酶解组织块法原代培养人牙周膜干细胞和牙髓干细胞

背景：酶解组织法是一种高效的原代细胞培养方法,利用该法可提高牙周膜干细胞和牙髓干细胞的培养成功率。 目的：比较牙周膜干细胞和牙髓干细胞的原代培养成功率、细胞形态、生长特征,并对其进行多种细胞标志的鉴定。 方法：取因正畸需要拔除健康牙20颗,其中16颗用于牙周膜干细胞原代培养,4颗用于牙髓干细胞培养。酶解组织块法培养两种细胞,MTT法检测两种细胞的生长曲线,利用RT-PCR法、细胞免疫组化法、细胞免疫荧光法鉴定两种细胞的标志。 结果与结论：牙髓干细胞的原代培养成功率明显高于牙周膜干细胞,显示更快的生长能力。通过酶解组织法分离纯化的两种干细胞均显示正常的细胞形态和生长特征,表达相应的细胞标志CD105,CD73,波形丝蛋白vimitin,Stro-1,不表达角蛋白CK-17和CD45。提示酶解组织块法是一种高效的原代培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞的方法。     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染...     

活体及体外条件下对角膜上皮干细胞的定位

背景：眼表存在两种形式的上皮干细胞即角膜上皮干细胞和结膜上皮干细胞,角膜上皮干细胞在角膜上皮细胞更新和角膜透明的维持方面起着重要作用。 目的：采用活体激光扫描角膜共焦显微镜和免疫荧光染色技术相结合的方法,从活体和体外层面上对角膜上皮干细胞进行定位研究。 方法：收集2009年9月至2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干细胞缺乏患者,使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼,健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘,记录扫描图像并分析。眼球材料来自于河南省眼库,切取角膜中央和角膜缘组织,组织包埋剂包被、冰冻切片,切片厚度5-7 μm;免疫荧光染色技术检测p63、ABCG2、K3和Connexin 43在角膜中央及角膜缘上皮层的表达。 结果与结论：共有24例患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏,活体激光扫描角膜共焦显微镜下患侧眼角膜病变区可见结膜细胞及杯状细胞;角膜缘区域Vogt栅栏状结构消失,色素细胞消失,取而代之的是大量纤维瘢痕化组织。免疫荧光染色示表达ABCG2和p63的细胞主要在角膜缘上皮基底层,尤其在近结膜侧的角膜缘及角膜缘中间部表达相对较高,而中央角膜上皮层细胞不表达;K3及Connexin43在角膜缘上皮基底细胞层不表达,中央角膜上皮全层表达。通过活体激光扫描角膜共焦显微镜观察及干细胞标记物检测显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘外2/3区域的Vogt栅栏基底部及钉突结构中。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

羊膜接触镜输送人表皮干细胞重建兔角膜上皮

目的 利用眼表生物膜固定装置(BMFD)与羊膜(AM)制成接触镜,输送人表皮干细胞至角膜缘干细胞缺损(LSCD)的兔眼表,并评价其重建角膜上皮的效果.方法 制作去角膜上皮及角膜缘干细胞的雌性LSCD兔模型,分为3组:羊膜加人表皮干细胞移植组(n=20),将男性人表皮干细胞悬液注射到BMFD-AM接触镜(简称羊膜接触镜)与眼表之间;羊膜遮盖组(n=20),戴羊膜接触镜;对照组(n=20),单纯药物治疗.裂隙灯显微镜结合角膜荧光素钠染色观察并评价角膜修复情况.随访至角膜完全上皮化后,取角膜组织行病理学检查和免疫组织化学鉴定,PCR检测人Y-STR基因鉴定细胞来源.结果 羊膜加人表皮干细胞移植组角膜上皮修复快,平均(5.60±0.46)d达到完全上皮化,另外两组角膜上皮修复迟缓.羊膜遮盖组(9.25±0.51)d、对照组(12.45±0.65)d才完成角膜上皮化(P均<0.05).组织病理学示羊膜加人表皮干细胞移植组角膜上皮细胞形态接近正常,K3/K12(+)、Mucin 5AC(-)、K4(-).并可检测到人Y-STR基因.组织病理学示另外两组角膜上皮结膜化,K4(+)、Mucin 5AC(+)、K3/K12(-).结论 羊膜接触镜联合人表皮干细胞悬液注射能够重建LSCD兔角膜上皮.     

用组织块法培养成年和老年鼠神经干细胞

目的　探索体外培养扩增成年及老年动物室管膜下区 (SVZ)神经干细胞的实用方法。方法　取 8、14及 2 4三个月龄SD大鼠SVZ组织块置含bFGF的DMEM/F12 +B2 7培养液培养 ,Nestin免疫组化法鉴定细胞表型。结果　各月龄的SVZ组织块均能长出Nestin阳性的神经小球及神经干细胞 ,培养 7～ 10天产生的神经球最多 ,神经干细胞状态最佳。结论　用含bFGF的培养基培养成年和老年大鼠SVZ组织块能产生较多的神经干细胞 ;此法是一种具有实用价值的培养、扩增神经干细胞的手段。     

悬浮组织块法分离培养SD 大鼠脂肪干细胞的实验研究

目的:建立SD 大鼠脂肪干细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常SD 大鼠股沟处脂肪组织,用悬浮组织块法和组织块贴壁法分离培养SD 大鼠脂肪干细胞,观察细胞的生长状况及形态特征。取第3 代对数期细胞,CCK-8 法绘制其生长曲线;免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44、CD45 的表达情况;分别用成脂、成骨诱导培养液进行诱导分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。结果:两种方法体外培养得到的SD 大鼠脂肪干细胞形态为梭形纤维样,生长力旺盛,生长曲线为典型的“S冶型;免疫荧光法检测显示第3 代细胞强表达CD29、CD44,CD45 表达阴性;细胞成脂诱导培养14 d 后,油红O 染色为阳性;成骨诱导培养14 d 后,茜素红染色为阳性。结论:悬浮组织块法可以分离培养出SD 大鼠脂肪干细胞,方法简便,为体外分离培养SD 大鼠脂肪干细胞提供了一种新的方法。     

体外培养人角膜缘上皮细胞抑制激活态角膜基质细胞的生长

背景：角膜受到损伤后,角膜基质细胞激活转变为成纤维细胞,引起角膜基质瘢痕化,导致视力下降甚至丧失。 目的：观察角膜不同部位上皮细胞与角膜基质细胞的相互作用,探索角膜缘上皮细胞群能否抑制激活态角膜基质细胞的生长。 方法：采用酶消化及机械外力相结合的方法获取人角膜中央、角膜旁中央及角膜缘处角膜上皮细胞与浅层角膜基质细胞,进行体外培养。相差显微镜下观察细胞形态及生长变化。待培养角膜上皮细胞与基质细胞发生接触抑制时,记作“0 周”,采用免疫荧光染色技术检测培养细胞中PCNA及p63蛋白的表达。 结果与结论：培养的角膜上皮细胞与成纤维细胞发生接触抑制时,两种细胞间有明显分界线。角膜缘组上皮细胞中PCNA及p63蛋白均有较高的表达;角膜旁中央组PCNA有较高的表达,p63蛋白阴性表达;角膜中央组PCNA表达较低,p63蛋白阴性表达;从鉴定结果中可以得出只有角膜缘组中存在一定比例的角膜缘上皮干细胞。角膜缘组上皮细胞逐渐包围并化解成纤维细胞,在相互作用4周后,成纤维细胞聚集成死细胞团,缺乏角膜缘干细胞的中央组及旁中央组中成纤维细胞生长面积增加,上皮细胞生长受到抑制甚至死亡。说明体外培养的角膜缘上皮细胞群可以抑制激活态角膜基质细胞的生长。     

NGF对角膜缘干细胞体外扩增的影响

目的观察神经生长因子(NGF)对体外培养角膜缘干细胞(LSCs)增殖的影响。方法体外培养LSCs,分对照组和NGF组传代培养,分别选取各组培养24 h、72 h和5 d的细胞,免疫组化检测p63,免疫荧光检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果 NGF组在24 h、72 h和5 d时间点p63表达平均灰度值明显低于对照组各个时间点(P<0.05)。而NGF组在相应的各时间点PCNA表达平均灰度值高于对照组(P<0.05)。凋亡检测显示NGF组在24 h、72 h和5 d的时间点细胞凋亡率要低于对照组的凋亡率(P<0.05)。结论 NGF可促进和维持LSCs的体外扩增和生长,降低凋亡发生,有维持LSCs干细胞特性的作用。     

结肠癌干细胞样细胞的体外培养、鉴定及n-3多不饱和脂肪酸对结肠癌干细胞样细胞的抗增殖作用

 目的:采取无血清培养法培养出SW620细胞球,并对细胞球细胞进行干细胞鉴定;在细胞水平研究n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）对结肠癌干细胞样细胞的作用。 方法: 正常培养人结肠癌细胞株SW620并使其逐步适应无血清培养条件,经无血清培养1周后收集SW620细胞球。用免疫荧光法检测胚胎干细胞标志物SSEA-1和TRA-1-81;采用real-time PCR的方法检测干细胞相关基因Sox-2和Oct-4的表达情况;对比SW620贴壁细胞和干细胞样细胞（CSCLC）在软琼脂上的克隆形成能力;采用裸鼠移植瘤模型比较2种细胞的成瘤能力;用MTS法对比2种细胞在递增浓度的5-氟尿嘧啶（5-FU）或mitomycin C处理下的生长抑制情况;用MTS法、Annexin V/PI染色和台盼蓝染色分别观察递增浓度二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）作用于SW620 CSCLC后细胞生长抑制情况、凋亡情况和死亡情况;MTS法检测5-FU或mitomycin C联合n-3 PUFAs对结肠癌CSCLC增殖的影响。 结果: 无血清培养法成功从SW620中培养出细胞球。细胞球细胞高表达SSEA-1和TRA-1-81并一过性表达Sox-2和Oct-4基因;对5-FU及mitomycin C相对抵抗;在软琼脂上克隆形成率及在裸鼠皮下的成瘤率均显著高于贴壁细胞,表明这些细胞具有干细胞特性,即为来自于SW620的CSCLC。DHA和（或）EPA作用于SW620 CSCLC能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡,并能增强5-FU及mitomycin C对其抑制作用。 结论: 无血清培养法能够从SW620细胞中培养出具有干细胞特性的细胞,它们具有高克隆形成能力及高致瘤性,对化疗药物相对抗拒;DHA和EPA能够诱导SW620来源CSCLC发生凋亡并增强化疗药物的抗肿瘤活性。     

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

背景：研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力,近年来受到广泛关注,成为种子细胞的研究热点。 目的：比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。 方法：体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊,分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞,利用反复差速贴壁法纯化细胞,定期观察细胞生长状况及形态,流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。 结果与结论：两步酶法获得的细胞生长速度快,获得的细胞量多,而组织块法获得的细胞生长速度较慢,获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。总的来说,两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞,可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Modified culture method for human corneal epithelial cells

Summary An improved procedure for the primary culture of pure human corneal epithelial cells from corneal explants is described. Confluent monolayers of epithelial cells can be consistently produced from small segments of donor corneas regardless of donor age and without feeder layers. Incubating segments on collagen at the air-liquid interface significantly improves the yield of cells per cornea and shortens cell migration time as compared to culturing on plastic. Fibroblast contamination is eliminated by serum-free medium and confirmed by indirect immunofluorescent staining for keratin.     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

Development of a novel explant culture method for the isolation of mesenchymal stem cells from human breast tumor

Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated from various sources, including various types of tumors. However choosing an appropriate isolation method is an important step in obtaining cells with optimal quality and yield in companion with economical considerations. The purpose of this study was to isolate more pure MSCs from human breast tumor tissue by a modified explant culture method.

Methods and Materials: The tumor tissues (n = 8) were cut into 1 to 3-mm cube-like pieces (explant). Each explant was placed in a well of 24-well format plates, cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM), and maintained at 37°C with 5% humidified incubator. Morphological phenotypes of the cells were surveyed by an inverted microscope and wells with rather homogenous fibroblast-like morphology cell were considered as positive and selected for more expansion and characterization.

Results: A total of 185 wells, 63.7% of wells were positive that were chosen for expansion. Flowcytometry analysis demonstrated that isolated cells were positive for CD73, CD44, CD29, CD105, and CD90 but negative for CD11b, CD45, CD34, and HLA?DR. In addition, cells possessed the capability of multipotential differentiation into osteoblasts and adipocytes.     

Corneal epithelial stem cells in health and disease

The cornea on the front surface of the eye provides our window to the world. Maintenance of corneal transparency is dependent on the integrity and functionality of the outermost corneal epithelium which itself is maintained throughout life by a population of limbal epithelial stem cells (LESC). If this adult stem cell population is depleted by injury or disease, the transparency of the cornea and therefore vision is threatened. LESC deficiency results in corneal opacification, inflammation, vascularization, and severe discomfort. Cultured LESC therapy is one of only several examples of the successful use of an adult stem cell therapy in patients. Hence, the ready accessibility of a transparent stem cell niche and the clinical precedence for use of stem cell therapy make the cornea a unique and excellent model for the study of adult stem cells in health and disease. This review will discuss our current understanding of LESC biology, pathology, and therapeutic application.     

大鼠精原干细胞的筛选与培养

目的:建立大鼠精原干细胞的筛选和培养的方法体系。方法:采用改良的二步酶消化法分离大鼠睾丸细胞,用改进的差异贴壁分选法筛选大鼠精原干细胞,用添加了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、可溶性GFRα1和bFGF的DMEM/F12无血清培养基和大鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养高度富集的大鼠精原干细胞,通过形态观察、标志基因的RT-PCR检测和免疫细胞化学分析鉴定培养细胞的干细胞活性。结果:我们的改良二步酶消化法和差异贴壁分选法能有效的分离和筛选大鼠精原干细胞,这些高度富集的精原干细胞能够存活20 d以上,形成较大的干细胞克隆,并表达精原干细胞的标志基因和具有干细胞活性。结论:成功建立了大鼠精原干细胞的分离、筛选和培养体系。     

Cultivation of epithelial cells from human uterine ectocervix

Summary Epithelial cells of the uterine ectocervix can be cultured directly from fresh biopsy samples as explant cultures, free of contaminating fibroblasts. Alternatively, tissue samples can be dissociated with a combination of proteases to establish primary cultures of epithelial cells. Primary cultures can be subcultured at least three times resulting in up to 20 population doublings.     

无血清培养促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化

背景：无血清培养对大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化影响的报道甚少。 目的：观察无血清培养大鼠脂肪干细胞后向血管内皮细胞诱导分化的情况。 方法：采用酶消贴壁培养法获得雄性SD大鼠脂肪干细胞,传代培养至第3代。实验组细胞无血清培养24 h,对照组用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养。然后应用血管内皮细胞诱导培养基培养3周。 结果与结论：大鼠脂肪干细胞经体外培养可呈多角形或梭形贴壁生长,并能稳定传代。传代后大鼠脂肪干细胞极低表达细胞表面标志CD31。大鼠脂肪干细胞定向血管内皮细胞诱导分化后细胞呈鹅卵石样,CD31阳性表达明显上升且实验组明显高于对照组。实验组诱导后大鼠脂肪干细胞能够吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白及在基质胶上形成2D小管样结构,其能力明显强于对照组。结果证实无血清培养可促进体外大鼠脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化。     

脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。 目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。 方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用MTT比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。 结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

密度梯度离心法结合贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的 研究密度梯度离心法结合贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)及不同首次换液时间对细胞增殖的影响,探索一种简单易行、扩增效率高的方法。方法 3月龄雄性SD大鼠提取原代BMSCs,密度梯度离心法结合贴壁法分离培养,并应用3组不同首次半量换液时间(24h,48h,72h)进行培养传代,测定生长曲线和细胞的存活率;免疫细胞化学染色分析细胞表面抗原CD44和CD166的表达。结果 分离的BMSCs48h后细胞完全贴壁生长,呈形态均一的纺锤形单核细胞状,第3代细胞培养1w后呈长梭型,呈平行排列生长。48h半量换液组细胞增殖活性及生存率最高,其次为24h和72h组;表面标志物CD44和CD166均呈阳性。结论 联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法可成功分离BMSCs,且效率高、纯度高,48h首次半量换液更适合BMSCs的生长繁殖。