志贺菌毒力相关基因的PCR检测分析

目的：利用PCR方法对武汉地区近年来收集的17株志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况。方法：采用8对引物set1A、set1B、shet2A、shet2B、ial、ipaH、stx1与virA分别对志贺菌中毒力相关基因进行检测,结合常规鉴定方法对PCR扩增结果进行分析。结果：SHET1仅在福氏志贺菌（福氏Ⅱ型、福氏Ⅳ型）分离株（包括其标准株）中存在;SH-ET2存在于各型志贺菌（包括其标准株）;ipaH基因存在于各种类型志贺菌（包括其标准株）;17株志贺菌中,引物shet2A和引物shet2B用于检测sen基因分别检出16株和13株;ial、virA在反复复苏的菌株中检出率有所下降,stx1基因只在痢疾志贺菌中检出。结论：志贺菌快速诊断方法（PCR）中应首选检测志贺菌相关毒力基因ipaH基因。     

实时荧光PCR检测志贺菌特异基因ipaH

目的：建立一种灵敏、快速检测志贺菌的实时荧光PCR方法,研究志贺菌在腹泻病人中的感染情况。方法：针对志贺菌特异性基因ipaH设计引物、探针,应用培养分离的志贺菌进行验证,同时检测360例临床标本并与培养法进行对照。结果：应用实时荧光PCR方法,10株志贺菌检测结果均为阳性,10株非志贺菌结果均为阴性;检测灵敏度达到4 cfu/test。360例临床标本中实时荧光PCR方法检测出29例阳性,培养法检测出12例阳性。结论：实时荧光PCR法检测志贺菌具有灵敏度高、快速方便的特点,可用于检测腹泻病人志贺菌感染。     

广东省福氏志贺菌毒力基因的研究

目的对2004年广东省4个不同地区分离的35株福氏志贺菌进行毒力基因的检测,以了解其毒力基因的携带情况。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法,以志贺肠毒素1(ShET-1)基因set1、志贺肠毒素2(ShET-2)基因sen、侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)和侵袭相关位点基因(ial)为靶基因进行检测,并用set1和sen对其进行基因分型。结果35株福氏志贺菌中,有33株(94.29%)为ShET-1阳性,34株(97.14%)为ShET-2阳性,所有菌株的ipaH基因均为阳性,只有20株(57.14%)的ial基因为阳性。35株菌共分3种基因型:1株为set1(-)/sen(-),1株为set1( )/sen(-),33株为set1( )/sen( )。结论广东省的福氏志贺菌的ShET-1和ShET-2携带率非常高,set1( )/sen( )为优势基因型。     

2007-2013年贵州省志贺菌分离株毒力相关基因的 检测分析

摘要:目的　了解2007-2013年间贵州省腹泻病例志贺菌分离株毒力相关基因携带情况及流行模式,为贵州省细菌性痢疾的预防和控制提供实验依据。方法　采用PCR方法,对2007-2013年贵州省分离的178株志贺菌进行ipaH、ipaBCD、ial、sen和set1五种毒力相关基因检测,按血清型、年份和地区分析志贺菌中的毒力基因携带模式分布。结果　178株志贺菌ipaH、ipaBCD、ial、sen和set1毒力基因的阳性率分别为100%、56.2%、59.6%、59.6%和18.0%,共有12种毒力基因携带模式,命名为Ⅰ-Ⅻ,Ⅻ型是福氏志贺菌的主要毒力基因携带模式（59.6%）,Ⅷ型和Ⅰ型是宋内志贺菌的主要毒力基因携带模式（43.5%、42.0%）;2007-2013年主要毒力基因携带模式依次为Ⅷ、Ⅻ、Ⅷ、Ⅰ、Ⅷ、Ⅰ和Ⅷ型;开阳、紫云以Ⅷ型为主要携带模式（55.2%、45.5%）,平坝以Ⅻ型为主（80%）,桐梓以Ⅰ型为主（51.0%）。结论　ipaH可作为志贺菌检测的特异基因,贵州省近年志贺菌毒力基因携带模式以Ⅷ、Ⅰ型为主,血清型不同、地区不同其主要毒力基因模式分布也不相同。     

志贺菌毒力基因的多重PCR鉴定

目的：建立志贺菌肠毒素1基因（ShET-1B）、志贺菌肠毒素2基因（ShET-2）、侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）和侵袭相关基因（捌）的多重PCR鉴定方法，实现志贺菌多基因同时检测。方法：选择志贺菌的4种毒力基因作为靶基因，应用Touchdown PCR方法，在一个反应管中同时进行扩增，根据产物分子量定性判断结果。结果：多重PCR同时检测与单基因PCR分别检测4种毒力基因两种方法具有相同的灵敏度与特异性。624株志贺菌具有6种毒力基因型，571株福氏志贺菌（包括11个血清型）中556株ShET-1B阳性。结论：多重PCR鉴定志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点，适用于毒力基因鉴定和流行病学调查研究。ShET-1B基因可能广泛存在于福氏志贺菌之中。     

三基因PCR检测志贺菌方法的建立及应用

目的建立志贺菌肠毒素1基因(set1B)、肠毒素2基因(sen)和侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的三基因PCR检测方法,实现志贺菌三基因同时检测。方法选择志贺菌的3种毒力基因作为靶基因,在一个反应管中同时进行PCR扩增,根据产物分子量定性判断结果。结果三基因同时检测与单基因PCR分别检测3种毒力基因两种方法具有相同的灵敏度与特异性。62株志贺菌具有3种毒力基因型。结论三基因PCR检测志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点,适用于医院实验室作为快速诊断志贺菌的辅助技术。     

志贺菌基因分型的研究进展

随着分子生物学技术的进步,基因分型系统被广泛应用于鉴别菌株间的相关性、确定菌株遗传特征及是否是流行株等。本文就近年来常用的志贺菌基因分型方法的研究进展进行综述。     

福氏志贺菌ipaC基因的克隆及序列分析

目的：构建福氏志贺菌毒力蛋白基因（ipaC）重组表达质粒。方法：根据ipaC已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从福氏志贺菌毒力质粒上扩增出ipaC基因片段，克隆到原核表达质粒pET32a中，转化大肠埃希菌TG1感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果：ipaC基因体外扩增产物大小约为1112bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内首次克隆了福氏志贺菌ipaC基因，为下一步细菌性痢疾发病机制的研究奠定基础。     

北京地区福氏志贺菌Xv新亚型毒力基因与致病力研究

目的了解北京地区福氏志贺菌Xv新亚型生化特征、毒力基因与致病力。方法对分离自北京地区的61株福氏Xv新亚型志贺菌采用API生化板条鉴定,血清分型采用玻片凝集法,应用PCR技术检测其ipaH,sen,virF和ial毒力基因,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE )了解分型特征,以鼠肺切片检测其致病力。结果61株福氏Xv志贺菌只发酵葡萄糖、甘露醇、密二糖和阿拉伯糖;血清凝集抗原结构式为(N : 7, 8); ipaH, sen, virF和ial,毒力基因携带率分别为100%,81.97%, 75.41%和80.30%;全部菌株PFGE分型可分为25种带型,鼠肺切片显示呈炎性改变。结论福氏Xv志贺菌毒力基因携带率高,表现出遗传多态性,具有侵袭力。     

北京地区福氏志贺菌4c亚型毒力基因分析

目的 了解北京地区福氏志贺菌4 c亚型生化特征和毒力基因携带情况.方法 对分离自北京地区的44株福氏4 c亚型志贺菌采用Api生化板条进行鉴定,玻片凝集法进行血清分型,应用PCR技术对其侵袭性质检抗原(ipaH)、志贺肠毒素(setlA、setlB)、侵袭相关位点(sen、ial)和毒力表达调控基因(virF)6种毒力基因进行检测.结果 全部福氏4 c志贺菌只发酵葡萄糖、甘露醇、蜜二糖和阿拉伯糖;血清凝集抗原结构式为(Ⅳ:7,8);ipaH、setlA、setlB、sen、ial和virF6毒力基因携带率分别为100%、97.7%、100%、77.2%、72.7%和77.2%;54.5%的菌株携带全部6种毒力基因.结论 福氏4 c志贺菌毒力基因携带率高,具有较强致病性.     

沙门菌属质粒毒力基因spv的研究

沙门菌属质粒携带的spv基因是一段约8kb的高度保守的核苷酸区域,普遍存在于许多非伤寒沙门菌的一个毒力质粒上,其开放读码框由spv R、A、B、C、D、E6个基因组成,主要与细菌的毒力有关,如血清抗性、粘附与定居、沙门菌在肠外组织细胞的生长、细菌在巨噬细胞内存活和生长等。以往的研究认为,spv基因只存在于非伤寒沙门菌中,但最近发现在伤寒沙门菌耐药质粒上亦有spv。     

73株志贺菌属细菌对11种抗生素的耐药性分析

目的研究志贺菌属细菌的耐药状况及其特点。方法采用改良Kirby-Bauer纸片法对临床分离的73株志贺菌属细菌进行11种抗生素的药敏试验,并对其耐药特点进行分析。结果志贺菌属细菌对除庆大霉素以外的传统抗生素四环素、链霉素、氯霉素、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林的耐药率较高,在68.5%～86.3%之间;对头抱类性抗生素头孢噻吩的耐药率为34.2%;对不同喹诺酮类药物的耐药率在36.9%～79.5%之间,差异有显著性(P值均小于0.05);志贺菌属细菌的多重耐药率为79.5%,存在地区及菌型分布差异(P<0.05)。结论志贺菌属细菌对多种抗生素表现耐药,但存在地区和菌型差异,特别是对庆大霉素耐药率较低,可增加其临床应用;使用喹诺酮类药物治疗菌痢时,应做多种喹诺酮类药物药敏试验。     

志贺菌对氟喹诺酮的耐药机制及流行状况研究

目的：研究志贺菌对氟喹诺酮的耐药机制及其流行状况。方法：对氟喹诺酮耐药志贺菌的gyrA基因和parC基因进行扩增、测序，查找突变点；用重复基因外回文序列-聚合酶链式反应（REP-PCR）对志贺菌进行基因分型。结果：两株耐氟喹诺酮的菌株都存在gyrA基因87位Asp（GAC）→Asn（AAC）和177位Gly（GGT）→Ser（AGT）的点突变，一株另有120位Met（ATG）→Leu（CTG）、203位Ile（ATC）→Leu（CTC）、204位Ser（AGC）→Thr（ACC）和205位Ile（ATT）→Leu（CTT）的点突变，另一株还有204位Set（AGC）→Ile（AAC）的点突变。除87位点突变外，其余突变位点均未见报道。parts基因未发现点突变。REP—PCR基因分型结果提示16株宋内志贺菌有7种指纹图谱，12株福氏志贺菌有两种指纹图谱。结论：两株志贺菌对氟喹诺酮耐药是由gytA基因点突变所致，耐药表型对突变的类型有一定的预见性，但耐药程度与突变频率的相关性不确定。2004年夏秋季武汉地区散发流行的志贺菌有相同或相似的克隆，血清型单一的宋内志贺菌存在基因多样性，福氏志贺菌中f2a比f4c的遗传多样性高。REP—PCR是一种快捷有效的基因分型法，可用于志贺菌同源性分析及暴发流行时的追根溯源。     

663株志贺氏菌流行分布及耐药性变迁的实验研究

目的研究繁昌县1994~2003年志贺氏菌的流行分布及其对抗生素的耐药性变化,为相关疾病的防治提供依据。方法应用WHONET 5.3及EXCEL软件对分离的663株志贺氏菌及改良K irby-Bauwer法进行13种抗生素敏感试验的测试结果进行分析。结果B群志贺氏菌是主要的流行菌,占80.4%,最常见的血清型为2 a、1 a、1b和3 a;夏季感染率较高,秋季达到高峰;志贺氏菌对四环素、氨苄青霉素、SMZ耐药率较高,在50.0%~98.5%之间;对庆大霉素、卡那霉素、头孢唑啉、头孢呱酮、呋喃唑酮等仍较敏感,但也开始出现耐药现象;对4种喹诺酮药物随年代不同耐药率有不同程度的升高。结论志贺氏菌各群分布每年因季节不同而有所变化;志贺氏菌对多各种抗生素耐药,尤其是对庆大霉素、卡那霉素和头孢类抗生素开始出现耐药现象应引起重视。     

志贺菌诱导耐药相关基因序列分析

目的获取并分析志贺菌由抗生素诱导产生的耐多药相关基因序列。方法以志贺菌敏感株(Z23)和诱导株(YD)基因组DNA为模板,利用引物设计软件Primer 5.0根据已测得基因序列(Y16B3、Y16B8和Y16A11)设计引物,PCR扩增诱导耐多药相关基因并将相关基因克隆到pMD19-T载体上,测序并将结果在序列相似性搜索工具Blast上检索分析相关基因序列。结果Y16B3和Y16B8基因片段分别在诱导株中扩增出320和225 bp产物,在敏感株中未扩增出;而Y16A11基因片段在诱导株扩增出310 bp产物,在敏感株中扩增出554 bp产物,并且产物序列同源性极低。结论志贺菌在抗生素诱导下产生的耐多药株与敏感菌株比较,具有基因组差异。     

食品中志贺菌特异性二重PCR检测方法的研究

目的:建立二重PCR方法快速检测食品中的志贺菌(Shigella spp.)。方法:以侵袭性质粒抗原H基因ipaH和铁载体基因iuc为靶基因,筛选引物,建立二重PCR体系。对3株志贺菌和28株非志贺菌进行特异性检测。梯度稀释志贺菌基因组DNA,以不同稀释度DNA作PCR扩增。在孜然牛肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果:以ipaH、iuc为靶基因的2对引物对志贺菌的检出有很好的特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到78.73 pg。人工污染样品,当起始污染量为0.56 cfu/g时,37℃增菌培养10 h即可检出。一共检测了18份样品,未检出志贺菌,与传统方法一致。利用该方法检测了一份盲样冻干样品,检出志贺菌,与实际结果相符。结论:建立了适用于食品中志贺菌检测的特异灵敏二重PCR方法。     

Molecular studies of plasmids of multiply-resistant Shigella spp. in Hong Kong.

One hundred and two Shigella spp. isolated in two hospitals in Hong Kong were analysed for antibiotic resistances, resistance plasmids and plasmid profiles. Three quarters of the isolates were S. flexneri. All isolates harboured plasmids, up to a maximum of ten within one strain. Plasmids of 220 kb encoding resistances to tetracycline, chloramphenicol and sulphonamide and probably also associated with invasiveness in the Sereny test were found in 80 strains and were transferable in 18% of cases. Resistance plasmids of 92 and 99 kb were found in 27 and 15 strains respectively and encoded resistances to ampicillin, tetracycline, chloramphenicol, kanamycin, sulphonamide, trimethoprim, cotrimoxazole and gentamicin; these plasmids were usually transferable. Four plasmids of 3.9, 2.8, 2.2 and 1.8 kb were commonly found in S. flexneri strains, but were rare in other species. In contrast, there was no predominant plasmid profile in S. sonnei. S. flexneri is endemic in Hong Kong and these plasmid studies suggest that the strains in circulation are derived from only a few clones.     

多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌

目的建立一种能同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR检测方法。方法采用7.5%NaCl肉汤对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行增菌,同时采用GN增菌剂对食品样品中的志贺菌和沙门菌进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应(PCR)反应对食品样品中上述三种病原菌的目标基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果特异性实验表明本方法的特异性良好。对污染金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的牛奶样品进行检测,检出限为1cfu/ml。结论本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点。     

志贺菌属非典型1类整合子与耐多药关系

目的研究志贺菌属中非典型1类整合子的分布及其与耐多药性的关系。方法对实验室保存的90株志贺菌属进行8种抗生素药敏实验,针对非典型1类整合子的耐药基因盒区域设计引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增和限制性片段长度多态性(RFLP)分析,对代表性菌株进行测序分析。结果 90株志贺菌属中有86株(95.6%)对≥3种抗生素耐药;有66株(73.3%)对氨苄青霉素(AMP)、四环素(TET)和氯霉素(CHL)联合耐药;非典型1类整合子分布于65株(72.2%)志贺菌属中;RFLP分析结果表明,所有酶切产物的带型均一,测序分析发现序列为blaoxa-30-aadA1;非典型1类整合子阳性菌株对AMP-TET-CHL联合耐药率(81.5%)高于阴性菌株(52.0%),经双侧χ2检验发现差异有统计学意义(P<0.05)。结论志贺菌属非典型1类整合子阳性与其对AMP-TET-CHL联合耐药有关,可能参与耐多药性的形成。