胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是指从桑葚胚或附植前囊胚内细胞团分离的多潜能细胞,具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在过去的20余年中,随着对干细胞特征认识的加深,ES细胞已展示出很好的应用前景。Es细胞能够在体外不断自我更新并保持未分化的特性,在生长因子及某些药物的诱导下能够分化为心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞、肝细胞及内皮细胞等3个胚层来源的各种体细胞。因此,Es细胞成为研究组织特点及功能、药物筛选及毒性实验、细胞移植替代治疗的理想供体细胞。     

体外定向诱导E14小鼠胚胎干细胞为肝细胞

目的探索体外定向诱导胚胎干细胞分化为肝细胞。方法常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后，进行悬滴-悬浮培养，形成胚胎体，再进行分阶段定向诱导，在培养第9～12天、第12～18人以及第15～18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析持异性基因mRNA的表达，并用吲哚氰绿(ICG)摄取和过碘酸雪夫反应(PAS)分析细胞的分化及功能。结果在诱导培养的第13天，细胞出现肝细胞样改变。RTPCR分析可见，在诱导的第6天和第12天分别可以榆测到内胚层或卵黄囊分化标志基因-甲状腺素运载蛋白和α1抗胰蛋白酶的mRNA表达，第6天出现末成熟肝细胞标志基因-甲胎蛋白mRNA表达，第9天、第15天和第18天分别开始出现成熟肝细胞的特异性标志基因-白蛋白、葡萄糖6磷酸酶、酪氨酸氨基转移酶mRNA表达。同时，ESC源性肝细胞表现为ICG摄取和PAS反应阳性，经过诱导，ICG阳性细胞数约占85．1％。结论ESC源性肝细胞具备肝细胞特性，FSC有可能成为肝细胞治疗的替代供体细胞。     

TNNI3K基因过表达诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的研究肌钙蛋白Ⅰ相关激酶(TNNI3K)对小鼠胚胎干细胞(m ESC)向心肌细胞分化的影响。方法从形态和细胞免疫荧光、碱性磷酸酶试验以及HE染色鉴定m ESC的多能性。采用悬滴法培养m ESC形成拟胚体(EB),自分化为跳动的心肌细胞,通过细胞免疫荧光和透射电镜(TEM)方法鉴定。慢病毒分别携带h TNNI3K基因和siRNA感染m ESC,并分别自分化为心肌细胞,通过流式细胞术(FCM)、细胞免疫荧光、Western blot等分析心肌特异性蛋白表达水平的差异。结果 m ESC表面蛋白分子SSEA-1和Oct-4表达呈阳性(绿色),ALP试验呈蓝紫色,核质比1。正常自分化的细胞免疫荧光显示cTnⅠ、cTnT、MLC2以及α-actinin阳性(绿色),肌节清晰可见。TEM显示心肌细胞独有的肌纤维亚细胞结构。过表达组cTnT+阳性细胞率高于对照组,Western blot显示心肌特异性蛋白cTnT、cTnⅠ、MLC2、α-actinin等显著高于对照组,且细胞免疫荧光结果显示MHC6蛋白提前表达。干扰组不仅cTnT+阳性细胞率显著低于对照组,而且心肌特异蛋白也显著低于对照组,MHC6蛋白表达延后。结论TNNI3K基因能增强心肌细胞的生成,促进m ESC向心肌细胞的分化。     

骨髓干细胞向心肌细胞分化的研究现状

心肌细胞在生理和病理状况下存在细胞增殖现象。骨髓干细胞被认为是再生心肌细胞的来源之一。骨髓细胞不论是全髓细胞、造血干细胞，还是间质干细胞，体内移植都可向心肌细胞分化，在一定程度上改善心功能。体外诱导不仅可出现心肌细胞表型，还表达功能性受体。     

体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化

长期以来人们一直在研究心肌再生的可能性。人工诱导多功能干细胞由于其在跨越了胚胎干细胞所面临的医学伦理学问题的同时具有多分化潜能而成为人们研究的热点。在体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的试验中,研究者对细胞进行向心肌细胞分化的诱导,检测其分化效率;对分化的心肌细胞进行基因、蛋白水平的验证,并对细胞电生理特性进行比较分析,发现其与正常心肌细胞在各个方面均相似。这些研究为寻找心肌损伤后心肌细胞再生提供了理论基础,并为人们研究心肌细胞在疾病病因学、明确药物效能以及最终的患者特异性治疗方面有广泛的应用价值,为转化医学提供了前景。     

维生素C促进小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:利用经典的悬滴培养法形成拟胚体(EBs),诱导小鼠胚胎干细胞(m ESCs)在体外分化为心肌细胞,观察维生素C作为诱导剂对m ESCs体外诱导分化为心肌细胞的影响,进而寻找一种高效、安全的诱导方法。方法:复苏m ESCs,传代培养后,利用悬滴法使m ESCs形成拟胚体,用含0.1mg/m L维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察出现搏动拟胚体的时间,搏动拟胚体的数量,计算分化比率,统计搏动频率,并进行免疫荧光染色测定心肌肌钙蛋白T(c Tn T)的表达。结果:小鼠胚胎干细胞可自发分化为心肌细胞,但效率较低,0.1mg/m L的维生素C能明显提高m ESCs分化为心肌细胞的效率,约83.3%的EBs出现搏动,显著高于未添加任何诱导剂组,搏动频率为(81.2±7.8)次/分钟。两组搏动心肌细胞c Tn T免疫染色阳性。结论:维生素C能够显著提高m ESCs向心肌细胞分化效率,应用维生素C体外诱导m ESCs向心肌细胞分化是一种较为理想的体外诱导方式。     

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的定向分化

在适当的条件下，胚胎干细胞可在体外被诱导分化为胰岛素分泌细胞。这一过程包括胚胎干细胞的诱导分化以及分化细胞的筛选和成熟。通过检测胰岛细胞的细胞标志和应用组织化学方法可鉴定胚胎干细胞是否已分化为胰岛素分泌细胞。研究显示，来源于小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞可使糖尿病模型动物的血糖恢复到正常水平，但在胚胎干细胞进入临床应用之前，仍有很多问题需进一步研究加以解决。     

心肌营养素-1诱导小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

目的:观察心肌营养素-1(CT-1)对小鼠诱导性多能干细胞(miPSCs)心肌细胞定向分化的诱导作用。方法:实验分为对照组与CT-1处理组。miPSCs经悬滴法诱导形成拟胚体,第3天培养基中加入1μmol/ml CT-1(CT-1组),对照组采用普通培养基。于第4、7、10和14天,收取细胞样本,采用实时PCR检测心脏特异标志物基因的表达。用免疫荧光染色及流式细胞术检测干细胞标志物Oct4和心肌特异性分化标志物肌钙蛋白I(cTnI)的表达。用透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。结果:CT-1组第10天,样本中心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)基因表达的水平为同期对照组的1.75倍,有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光染色法检测显示,两组均有cTnI表达。流式细胞术鉴定的结果显示,对照组与CT-1组cTnI的阳性率分别为28.5%和56.4%,有显著性差异(P<0.05)。电镜观察显示,CT-1组肌原纤维及胞内线粒体明显增多,肌纤维排列规则,可见细胞间桥粒连接和缝隙连接。结论:CT-1可显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率。     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的:观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)心肌细胞分化的影响。方法:用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体(embryoid bodies,EBs)。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk-1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT-PCR检测Nk同源异型盒5(Nkx2.5)、锌指转录因子-4(GATA-4)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)及心房钠尿肽(ANP)基因表达水平的变化。用Western blot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0~5天及5~10天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5-10组。加入Dkk-1的组命名为Dkk-1组。结果:通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0~5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2.5、GATA4、β-MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5~10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5~10天加入Dkk-1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0~5天分别加入Wnt3a及Dkk-1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论:Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells

Aims/hypothesis We recently demonstrated that insulin-producing cells derived from embryonic stem cells normalise hyperglycaemia in transplanted diabetic mice. The differentiation and selection procedure, however, was successful in less than 5% of the assays performed. Thus, to improve its effectiveness, new strategies have been developed, which increase the number of islet cells or islet progenitors. Methods Mouse embryonic stem cells transfected with a plasmid containing the Nkx6.1 promoter gene followed by a neomycin-resistance gene, were cultured with factors known to participate in endocrine pancreatic development and factors that modulate signalling pathways involved in these processes. Neomycin was used to select the Nkx6.1-positive cells, which also express insulin. The transfected cells were differentiated using several exogenous agents, followed by selection of Nkx6.1-positive cells. The resulting cells were analysed for pancreatic gene and protein expression by immunocytochemistry, RT-PCR and radioimmunoassay. Also, proliferation assays were performed, as well as transplantation to streptozotocin-induced diabetic mice.Results The protocols yielded cell cultures with approximately 20% of cells co-expressing insulin and Pdx-1. Cell trapping selection yielded an almost pure population of insulin-positive cells, which expressed the beta cell genes/proteins Pdx-1, Nkx6.1, insulin, glucokinase, GLUT-2 and Sur-1. Subsequent transplantation to streptozotocin-induced diabetic mice normalised their glycaemia during the time period of experimentation, proving the efficiency of the protocols.Conclusions/interpretation These methods were both highly efficient and very reproducible, resulting in a new strategy to obtain insulin-containing cells from stem cells with a near 100% success rate, while actively promoting the maturation of the exocytotic machinery.Abbreviations Anti-Shh antibody against sonic hedgehog - D3 undifferentiated D3 stem cell line - EB embryoid bodies - ES embryonic stem - FBS fetal bovine serum - LIF leukaemia inhibitory factor - mES mouse embryonic stem - Ngn3 neurogenin 3 - P gelatine-coated plates - Pdx-1 pancreatic duodenum homeobox 1     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的：观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）心肌细胞分化的影响。方法：用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体（embryoidbodies,EBs）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk一1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT—PCR检测Nk同源异型盒5（Nkx2．5）、锌指转录因子-4（GATA．4）、B．肌球蛋白重链（[~-MHC）及心房钠尿肽（ANP）基因表达水平的变化。用Westernblot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0—5天及5～lO天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5．10组。加入Dkk．1的组命名为Dkk．1组。结果：通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0—5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2．5、GATA4、B．MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5—10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5—10天加入Dkk．1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0—5天分别加入Wnt3a及Dkk．1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论：Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

关于骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导剂研究概况

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能,且在体外容易扩增培养,是一种治疗心梗理想的种子细胞,通过诱导剂将骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞是心血管领域研究的热门话题.本文就目前常用的诱导剂作一概况.     

人胎肝非实质间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞

目的体外诱导人胎肝非实质间充质干细胞(NPMSCs)分化为类肝细胞,对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。方法采用体外细胞培养技术,分离培养人胎肝NPMSCs,在1%基质胶作基质,2.5 mmol/L氮胞苷预处理10～12 h,肝细胞生长因子10μg/L加成纤维细胞生长因子4 10μg/L加肝细胞生长培养基中诱导。用显微摄像和四甲基偶氮唑盐研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应鉴定细胞表型。采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中人Alb水平,过碘酸希夫试验进行糖原染色。结果从人胎肝获得贴壁细胞种植后生长分裂良好,连续传10代后,每份人胎肝NPMSCs可扩增达109个细胞。NPMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。在添加成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28 d时,形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%,双核细胞比率5%。免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应检测显示未诱导培养的NPMSCs中,有较少的细胞表达甲胎蛋白及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、甲胎蛋白和CK18及其mRNA,至诱导后期表达下降,而Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶-π和肝细胞核因子1α表达逐渐上升。Alb、CK18阳性细胞比例达60%。未诱导分化的NPMSCs不分泌Alb,诱导分化的NPMSCs以时间依赖方式产生Alb。NPMSCs诱导14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物,28 d后阳性染色细胞数量增多。结论在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后NPMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。     

内脏内胚层样END-2细胞体外诱导鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨内脏内胚层样END-2细胞体外诱导胚胎干细胞（embryon ic stem cells,ESCs）分化为心肌细胞的特征。方法用鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryon ic fibrob lasts,MEF）作为饲养层促进ESCs增殖并抑制其分化,先将ESCs悬浮培养形成23 d的拟胚体（embryoid bod ies,EBs）,再和END-2细胞共培养诱导向心肌细胞分化。实验分4组。第1,2组EBs分别和END-2细胞或END-2细胞条件培养液共培养;第3组EBs和表面铺有一层琼脂糖的END-2细胞共培养;第4组自然分化组为对照组。相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T（TnT）的表达;透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。结果各实验组均可见自发节律性收缩的拟胚体。随着培养的延长,自发节律性收缩的拟胚体数目也增加,均表达心肌细胞特异性蛋白TnT,以及观察到心肌样超微结构。在和END-2细胞直接接触的诱导条件下,分化的细胞形态较单一。结论END-2细胞通过分泌可溶性细胞因子可诱导ESCs向心肌细胞分化,直接接触在END-2细胞诱导作用中并不是必要的,但可诱导出较单一的细胞。     

胚胎干细胞体外定向分化为Ngn3+胰岛祖细胞的基因表达谱分析

目的 探讨胚胎干细胞体外定向分化为胰岛祖细胞的基因表达谱.方法 采用逐步诱导分化方案体外传代培养胚胎干细胞,应用RT-PCR和免疫细胞化学方法鉴定各分化阶段相关特异基因的表达,应用Illumina Mouse Ref-8 vl.1小鼠基因表达谱芯片测定胚胎干细胞来源的不同阶段的分化细胞(第4、8、15、20、22和25天)与未分化胚胎干细胞的基因组表达谱.结果 本研究得到了86个阶段特异性表达基因,6组具有相同表达趋势的基因簇,6组阶段差异表达基因组.从数量上看,差异表达基因最多的阶段是后前肠阶段(201个基因),接下来是定形内胚层细胞阶段(17个基因).结论 应用基因芯片对胰腺发育过程中具有相同表达趋势的基因和阶段差异表达基因的分析为早期胚胎发育和胰腺发育研究提供了试验依据.     

不同诱导条件对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 :比较小鼠胚胎干细胞 （ESC）在不同诱导条件下分化为心肌细胞的分化比率。方法 :用鼠胚成纤维细胞（MEF）作为饲养层促进 ESC增殖并抑制其分化 ,用维甲酸 （RA ）、二甲基亚砜 （DMSO）、转化生长因子β1 （TGF-β1 ）、激活素 - A（activin- A）为分化诱导剂 ,采用三步法诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,并比较各组分化比率。结果 :各组实验用的各种诱导剂均能诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,尤以 TGF- β1 （2 ng/m l）、activin- A（2 0 ng/ml）及 2 0 %胎牛血清 （FCS）组成的分化培养基可以使其分化比率高达 88% ,显著高于其它各组 （P<0 .0 1）。结论 :以 MEF饲养层培养 ,TGF- β1 、activin- A作分化诱导剂可作为一种比较简便、稳定、高效的 ESC分化条件。