神经调节蛋白-1诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 观察神经调节蛋白-1(NRG-1)诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化及扩增心肌细胞的作用.方法 分别观察ESCs自发及NRG-1诱导情况下心肌细胞分化率;RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA及心肌骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA的表达;细胞免疫组化检测心肌α-actinin蛋白表达;血管活性药物刺激观察心肌细胞的功能反应.结果 NRG-1诱导的心肌细胞分化率显著高于自发的心肌细胞分化率(P<0.05),且诱导生成的心肌细胞对肾上腺素能及胆碱能药物刺激呈现相应的频率反应,刺激前后搏动频率差异均有统计学意义(P<0.05);NRG-1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表达,在NRG-1为100 ng/mL时表达水平最高,且两者的相对表达量明显高于自发分化组的相对表达量(P<0.05或P<0.01);NRG-1干预增加心肌细胞骨架蛋白α-MHC、β-MHC mRNA水平且增强α-actinin蛋白表达(P<0.05).结论 外源性NRG-1早期干预能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞.     

抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 研究LIF/Stat3信号通路对小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化成心肌细胞的影响.方法 利用mESCs形成拟胚体(EBs)进行心肌分化.在野生型mESCs形成EBs的过程中加入Janus激酶(JAK)抑制剂以抑制LIF/Stat3信号通路(JAKi组).而在融合表达雌激素受体(ER)和Stat3的Stat3ER细胞株进行分化过程中添加4-羟基他莫西酚(4HT)以激活LIF/Stat3信号通路 (4HT组).用qRT-PCR检测心脏特异转录因子NKX25、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和连接蛋白43(Cx43)以及mESCs自我更新基因oct4、nanog和Stat3下游基因socs3的表达水平.用Western blot检测和免疫荧光染色法验证α-MHC和Cx43的相对表达.结果 免疫荧光结果显示在自发搏动的EBs中出现α-MHC和Cx43的荧光,表明心肌细胞分化成功.随着分化时间的延长,NKX2.5、α-MHC和Cx43的mRNA表达量逐渐增加,至第15天时最为明显,且JAKi组高于对照组(P<0.01);对照组高于4HT组(P<0.01).而nanog、oct4随着分化时间的延长逐渐降低,且JAKi组低于对照组(P<0.05),而4HT组高于其对照组(P<0.05).Socs3的表达量在JAKi组一直较低且低于对照组,在4HT组表达较高且高于对照组(P<0.01).Western blot检测结果显示第15天的Cx43和α-MHC蛋白表达量JAKi组明显高于对照组(P<0.05),4HT组低于其对照组(P<0.05).结论 抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞分化成心肌细胞;激活LIF/Stat3信号通路抑制小鼠胚胎干细胞的心肌细胞分化.     

激活Notch对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响

目的:观察Notch信号激活剂Jagged蛋白对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响.方法:小鼠胚胎干细胞用荧光染料DAPI(200 mg/L)标记,在细胞培养的基础上,加入Notch信号激活剂Jagged蛋白(5 mg/L)作用14d.①相差显微镜下观察自发性节律收缩细胞的出现情况;②透射电镜对培养细胞进行超微结构分析;③...     

丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用

目的:观察丹参对pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的诱导作用。方法:采用悬浮法,从拟胚体形成的第4、5、6、7d起在培养液中加入不同浓度的丹参诱导pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化,计数第8、9、10、11、12d心肌细胞的分化率。用RT-PCR方法检测分化的心肌细胞αMHC、Anf、MLC2v基因的表达。结果:10、30、50、70mg/ml丹参在拟胚体形成的第10、11、12d均可明显提高心肌细胞的分化率(P<0.01)。RT-PCR结果αMHC、Anf、MLC2v基因在分化的心肌细胞中表达。结论:丹参可以体外提高pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞的分化率。     

环孢霉素A诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的：观察环孢霉素A（CSA）对小鼠胚胎干细胞（ESCs）向心肌细胞分化的影响。方法：分别观察ESCs自发和CSA诱导情况下心肌细胞分化率,细胞免疫组化检测心肌细胞标志物的表达。结果：CSA诱导的心肌细胞分化率明显高于自发的心肌细胞分化率,且诱导生成的心肌细胞具备心肌细胞特有的特征。结论：CSA能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的 构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞. 方法 应用电穿孔技术将p α-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10～12 d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化.通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定p α-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立.细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达. 结果 G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性. 结论 成功构建了p α-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化.     

p α-MHC/EGFP小鼠胚胎干细胞株的构建及其向心肌细胞分化的观察

目的构建含有心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的载体并转染到小鼠胚胎干细胞(ESC),建立p α-MHC/EGFP小鼠ESC株,利用该细胞株可识别和纯化分化形成的心肌细胞。方法应用电穿孔技术将pα-MHC/EGFP载体转染到ESC,G418筛选10~12d后收集G418抗性细胞克隆并采用悬滴法体外诱导向心肌分化。通过PCR扩增细胞克隆基因组EGFP片段,并在心肌分化过程中通过荧光显微镜观察EGFP的表达,鉴定pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株的建立。细胞免疫组化法检测自发性搏动拟胚体(EB)中EGFP阳性区域心肌肌钙蛋白T的表达。结果G418抗性细胞克隆基因组中能够扩增EGFP片段;在心肌细胞分化过程中,荧光显微镜下能观察到EB局部出现自发性搏动的亮绿色细胞团;细胞免疫组化检测显示,EGFP阳性区域肌钙蛋白T表达阳性。结论成功构建了pα-MHC/EGFP胚胎干细胞株,该细胞株在分化为心肌细胞的同时表达EGFP,便于对心肌细胞进行识别和纯化。     

CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

目的 观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化中的作用.方法 采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组.用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达.用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达.用Western blot法检测 α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达.结果 免疫荧光法提示各组mESCs能够向心肌细胞分化.在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加最为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01).Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组.结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进mESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a.     

体外诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导条件下分化为心肌细胞的特征。方法:小鼠胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上增殖培养,先将ESCs悬浮培养形成23d的拟胚体(EBs),再将23dEBs种植到含有TGFβ1的24孔板中进行诱导,以及种植到铺有END2细胞饲养层的24孔板中进行诱导,培养液中同时加入TGFβ1。免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(αActin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。流式细胞仪检测EBs集落心肌细胞的平均分化率。结果:TGFβ1诱导组和TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导组分别有43%,91%(P<0.05)的拟胚体出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白αActin和TnT,以及观察到心肌样超微结构,但在共培养的条件下,自发节律性收缩区域较大,且细胞形态较单一。两诱导组EBs集落心肌细胞平均分化率分别是35%,74%(P<0.05)。结论:TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养对小鼠ESCs向心肌细胞定向分化有协同作用,具有较高的诱导分化率。     

调控Notch信号通路对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响

目的:观察Notch信号通路调控对胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响。方法:实验分为两部分:调控Notch信号通路开关,研究其对胚胎干细胞向心肌细胞分化比例的影响及心肌分化相关蛋白表达的影响。在小鼠胚胎干细胞培养的基础上,加入Notch信号激活剂Jagged蛋白(5mg/L)或Notch信号抑制剂MW167(100μmol/L)作用14d,检测:①自发性节律收缩细胞的出现情况;②心肌特异性收缩蛋白的表达情况,计算胚胎干细胞分化为心肌细胞的比例;③采用Westernblot方法检测胚胎干细胞源性心肌细胞中心肌分化相关蛋白(Nkx2.5、GA-TA4、Tbx5、Myocardin)的表达。结果:与对照组(胚胎干细胞自发分化组)相比,加入Jagged蛋白后,胚胎干细胞向心肌细胞分化的比例和早期心肌分化相关蛋白表达水平均显著减少;而加入MW167后,分化比例及早期心肌分化相关蛋白均显著增加。结论:胚胎干细胞中加入Jagged蛋白持续激活Notch信号,抑制了胚胎干细胞向心肌细胞分化;而加入MW167持续抑制Notch信号,则促进了胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

Nesprin-1对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的影响

目的探讨nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的作用。方法采用悬滴-悬浮-贴壁三步法,5-氮杂胞苷(5-aza)与丹参共同诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞,用Western blot与免疫荧光技术检测nesprin-1蛋白表达水平和在分化成熟过程中的改变。同时利用RNA干扰(RNAi)技术抑制nesprin-1蛋白的表达:Ⅰ组(RNA干扰目的序列AAAGCCAAGCACGCAACTA),Ⅱ组(RNA干扰目的序列GGGAACCAACAGTGAGATT),Ⅲ组(RNA干扰目的序列ACCAGGACATTGCGTACTA),对照组(使用无意义的ShRNA干扰序列),观察对胚胎干细胞分化的影响。结果 Nesprin-1各亚型在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达水平有所变化。RNAi后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和对照组心肌细胞分化率分别为(17.78±1.92)%、(36.67±3.34)%、(44.42±5.08)%和(77.78±1.92)%,各干扰组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),且各干扰组分化后心肌组织分化成熟的蛋白标志肌球蛋白(myosin)的表达量减少。结论 Nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中发挥重要作用,不同分子大小的nesprin-1亚型在此分化过程中可能有着不同的功能。     

低氧对小鼠胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞的影响

目的探讨在胚胎干细胞诱导分化过程的不同阶段进行低氧处理对分化心肌细胞的影响。方法建立胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的实验方法,在分化过程的不同阶段采取低氧（氧浓度为4%）处理,并设立常氧组（约为20%）作为对照,用免疫荧光鉴定分化后的心肌细胞,以流式细胞术检测低氧对分化心肌细胞的增殖、分化、凋亡的影响。结果分化细胞经免疫荧光检测显示,部分细胞呈α辅肌动蛋白阳性（红色）、心肌肌钙蛋白I阳性（绿色）;分化细胞经流式检测显示,与常氧组相比,悬滴低氧组α-actinin阳性细胞和cTnI阳性细胞的比率分别提高了12.55%（P〈0.01）和6.11%（P〈0.05）,悬浮低氧组凋亡比率与常氧组相比明显提高（P〈0.01）,悬滴低氧组处于S期的细胞比率与常氧组相比明显降低（P〈0.01）。结论在胚胎干细胞向心肌细胞的定向诱导分化过程中,采用悬滴阶段低氧处理,使心肌特异性蛋白阳性细胞比率提高,细胞凋亡率稳定,细胞增殖能力因细胞分化成熟而有所降低,为低氧处理的最佳方案。     

与胎儿心肌细胞共同培养诱导人胚胎干细胞发生心肌样分化

目的 了解与胎儿心肌细胞共同培养对人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向心肌方向分化的影响.方法 通过酶消化法从流产胎儿中分离培养出胎儿心肌细胞及成纤维细胞,将后者用丝裂霉素处理后制备成滋养层;收集辅助生育中心施行试管婴儿后所剩余的健康胚胎,取内细胞团接种在滋养层上分离培养出人ESCs.用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridzation,FISH)方法来检测上述两种细胞的XY染色体,选用不同性别的胎儿心肌细胞与2～5代人ESCs以1∶2的比例混合,然后以5×104/cm2的密度接种于培养皿中进行共同培养,诱导其向心肌方向的分化.将未与胎儿心肌细胞混合的人ESCs以相同密度接种于培养皿中作为阴性对照.至第5天收集共同培养的细胞,进行双重染色,即 FISH染色及心肌特异性蛋白Desmin或cTnI免疫组化染色.结果 在与胎儿心肌细胞共同培养5 d后,40%～50%的人ESCs在心肌细胞的诱导下表达心肌特异性蛋白Desmin或cTnI,而没有进行共同培养的人ESCs不表达上述蛋白.结论 与胎儿心肌细胞的共同培养能诱导人ESCs发生向心肌方向的分化,人ESCs有望成为心肌干细胞移植的细胞材料.     

Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro

Objective To investigate an method for hepatic differentiation from embryonic stem cells (ES cells) in vitro and the resulting differentiation ratio, in order to develop a procedure for producing a new type of hepatocyte for hepatocyte replacement therapy in the treament of liver failure.Methods ES cells from Balb/C mice were cultured and maintained in an undifferentiated state in gelatin-coated dishes using Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 1000 U/ml leukemia inhibitory factor (LIF). Then, LIF was withdrawn from the DMEM to allow the ES cells to develop into embryonic bodies (EBs). EBs were plated onto tissue culture dishes, and growth factors such as acidicfibroblast growth factor (aFGF) and hepatocyte growth factor (HGF) were added to the medium to promote directional differentiation. The course of development and differentiation was observed dynamically using an inversion microscope. The expression of hepatic proteins, such as α-fetoprotein (AFP), albumin (ALB), cytokeratin 8 (CK8), cytokeratin 18 (CK18), in cytoplasm was analyzed by immunocytochemistry (ICC). The concentration of ALB in the medium was determined dynamically by radioimmunoassay (RIA). Results ES cells replicated as clones, without differentiating, in DMEM containing LIF. They developed into EBs in medium without LIF. Our ICC assay showed that differentiating cells did not express hepatic proteins, such as AFP, ALB, CK8, and CK18 until day 7, day 9, day 11, and day 11, respectively (up to 2 days later when growth factors are not present). The concentration of AFP in the medium was first detected on day 8, at a concentration of 3.4 ng/ml, and increased to 22.8 ng/ml by day 15. The concentration of ALB in the medium was 0.2 μg/ml on day 11, and increased to 2.2 μg/ml by day 15. ALB-positive cells under ICC manifest morphological structures were consistent with normal mouse hepatocytes. The differentiation ratio of hepatocytes in the ES cell differentiation system was 30％ on day 15 (significantly lower without the presence of growth factors).Conclusions ES cells can differentiate into mature hepatocytes. Growth factors, such as aFGF and HGF, can enhance this differentiation and produce sufficient numbers of functional hepatocytes. This method may be a reliable new way of differentiating ES cells into hepatocytes for use in replacement therapy in the treament of liver failure.     

nesprins基因在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达

目的:探讨nesprins基因在小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)分化为心肌细胞过程中的表达及作用.方法:体外培养小鼠ESC,采用5-氮杂胞苷为诱导剂诱导ESC分化为心肌细胞,并进行心肌细胞鉴定;RT-PCR检测分化过程中各时间点(d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20)nesprin-1、nesprin-2基因mRNA的表达;免疫荧光检测各时间点nesprin-1蛋白的细胞定位.结果:nesprin-1、nesprin-2基因mRNA在ESC分化为心肌细胞过程中均有表达;nesprin-l基因mRNA在d7、d7+3、d7+6均表达较高,无显著性差异,随后表达呈下降趋势,在d7+20时表达最低(P＜0.05);nesprin-2基因mRNA在d7时表达最高,与d7+3、d7+6组间均有显著性差异(P＜0.05),且随着分化时间的延长表达逐渐下降,在d7+20时表达最低;nesprin-1蛋白在ESC分化过程中均有表达,定位于核被膜及核周间隙.结论:nesprin-1、nesprin-2基因表达高峰在生心细胞的诱导和特化时期,推测nesprins对维持心肌细胞发育,使ESC更完全的向心肌细胞分化起重要作用.     

胚胎干细胞自我更新与诱导分化

本文在简述胚胎干细胞生物学性状的基础上,重点综述胚胎干细胞自我更新和诱导分化研究的相关进展,其中包括由外源性细胞因子(LIF因子)和内源性转录因子(Oct-4,Nanog)共同参与的自我更新调控机制;通过条件培养基和基因转染的方法定向诱导干细胞分化以及微环境对干细胞诱导分化的影响及调控,最后提出干细胞研究面临的挑战.可为今后干细胞的基础科研及应用开发提供必要的理论依据和技术指导.     

小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验

目的：探索提高胚胎干细胞（ESC）体外诱导分化为心肌细胞的实验方法.方法：采用悬滴—悬浮—贴壁三步法（悬滴三步法）和悬浮—贴壁两步法（悬浮两步法）,按诱导剂的不同分为Ⅰ组：丹参＋5-氮杂胞苷（5-aza）组;Ⅱ组：丹参＋维甲酸（RA）组;Ⅲ组：5-aza组;Ⅳ组：丹参组;Ⅴ组：RA组;Ⅵ组：阴性对照组6组进行诱导培养,比较在2种培养方法下各组心肌细胞的分化率.结果：Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组采用悬滴三步法培养的心肌细胞分化率分别为（77.78±5.09）%,（66.67±8.82）%,（51.11±1.92）%,（44.44±5.09）%,（23.33±3.34）%;采用悬浮两步法培养的心肌细胞分化率分别为（42.22±6.94）%,（36.67±8.82）%,（25.55±10.71）%,（17.78±5.09）%,（10.00±2.84）%.各组心肌细胞分化率悬滴三步法较悬浮两步法高,差异具有统计学意义（P〈0.05）.采用悬滴三步法培养Ⅰ组心肌细胞分化率最高可达78%,与其它各组相比较差异具有统计学意义（P〈0.05）.结论：悬滴三步法联合采用中药丹参与5-aza为诱导剂,可为体外ESC分化为心肌细胞的实验方法提供理论依据.