表达反义N－myc基因逆转录病毒载体的构建

表达反义Ｎ－ｍｙｃ基因逆转录病毒载体的构建陈杰，刘彤华，王志永，崔全才，李和伟，郭洪涛，高洁（中国医学科学院，中国协和医科大学协和医院，北京１００７３０）关键词逆转录病毒载体；Ｎ－ｍｙｃ基因中图号Ｒ７３０．２Ｎ－ｍｙｃ癌基因是ｍｙｃ族癌基因的重要成员...     

反义及正义Vim重组逆转录病毒表达载体的构建

目的构建反义及正义波形蛋白重组逆转录病毒载体，研究波形蛋白在反应性胶质化中的功能与作用。方法应用分子克隆方法克隆、鉴定、包装并感染培养的星形胶质细胞。结果同时获得全长反义及正义Vim逆转录病毒克隆细胞株和较高滴度的病毒上清，反义Vim逆转录病毒抑制培养星形细胞的Vim表达。结论重组的反义及正义Vim逆转录病毒可用于进一步的实验研究。     

反义BMP2逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

0　引言　骨形成蛋白 (Bone Morphogenetic Protein,简称BMP) 2在骨肉瘤中有较高的表达并影响骨肉瘤的生物学活性 ,引起骨肉瘤的预后不良 .为了进一步研究 BMP2在骨肉瘤细胞中的作用机制并为探讨骨肉瘤反义核酸技术治疗的可行性 ,我们构建了反义 BMP2的逆转录病毒表达载体 .1　材料和方法1.1　材料　含 BMP2的 PSP6 4质粒由美国基因研究所 Dr.Wonzey馈赠 ,由 1.6 4kb的人 BMP2 c DNA克隆至 PSP6 4的Eco RI位点而成 .PGEM- 3Z(+ ) (2 .74kb,含 Eco RI,Smal I和 Sal I位点 )和逆转录病毒表达载体 PDOR(6 .5 kb,含Eco RI…     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

HSV1-TK逆转录病毒载体构建及表达

目的　构建含ＴＫ基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达,为肺癌基因治疗积累实验资料。方法从 ＰＨＳＶ１０６质粒中切下约２．４ｋｂ ＴＫ基因片段,插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ多克隆位点,酶切筛选正、反向连接质粒。正 向连接子电穿孔法转化肺癌细胞Ａ５４９,用ＰＣＲ、细胞原位杂交法分别检测ＴＫ基因整合和表达。结果　经酶切鉴定得到 正向连接子,电穿孔法转导Ａ５４９细胞,经Ｇ４１８筛选出了转基因细胞,ＴＫ基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了含ＴＫ基因逆转录病毒载体,转导该载体的肺癌细胞可表达ＴＫ基因。     

HSV1—TK逆转录病毒载体构建及表达

目的 构建含TK基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法 从PHSV106质粒中切下约2．4kbTK基因片段，插入逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正向连接子电穿孔法转化肺癌细胞A549，用PCR、细胞原位杂交法分别检测TK基因整合和表达。结果 经酶切鉴定得到正向连接子、电穿孔法转导A549细胞，经G418筛选出了转基因细胞，TK基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了TK基因逆转录病毒载体，转导该载体的肺癌细胞可表达TK基因。     

雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。     

MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达

目的：构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA（MDR1）,并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法：根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。 用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Western blotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果：重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60 bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDR mRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论：逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。     

小鼠Aire逆转录病毒表达载体的构建及表达

目的：将小鼠Aire基因定向连入MigR1-GFP质粒,得到长期稳定的Aire逆转录病毒表达载体,收集逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞,为研究Aire在胸腺细胞终末分化中的作用奠定基础。方法：以小鼠胸腺基质细胞的cDNA为模板扩增得到Aire的ORF片段;将该片段连接入MigR1-GFP质粒;将构建成功的Aire—MigR1-GFP质粒转染293T细胞,收集逆转录病毒上清;使用逆转录病毒上清感染胸腺基质细胞系MTEC9,流式细胞仪检测感染效率,Western blot确定Aire蛋白的表达。结果：（1）成功得到Aire的ORF片段。（2）构建的Aire逆转录病毒表达质粒能够成功表达Aire蛋白。（3）逆转录病毒上清成功感染胸腺基质细胞系MTEC9。结论：成功构建了小鼠Aire逆转录病毒表达载体,并实现了Aire蛋白在胸腺基质细胞系中的强制性表达。     

nm23H1正反义表达载体的构建

目的;构建ｎｍ２３Ｈ１正反义表达载体ｐｃ３ＡＮ和ｐｃ３ＡＭ。方法：将ｎｍ２３Ｈ１基因正,反向插入质粒ｐｃＤＮＡ３和ｐＲＣ／ＣＭＶ,并转染肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１。结果：转染正义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平增加,转染反义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平降低。结论：构建的载体能在肝癌细胞内有效表达。     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

表达人生长激素的逆转录病毒载体的构建

目的：建立一个表达人生长激素（hGH)的重组逆转录病毒载体转移系统，为下一步研究做准备工作。方法:通过重组DNA技术，用Eco R I酶切载有人生长激素的质粒pNMG3，获得约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子（mMT-1)和人生长激素（hGH)基因片段，将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN中。对阳性重组子LXSNhGH进行酶切和PCR鉴定。利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的Bam H I酶切位点双酶切，正向重组子pLXSNhGH^ 应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段；同时，应用巢式PCR鉴定目的片段，扩增片段大小约1.119kb，与预期结果相符。结果：表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功。结论：人生长激素逆转录病毒表达载体的构建成功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

EGFP-N1/hNGF β逆转录病毒载体的构建及其表达

目的 构建高表达含人神经生长因子β基因(hNGF-β)的逆转录病毒栽体,并检测其在施万细胞中的表达情况.方法 从含有hNGF-β的pAAV-SP质粒中克隆出hNGF-β,连接到pEGFP-N1载体中,形成重组逆转录病毒载体pEGFP-N1-NGFβ.用重组体转染施万细胞,经G418筛选出阳性克隆后,用ELISA法检测NGF的表达量.结果 hNGF-β的RT-PCR产物约750bp,双酶切鉴定重组载体为正确重组子.荧光显微镜下观察证实转染的施万细胞表达EGFP,ELISA检测证实转染的施万细胞分泌hNGF β升高.结论 应用体外连接法成功构建了hNGF-β逆转录病毒载体,而且施万细胞能够高效表达NGF β.     

TIMP-2逆转录病毒载体的构建及表达

目的构建人组织型基质金属蛋白酶抑制剂2（TIMP-2）编码序列基因逆转录病毒表达载体，转染人单核细胞白血病细胞株，为探讨TIMP-2的生物学功能奠定基础。方法根据基因库中已公布的序列设计引物，用PCR方法扩增出人TIMP-2编码序列基因片段，用限制性内切酶及T4连接酶将目的片段插入MSCV逆转录病毒载体中。采用酶切和PCR鉴定及测序后经脂质体介导转染至PT67包装细胞中，以病毒上清感染单核细胞白血病细胞株SHI-1，G418筛选，极限稀释法挑选单克隆细胞株，定量PCR和Western Blotting检测TIMP-2的表达。结果TIMP-2基因克隆进逆转录病毒载体MSCV中，经酶切、PCR和DNA测序证实重组逆转录病毒载体构建正确，病毒上清感染SHI-1细胞，经G418筛选并挑选出单克隆细胞，经实时定量PCR和Western Blotting检测发现SHI-1细胞中TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显上调。结论成功构建了高表达TIMP-2的SHI-1细胞，可对其生物学行为作进一步研究。     

人白介素10逆转录病毒表达载体的构建

目的构建一个人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体,为研究hIL-10的生物学活性打下基础.方法用限制性内切酶消化提取质粒pCDHIL-10中hIL-10全长cDNA,采用定向克隆的方法将hIL-10基因插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中,经转化、扩增、限制性内切酶消化,电泳鉴定分析.结果外源性hIL-10基因成功插入到逆转录病毒载体pLXSN的中.结论成功完成了人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体的构建,为今后进一步研究hIL-10的生物学活性打下了基础.     

Bcl－2和反义bcl－2逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

Ｂｃｌ－２和反义ｂｃｌ－２逆转录病毒表达载体的构建与鉴定朱峰，金明，惠宏襄，赵永同，王成济（生物化学及分子生物学教研室西安７１００３３）关键词细胞凋亡；ｂｃｌ－２基因；逆转录病毒载体中图号Ｒ７５３为了研究ｂｃｌ－２与肿瘤细胞的关系，我们构建了正义和反...