高糖对胰岛β细胞增殖活力、分泌功能及内质网应激相关分子表达的影响

目的 研究持续高糖刺激对胰岛β细胞株MIN6增殖活力、分泌功能及内质网应激相关分子表达的影响.方法 将不同浓度葡萄糖(5.6、25和33.3mmol/L组)分别加入胰岛β细胞株MIN6培养液中,于不同时间点(24h和96h)收集细胞进行相关检测.CCK-8法检测细胞增殖活力;ELISA法检测胰岛素和胰岛素原分泌能力;Real-time PCR和Western blotting分别检测内质网应激相关分子Total XBP-1、Spliced XBP-1 mRNA及磷酸化IRE1α蛋白的表达.结果 加入葡萄糖后96h,各组细胞增殖活力均显著低于孵育后24h;在同一时间点,33.3mmol/L组和25mmol/L组显著低于5.6 mmol/L组(均P<0.05).加入葡萄糖后96h,33.3mmol/L组胰岛素分泌较干预后24h明显减少,而胰岛素原分泌显著增加(均P<0.05).加入葡萄糖后24h和96 h的各组Spliced XBP-1 mRNA表达,以及加入葡萄糖后96h的各组Total XBP-1 mRNA和磷酸化 IRE1α蛋白表达,均随葡萄糖浓度的增加而上调(P<0.05),呈现浓度依赖性.结论 持续性高糖可使胰岛β细胞的增殖活力下降、分泌功能受损及内质网应激相关分子表达增加,而后者可能是导致葡萄糖毒性的原因之一.     

硫酸脱氢表雄酮对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响

目的探讨硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)对胰岛β细胞株MIN6葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。方法以葡萄糖刺激浓度为2.8mmol/L和16.7mmol/L的对数生长期MIN6细胞作为实验对象,分别以1、5、10μmol/LDHEAS干预10min和24h(不同浓度DHEAS组),以5μmol/LDHEAS或与10μmol/L糖皮质激素受体阻断剂RU486联合干预24h(DHEAS和DHEAS+RU486组),设立空白对照组。ELISA法测定细胞培养上清液中胰岛素分泌量,Real-TimePCR检测细胞胰岛素mRNA表达。结果干预后10min和24h时点,5μmol/L和10μmol/LDHEAS组MIN6细胞培养上清液中的胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P<0.05);干预后24h时点,DHEAS+RU486组与DHEAS组MIN6细胞培养上清液中胰岛素分泌量比较差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于空白对照组(P<0.05)。干预后24h时点,5μmol/L和10μmol/LDHEAS组MIN6细胞胰岛素mRNA表达均显著高于空白对照组(P<0.05)。结论 DHEAS对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素...     

硫酸脱氢表雄酮对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响

目的 探讨硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）对胰岛β细胞株MIN6葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。方法 以葡萄糖刺激浓度为2.8 mmol/L和16.7 mmol/L的对数生长期MIN6细胞作为实验对象,分别以1、5、10 μmol/L DHEAS干预10 min和24 h（不同浓度DHEAS组）,以5 μmol/L DHEAS或与10 μmol/L糖皮质激素受体阻断剂RU486联合干预24 h（DHEAS 和DHEAS+RU486组）,设立空白对照组。ELISA法测定细胞培养上清液中胰岛素分泌量,Real-Time PCR检测细胞胰岛素mRNA表达。结果 干预后10 min和24 h时点,5 μmol/L和10 μmol/L DHEAS 组MIN6细胞培养上清液中的胰岛素分泌量均显著高于空白对照组（P<0.05）;干预后24 h时点,DHEAS+RU486组与DHEAS组MIN6细胞培养上清液中胰岛素分泌量比较差异无统计学意义（P>0.05）,但均显著高于空白对照组（P<0.05）。干预后24 h时点,5 μmol/L和10 μmol/L DHEAS组MIN6细胞胰岛素mRNA表达均显著高于空白对照组（P<0.05）。结论 DHEAS对MIN6细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌具有促进作用,且其核内信号通路可能不经糖皮质激素受体介导。     

硫酸脱氢表雄酮刺激MIN6细胞胰岛素分泌的机制研究

目的 初步探讨硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)促进MIN6细胞胰岛素分泌的机制.方法 选用小鼠胰岛B细胞株MIN6作为实验对象,在葡萄糖浓度为2.8 mmol/L和16.7 mmol/L的条件下,分别以0.1、1、5、10、50μmol/L的DHEAS干预10 min和24h,采用ELISA法测定细胞培养上清液中胰岛素的含量,应用相关试剂盒检测细胞内三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)的生物发光水平及比率(ATP/ADP);采用Real-Time PCR法检测不同浓度DHEAS干预24 h的细胞内葡萄糖激酶(GCK) mRNA的表达.结果 两种葡萄糖浓度条件下,以5、10、50 μmol/L DHEAS干预10 min和24 h的MIN6的细胞培养上清液中胰岛素含量和细胞内ATP/ADP比率显著高于空白对照组(P＜0.05).与空白对照组比较,1、5、10、50 μmol/L DHEAS干预24 h的MIN6细胞内GCK mRNA表达显著上调(p＜0.05).结论 DHEAS可能通过增加ATP/ADP的比率,促进MIN6细胞胰岛素的分泌;干预24 h的效应可能与上调GCK mRNA的表达、促进葡萄糖酵解有关.     

Apelin对葡萄糖的毒性作用及对胰岛细胞PDX-1表达的影响

目的 探讨Apelin对葡萄糖毒性作用及对胰岛细胞胰十二指肠同源盒蛋白-1(PDX-1)表达的影响.方法 在不同葡萄糖浓度下(正糖组5.6 mmol/L,高糖组16.7 mmol/L,极高糖组33.3 mmol/L),+/-Apelin-36培养胰岛β细胞株NIT-1细胞3d,然后测定基础和葡萄糖刺激后胰岛细胞胰岛素分泌量,测定细胞内胰岛素含量和PDX-1蛋白及mRNA表达.结果 与正糖组比较,高糖组和极高糖组的基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌、细胞内胰岛素均明显减少,PDX-1蛋白表达下降(P＜0.05);与未加Apelin组比较,加Apelin高糖组和极高糖组的基础和葡萄糖刺激后胰岛素分泌、细胞内胰岛素明显减少,PDX-1蛋白表达下降(P＜0.05);6组胰岛细胞的胰岛素水平与PDX-1蛋白表达呈正相关,与PDX-1 mRNA表达无关.结论 Apelin可能通过降低PDX-1蛋白表达参与葡萄糖毒性作用,引起胰岛素分泌减少,从而在糖尿病的发病机制中发挥作用.     

瘦素对大鼠体外胰岛β细胞胰岛素合成与分泌的抑制作用

目的了解不同浓度瘦素对体外培养大鼠胰岛β细胞胰岛素合成与分泌的影响。方法用含11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液体外培养大鼠胰岛β细胞系胰岛素-1(insulin-1,INS-1)细胞,实验分为5组,培养液瘦素浓度分别为0、5、10、20μg/L和50μg/L。培养24 h后分别以荧光定量PCR和ELISA方法检测胰岛β细胞前胰岛素原mRNA的表达及上清液胰岛素浓度。结果在葡萄糖浓度11.1 mmol/L、瘦素作用24 h情况下,胰岛β细胞前胰岛素原mRNA表达随培养液瘦素浓度的升高而逐渐下降,上清液胰岛素浓度随培养液瘦素浓度的升高而逐渐下降,瘦素可抑制胰岛β细胞胰岛素的合成与分泌。结论重组瘦素对体外培养大鼠胰岛β细胞(葡萄糖浓度11.1 mmol/L,瘦素作用24 h)胰岛素的合成与分泌具有抑制作用,随瘦素浓度的增加,抑制作用越明显。     

高血糖对体外培养的胎鼠胰岛Pdx-1基因的影响

目的：研究在体外培养时，高血糖对胎鼠胰岛胰和十二指肠同源盒基因-1（Pdx-1)和胰岛素基因的影响。方法：胶原酶法分离胎鼠胰岛，分别在葡萄糖浓度为5.5mmol/L,11.1mmol/L,33.3mmol/L的条件下培养24h。采用胰岛素含量测定、胰岛素释放实验评价胰岛功能；免疫细胞化学染色检测Pdx-1在细胞内的表达；逆转录PCR（RT-PCR）检测Pdx-1和胰岛素mRNA表达水平。结果：高血糖组1（11.1mmol/L)胎鼠单位重量胰岛细胞内胰岛素水平和刺激指数高于低糖组（5.5mmol/L)和高血糖组2（33.3mmol/L)。而且，高血糖组胎鼠胰岛Pdx-1蛋白的核移位率和mRNA表达水平均高于低糖组，但是高糖组2胰岛素mRNA表达低于高血糖组1，与低糖组无显著性差异。结论：高血糖刺激可以促进胎鼠Pdx-1表达和转录活性，可能是影响胰岛功能和β细胞对葡萄糖刺激敏感性增加的原因之一。     

高浓度葡萄糖条件下罗格列酮对NIT-1细胞FOXO1、TSC2基因表达及细胞分泌功能的影响

目的：研究罗格列酮在不同浓度葡萄糖条件下,对胰岛β细胞增殖凋亡与胰岛素分泌以及叉头转录因子-1(FOXO1)和结节性硬化症-2(TSC2)表达的影响。方法： 将 NIT-1细胞按每孔5×10个放置于24孔细胞培养板,培养48 h后随机分为各处理组：5.6、7.8、11.1、16.7、22.2 和27.6 mmol/L葡萄糖组,继续培养24 h后再分别施加1×10^-5mol/L罗格列酮,分别于干预24和48 h后取细胞培养上清液,采用放射免疫法检测胰岛素水平和免疫荧光法检测细胞增殖情况,RT-PCR半定量法检测FOXO1和TSC2 mRNA表达水平。结果：①1×10^-6～1×10^-5 mol/L罗格列酮可以分别在不同浓度葡萄糖培养条件下使胰岛NIT-1细胞增殖（P<0.05）,且这种变化趋势随剂量的增加而增加（即1×10^-5 mol/L罗格列酮组＞1×10^-6 mol/L罗格列酮组＞1×10^-7 mol/L罗格列酮组）。1×10^-5 mol/L的罗格列酮干预后,可见细胞凋亡百分率增加趋势随着葡萄糖浓度不断升高;②在同一浓度罗格列酮作用下,当葡萄糖浓度为11.1 mmol/L时,胰岛素分泌水平最高,高于其他各组（均P<0.05）,随着葡萄糖浓度增加,胰岛素分泌量逐渐下降（11.1 mmol/L葡萄糖组>16.7 mmol/L葡萄糖组>22.5 mmol/L葡萄糖组>27.6 mmol/L葡萄糖组）,而葡萄糖为5.6 mmol/L时,胰岛素分泌量最低;③ 在1×10^-5 mol/L罗格列酮干预后,FOXO1和TSC-2 mRNA的表达水平均较未干预组明显下降,且呈现出5.6 mmol/L组＜11.1 mmol/L组＜16.7 mmol/L组＜22.5 mmol/L组＜27.6 mmol/L组的变化趋势,而且葡萄糖浓度＞16.7 mmol/L的各组均较前面小剂量葡萄糖组（≤11.1 mmol/L各组）表达明显。结论：罗格列酮可以通过直接影响胰岛β细胞内FOXO1和TSC2表达促进胰岛β细胞的增殖及影响细胞胰岛素分泌功能,提示通过调控FOXO1和TSC2表达,可以直接影响胰岛β细胞的生物学功能,如分泌功能、细胞的增殖与凋亡以及改善胰岛素抵抗状况。     

Mibefradil抑制高糖诱导的胰岛素分泌作用及其机制的初步研究

目的 初步探讨Mibefradil对高糖作用下胰岛细胞胰岛素分泌的作用及其机制.方法 体外培养大鼠胰岛瘤β细胞株(INS-1),将INS-1细胞分为对照组(11.1 mmol/L葡萄糖)、高糖组(33.3 mmol/L葡萄糖)、药物组(11.1 mmol/L葡萄糖+1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10 μmol/L尼卡地平)、高糖+药物组(33.3 mmol/L葡萄糖+1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10 μmol/L尼卡地平),先用不同浓度葡萄糖孵育细胞48 h,再按分组加入药物继续孵育24 h.采用放射免疫法检测细胞培养上清胰岛素含量,RT-PCR及Western blot检测T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达.结果 与对照组相比,高糖组能够明显增加细胞胰岛素分泌(P＜0.05)和胰岛细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2基因及蛋白表达(P＜0.05),而药物组胰岛细胞胰岛素分泌水平和T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达则与对照组无显著差异(P＞0.05);与高糖组相比,高糖+药物组可不同程度降低INS-1细胞胰岛素分泌,其中Mibefradil组显著降低胰岛素分泌(P＜0.05)和T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达(P＜0.05).结论 Mibefradil可能通过下调胰岛细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌.     

高糖经内质网应激途径诱导胰岛内皮细胞凋亡

目的:探讨高糖诱导胰岛微血管内皮细胞株MS-1凋亡及其可能机制?方法:体外培养MS-1细胞,用含有不同浓度葡萄糖(5.6?25.0和33.6 mmol/L)的培养液分组培养12?24 h?流式细胞术分析各组细胞凋亡率变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖率变化;RT-PCR分析GRP78?CHOP?caspase-3?caspase-12 mRNA表达变化情况;Western blot分析GRP78?CHOP蛋白表达变化情况?结果:与5.6 mmol/L组相比,培养12 h及24 h后,25.0和33.6 mmol/L组MS-1细胞凋亡率显著增加(P < 0.05);而细胞增殖率显著下降(P < 0.05),且呈浓度和时间依赖性?进一步研究表明,在高糖刺激12 h及24 h后,caspase-3?caspase-12 mRNA表达显著上调(P < 0.05),CHOP mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P < 0.05);而GRP78 mRNA和蛋白表达水平在刺激12 h后显著上调,24 h后却显著下降(P < 0.05)?结论:高糖可以促进胰岛内皮细胞凋亡增加,并呈浓度和时间依赖性升高,其机制可能与启动胰岛内皮细胞内质网应激有关?     

胰高血糖素样肽-1抑制软脂酸诱导的MIN6细胞凋亡

目的探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对软脂酸(PA)诱导的MIN6细胞凋亡及分泌胰岛素功能的影响。方法传代培养处于对数生长期的胰岛β细胞MIN6细胞株分为三组。PA组:加入0.5 mmol/L PA孵育36 h;GLP-1 PA组:加入10 nmol/LGLP-1,12 h后再加入0.5 mmol/L PA继续孵育36 h,期间每12 h加1次相同浓度的GLP-1;对照组:未加GLP-1或PA,其他培养条件相同。MTT比色法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率;放射免疫分析法测定MIN6细胞胰岛素分泌量。结果PA组MIN6细胞凋亡率为(39.41±10.16)%,细胞活力较对照组减少25.8%(P<0.05);GLP-1 PA组MIN6细胞凋亡率为(32.80±8.06)%,细胞活力较PA组增强13.88%(P<0.05),其高糖和低糖状态下胰岛素分泌均明显高于PA组(P<0.05)。结论GLP-1可以抑制PA诱导的MIN6细胞凋亡,同时改善细胞胰岛素分泌功能。     

胰高血糖素样肽-1抑制软脂酸诱导的MIN6细胞凋亡

目的 探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对软脂酸(PA)诱导的MIN6细胞凋亡及分泌胰岛素功能的影响.方法 传代培养处于对数生长期的胰岛β细胞MIN6细胞株分为三组.PA组:加入0.5 mmol/L PA孵育36 h;GLP-1+PA组:加入10 nmol/LGLP-1,12 h后再加入0.5 mmol/L PA继续孵育36 h,期间每12 h加1次相同浓度的GLP-1;对照组:未加GLP-1或PA,其他培养条件相同.MTT比色法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率;放射免疫分析法测定MIN6细胞胰岛素分泌量.结果 PA组MIN6细胞凋亡率为(39.41±10.16)%,细胞活力较对照组减少25.8%(P＜0.05);GLP-1+PA组MIN6细胞凋亡率为(32.80±8.06)%,细胞活力较PA组增强13.88%(P＜0.05),其高糖和低糖状态下胰岛素分泌均明显高于PA组(P＜0.01).结论 GLP-1可以抑制PA诱导的MIN6细胞凋亡,同时改善细胞胰岛素分泌功能.     

罗格列酮对RIN-m细胞高糖损害干预作用研究

目的 研究罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对胰岛β细胞高糖损害的干预作用.方法 采用生理浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)、生理浓度葡萄糖 罗格列酮、高浓度葡萄糖(33.3 mmol/L)、高浓度葡萄糖 罗格列酮培养RIN-m细胞.以放射免疫法检测胰岛素分泌水平.以流式细胞仪及TUNEL法检测RIN-m细胞凋亡.RT-PCR方法 检测胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox factor-1,PDX-1)和胰岛素mRNA表达.结果 ①RIN-m细胞与33.3 mmol/L的葡萄糖孵育2周后胰岛素分泌功能开始下降,细胞凋亡率增长2.7倍(P＜0.01).而罗格列酮可以修复胰岛素的分泌,降低RIN-m细胞凋亡率.②罗格列酮上调 PDX-1(1.30±0.06 vs. 1.61±0.10,P＜0.01)和胰岛素 (1.75±0.09 vs. 1.98±0.11,P＜0.01) mRNA表达.结论 高糖抑制胰岛β细胞胰岛素分泌,并诱导其凋亡.罗格列酮具有直接保护β细胞免于高糖毒性的作用.     

罗格列酮对不同浓度葡萄糖条件下小鼠胰岛B细胞株NIT-1增殖、凋亡及功能的影响

目的 研究罗格列酮在不同浓度葡萄糖条件下对B细胞株NIT-1细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响.方法 将NIT-1细胞按5×104个细胞/孔至24孔培养板中培养,根据培养基RPM1640葡萄糖浓度不同分为以下5组:G1组(5.6 mmol/L)、G2组(11.1 mmol/L)、G3组(16.7 mmol/L)、G4组(22.2 mmol/L)及G5组(27.6 mmol/L),继续培养72 h后,分别给予10-5 mmol/L罗格列酮干预48 h后,取上清液采用放免法检测各组胰岛素水平;采用免疫荧光法检测凋亡细胞,MTT法检测细胞增殖情况.结果 (1)罗格列酮能够明显抑制高浓度葡萄糖诱导的NIT-1细胞凋亡.施加罗格列酮浓度10-5 mmol/L 48 h时后,能够明显抑制16.7 mmol/L、22.5 mmol/L和27.6 mmol/L浓度的葡萄糖所诱导的细胞凋亡.(2)罗格列酮能显著增加各浓度葡萄糖组NIT-1细胞的增殖活性.(3)罗格列酮能显著增加各葡萄糖浓度组的NIT-1细胞胰岛素分泌.结论 罗格列酮可以通过直接作用于胰岛B细胞调节改善的胰岛B细胞的增殖及功能、抑制凋亡.     

雌二醇通过上调IRE1α-XBP1信号轴抑制小鼠腹腔巨噬细胞的分化

目的 研究雌二醇其通过内质网应激通路影响巨噬细胞免疫特性的可能机制。方法 提取C57小鼠腹腔巨噬细胞,IFN-γ60 ng/mL作用下体外培养巨噬细胞,分组检测雌激素对巨噬细胞影响：实验组为雌二醇（1.0 nmol/L）处理;抑制剂组为雌二醇（1.0 nmol/L）和雌激素受体拮抗剂（Acolbifene, 4 nmol/L）同时作用;对照组加等量PBS处理,培养48 h后通过Western blot法检测比较巨噬细胞极化蛋白MHC-II、iNOS和内质网应激标志性蛋白IRE1α、eIF2α和ATF6的表达水平,通过RT-PCR法检测巨噬细胞TGF-β、IL-6、IL-10、TNFα mRNA水平变化。随后分组检测内质网应激对巨噬细胞的影响：雌激素处理组;雌激素和内质网IRE1α信号抑制剂（4 μ 8 C,50 μmol/L）处理组;IRE1α激动剂组（TG,0.2 nmol/L）处理组;对照组加等量PBS处理,随后检测巨噬细胞的分化情况。结果 和对照组比较,雌激素处理后巨噬细胞M1相关蛋白MHC-II （P=0.021）和iNOS（P<0.001）表达显著降低,促炎细胞因子TNF-α（P=0.003）和IL-6 mRNA（P=0.004）表达下调,抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P=0.002）和IL-10（P=0.008）mRNA表达上升,同时发现内质网相关的IRE1α（P<0.001）蛋白活化水平升高,其下游转录因子XBP-1（P<0.001）表达上调,加入雌激素受体阻断剂能够改变这种变化。和单纯雌激素处理组比较,在培养基中加入雌激素的同时加入IRE1α抑制剂4 μ 8 C会导致巨噬细胞 M1 相关蛋白 MHC-II（P=0.002）和 iNOS（P=0.003）表达显著上调,促炎细胞因子 TNF-α（P=0.003）和 IL-6mRNA（P=0.024）表达上调,抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P<0.001）和IL-10（P<0.001）mRNA表达下调,而激动IRE1α通路会矫正这种变化。结论 雌激素能够通过上调IRE1α-XBP-1信号轴抑制巨噬细胞促炎表型的分化,从而对炎症反应发挥抑制作用。     

VEGF-B对胰岛β细胞胰岛素分泌和Ca2+、cAMP、ATP含量的影响

目的观察血管内皮生长因子B(VEGF-B)对胰岛MIN6细胞胰岛素分泌及细胞内Ca²⁺、cAMP和ATP含量的影响,并探讨其作用机制。方法采用50 ng/mL VEGF-B蛋白在5.5 mM和25 mM葡萄糖条件下处理MIN6细胞,在2 h和24 h时应用ELISA试剂盒检测MIN6细胞的胰岛素分泌,细胞内Ca²⁺、cAMP和ATP含量。应用siRNA抑制MIN6细胞中的VEGF-B 48 h后,在5.5 mM和25 mM葡萄糖条件下检测2 h和24 h时MIN6细胞的胰岛素分泌、细胞内Ca²⁺、cAMP和ATP含量。结果 VEGF-B干预MIN6细胞后胰岛素分泌减少,同时细胞内Ca²⁺、cAMP和ATP含量均减少;抑制VEGF-B后胰岛素分泌增加,细胞内Ca²⁺、cAMP和ATP含量与胰岛素变化趋势一致。结论 VEGF-B可能通过影响Ca²⁺、 cAMP和ATP的含量影响胰岛β细胞胰岛素分泌。     

高糖高脂对β细胞脂肪酸转位酶基因表达的影响

目的观察高糖高脂对β细胞脂质含量及脂肪酸转位酶(FAT/CD36)基因表达的影响。方法体外培养NIT-1细胞,分别以5mmol/L葡萄糖(对照组,NC)、25mmol/L葡萄糖(高糖组,HG)、0.25mmol/L棕榈酸 5mmol/L葡萄糖(高脂组,HP)以及0.25mmol/L棕榈酸 25mmol/L葡萄糖(高糖高脂组,GP)培养24h后,酶法测定细胞内三酰甘油(TG)含量,放免法测定胰岛素分泌,RT-PCR检测FAT/CD36mRNA表达。结果与NC组比较,各处理组细胞内TG含量增加,而葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)下降,以GP组变化最明显(P<0.01),且GP组与HG组和HP组间的差异也有显著性。在高糖的孵育下,HG组和GP组FAT/CD36mRNA表达显著高于NC组(P<0.01),但无论是5mmol/L还是25mmol/L葡萄糖添加棕榈酸后的各组与相应的单纯葡萄糖组比较FAT/CD36mRNA表达均无明显改变。结论在高脂的环境下,高糖可进一步促进β细胞脂质沉积、抑制GSIS;其中高糖上调FAT/CD36mRNA表达可能是其重要机制之一。     

高糖对INS-1细胞损伤存在记忆效应

目的观察大鼠胰岛细胞对高糖损伤是否存在记忆效应,并对其机制进行初步探讨。方法以INS-1(大鼠胰岛瘤细胞株)细胞作为研究对象,观察INS-1细胞经历48 h持续高糖(33.3 mmol/L)刺激后,纠正高糖状态,以11.1 mmol/L糖浓度继续培养,检测细胞活力,凋亡相关基因(bax,caspase-3)的mRNA水平和活性氧(ROS)水平的变化。INS-1细胞处理组分为:对照组(11.1 mmol/L葡萄糖×7 d);高糖组(33.3 mmol/L葡萄糖×2 d);3 d记忆组(33.3 mmol/L葡萄糖×2 d+11.1mmol/L葡萄糖×3 d);5 d记忆组(33.3 mmol/L葡萄糖×2 d+11.1 mmol/L葡萄糖×5 d)。Real-Time PCR检测bax,cas-pase-3的mRNA水平,Dihydroethidium(DHE探针)检测ROS水平,MTT法测定细胞活力。结果高糖组细胞活力较对照组显著降低(P<0.001)。而ROS水平,bax,Caspase-3的mRNA水平较对照组显著增高(P<0.05)。在3 d记忆组及5 d记忆组,细胞活力较对照组显著降低(P<0.001),ROS水平,bax,Caspase-3的mRNA水平较对照组显著增高(P<0.05)。结论高糖对INS-1细胞的损伤存在记忆效应,主要表现为细胞活力的持续降低,促凋亡基因的持续高表达。ROS水平的持续升高可能与记忆效应产生有密切关系。     

蛋白激酶5过度激活诱发β细胞凋亡和调节胰岛素分泌的机制研究

目的探讨高糖诱导细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)过度激活在胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌调节中的作用机制。方法体外培养Min6小鼠胰岛β细胞。采用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L组、20 mmol/L组和30mmol/L组)刺激胰岛β细胞6 h,收取和固定细胞,行免疫印迹和免疫荧光法测定p35的表达;将p35基因克隆到腺病毒载体中,将p35病毒和空载体病毒(EV)分别转染到胰岛β细胞中(p35组和EV组),测定p35蛋白表达、CDK5活性及胰岛素分泌水平;采用CDK5抑制剂(p35+Ros组)进行抑制试验;采用细胞凋亡相关抗体Cleavedcaspase 3测定胰岛β细胞凋亡。结果 20 mmol/L组和30 mmol/L组p35的表达较5 mmol/L组升高,30 mmol/L组p35的表达较20 mmol/L组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度葡萄糖培养的胰岛β细胞CDK5的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。20 mmol/L组和30 mmol/L组胰岛β细胞CDK5活性较5 mmol/L组增高,30 mmol/L组胰岛β细胞CDK5活性较20 mmol/L组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。20 mmol/L组和30 mmol/L组在刺激6 h较2 h胰岛素分泌均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。p35组p35表达较EV组增高,p35组可见p25条带,p35组CDK5活性较EV组增高,p35组胰岛素分泌水平较EV组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。EV组和p35+Ros组细胞凋亡相关抗体Cleaved caspase 3表达较p35组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。EV组和p35+Ros组胰岛素分泌较p35组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高浓度的葡萄糖可以抑制胰岛细胞正常分泌胰岛素。高糖环境下p35的表达增加进而诱发p25的表达,引起CDK5的过度激活和胰岛细胞的凋亡从而抑制胰岛素的分泌,可能是其作用机制之一。