜0.05),用依托泊苷处理后得到相似的结果(P＜0.05);pSUPER-non组与空白对照组细胞中Beclinl的表达随血清剥夺时间的延长呈现上调趋势(P＜0.05),这与LC3的表达变化相一致;而pSUPER-Becl组LC3的表达显著减少(P＜0.05).结论 Beclin1是结直肠癌细胞中自噬和凋亡的关键调节因素,并且维持凋亡和自噬的平衡;Beclinl通过调节细胞自噬活性,在结直肠癌发展与演进中作为一种保护机制,使肿瘤细胞免受到低营养和化疗所致的损伤而持续生存.     

RhoB对胰腺癌细胞SW1990中NF-KB转录活性调控研究

目的 观察RhoB对人胰腺癌SW 1990细胞中NF-KB转录活性的影响.方法 将空载体质粒(peDNA3)、野生型RhoB过表达质粒(RhoB-wt)、RNA干扰对照质粒(RNAi-control),RhoB RNA干扰质粒(RhoB-RNAi),RhoB激活质粒(RhoB-V14)或RhoB失活质粒(RhoB-N19)和NF-KB报告基因质粒(NF-κB-luc)以及内参照质粒(pRL SV40-luc)共转染人SW 1990细胞中,24h后用双萤光素酶检测基因的转录活性,Western Blot检测RhoB蛋白.结果 SW 1990细胞中,转染0.8wg的RhoB过表达和激活均能抑制NF-KB报告基因的活性,分别是对照的54%和21%;RhoB I RNA干扰后NF-κB的转录活性上调为对照的1.5倍.结论 在胰腺癌SW 1990细胞中RhoB能抑制NF-κB的转录活性.     

siRNA干扰人宫颈癌基因(HCCR)的表达对胰腺癌PANC1细胞增殖?凋亡和侵袭的影响

目的:建立稳定转染人宫颈癌癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)siRNA真核表达质粒的人胰腺癌PANC1细胞株,探讨siRNA干扰HCCR的表达后对人胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:通过脂质体转染法将含HCCRsiRNA的真核表达质粒pGCsi-HCCR稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1,抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Western blot检测PANC1细胞中HCCR的表达,同时检测肿瘤相关基因p53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测PANC1细胞的细胞周期和凋亡率变化;MTT比色法检测siRNA干扰后对PANC1细胞增殖能力的影响:Transwell侵袭实验观察siRNA干扰后对PANC1细胞侵袭能力的影响.结果:Western blot证实siRNA稳转组的PANC1细胞株和空载体稳转组比较HCCR蛋白表达水平下调,稳转细胞株建立成功.siRNA稳转组p53蛋白表达下降.siRNA稳转组的S期细胞数目减少而G0/G1期细胞数目增加,细胞凋亡增加.MTT结果显示siRNA稳转组1和稳转组2细胞吸光度分别为空载体组细胞的0.65倍和0.68倍,细胞增殖能力下降.Transwell侵袭实验显示siRNA稳转组细胞和空载体组细胞穿膜数分别为24.4±9.9和49.1±15.4(P＜0.01),稳转组细胞侵袭能力下降.结论:siRNA干扰HCCR的表达后能抑制胰腺癌PANC1细胞增殖和侵袭,促进其凋亡.