信号转导和转录激活因子基因表达的抑制及其对HepG_2细胞增殖的影响

目的探讨应用RNAi技术沉默信号转导和转录激活因子(STAT3)基因对肝癌HepG2细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(SiRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞。通过半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测STAT3基因mRNA和蛋白水平的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染后细胞增殖的变化。结果成功构建了pGeneSil 1-shRNA-STAT3重组质粒,并转染HepG2肝癌细胞;半定量RT-PCR、Western blot结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在mRNA及蛋白水平上显著低于对照组;MTT实验结果显示,重组质粒转染组细胞的增殖明显受到抑制。结论pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3转染HepG2肝癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制肝癌细胞的生长及增殖。     

SP-D基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建并鉴定含肺表面活性蛋白D(SP-D)基因的重组真核表达质粒。方法提取A549细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增含SP-D基因的cDNA,将产物克隆进真核载体pGEFP-N1内,构建含SP-D基因的重组真核表达质粒。将pGEFP-N1-SP-D重组质粒和pGEFP-N1空载体分别转染293T细胞,Western blot法检测SP-D的蛋白表达。结果双酶切鉴定及核酸序列分析证实,SP-D已成功插入真核载体pGEFP-N1内。转染pGEFP-N1-SP-D的293T细胞中检测到高表达的SP-D蛋白。结论成功构建含SP-D基因的重组真核表达质粒,并能在293T细胞中高表达。     

E2F1基因真核表达载体的构建及其对CD2 AP启动子的影响

目的构建E2F1基因真核表达质粒,并初步探讨E2F1对CD2相关蛋白(CD2AP)启动子的作用。方法 RT-PCR扩增E2F1基因,构建含E2F1基因的重组真核表达质粒,重组质粒转染人胚肾HEK-293细胞。Western blot检测E2F1蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测E2F1过表达后人CD2AP启动子的活性。结果核酸序列分析及Western blot结果证实,成功构建含E2F1基因的重组真核表达质粒;过表达E2F1能增强CD2AP启动子的活性。结论 E2F1编码基因在HEK-293细胞中获得正确表达,且E2F1蛋白可促进人CD2AP启动子的转录活性。     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。     

真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。     

ZNF300基因在肝癌耐药细胞HepG2/VCR中的表达及功能初探

目的建立人肝癌HepG2/VCR耐药细胞株,检测ZNF300基因在HepG2/VCR中的表达并初步分析其在肝癌多药耐药(MDR)中发挥的功能。方法采用体外低浓度梯度递增的诱导方法建立长春新碱(VCR)获得性HepG2/VCR耐药细胞株。MTT法检测确定HepG2/VCR耐药细胞株对VCR的耐药性,用Western blot方法检测人锌指蛋白ZNF300基因编码的ZNF300及多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)在HepG2和HepG2/VCR细胞中的表达差异;在HepG2/VCR细胞中转染ZNF300基因正向或反向cDNA质粒后,MTT法检测VCR对耐药细胞IC50值的变化,Westernblot方法检测细胞内P-gp表达的影响。结果 MTT检测确认HepG2/VCR耐药细胞构建成功,Western blot检测发现耐药细胞中ZNF300及P-gp的表达相对于HepG2细胞明显增高。在HepG2/VCR细胞中转染正向ZNF300 cDNA质粒后,MTT和Western blot检测发现ZNF300过表达可使VCR对耐药细胞的IC50值增高,并使细胞内P-gp表达上调;在转染反向cDNA质粒Knockdown ZNF300基因表达后得到相反的结果。结论 ZNF300基因在HepG2/VCR耐药细胞中表达明显增高,并能通过上调耐药蛋白P-gp的表达促进肝癌细胞耐药性,可以作为逆转肝癌多药耐药的分子作用靶点。     

靶向性发夹状RNA对卵巢癌SKOV3细胞H-ras基因表达的影响

目的运用构建的小发夹状RNA重组质粒pshRNA/H-ras,研究其对卵巢癌SK-OV3细胞株内源H-ras基因的抑制作用。方法应用基因克隆技术,设计含21bp H-ras基因编码序列片段及中间以4~5个bp间隔的反向重复序列,克隆至转录载体pTZU6 1上并行序列分析。转染重组质粒pshRNA/H-ras至SKOV3细胞中,分别采用RT-PCR、Western blot检测细胞内H-rasmRNA和蛋白表达的变化。结果成功构建发夹状RNA载体,经DNA序列鉴定为正确的目的序列。RT-PCR和Western blot结果表明,重组质粒pshRNA/H-ras1和pshRNA/H-ras2均能在基因转录水平和蛋白表达水平上明显抑制SKOV3细胞内源H-ras蛋白的表达,抑制率达67%以上。结论重组质粒pshRNA/H-ras可显著抑制SKOV3细胞内源H-ras基因mRNA的转录和相应蛋白质的表达,为进一步研究H-ras基因在卵巢癌细胞异常增殖中的作用打下基础。     

稳定表达EGFR胞外区的NIH3T3细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外区(EGFRex)的NIH3T3细胞株。方法构建带有EGFRex基因的重组真核表达质粒PLNCX2-EGFRex,经脂质体法转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,用免疫组化和蛋白质印迹(Western blot)检测EGFRex蛋白的表达,用EGF-EGFP蛋白检测其活性。结果成功构建了真核表达载体PLNCX2-EGFRex。以其转染NIH3T3细胞后,经免疫组化和Western blot检测到EGFRex的表达。在荧光显微镜下见细胞膜上有绿色荧光。结论人EGFRex在NIH3T3细胞内以其天然活性形式稳定表达,为抗体制备奠定了基础。     

Regulation of CMV promoter‐driven exogenous gene expression with doxorubicin in genetically modified cells

The regulation of gene expression after the introduction of an exogenous gene is a problematic aspect of gene therapy. The purpose of this study was to use doxorubicin to regulate exogenous gene expression in a vector containing the cytomegalovirus (CMV) promoter. The pQBI25 vector, which encodes the CMV promoter and the cDNA for red‐shifted green fluorescent protein (rsGFP), was transfected into a rat skin fibroblast cell line (FR cells). The pEGFP vector, encoding the CMV promoter and enhanced green fluorescent protein (EGFP) cDNA, was transfected into human hepatoma HepG2 cells. FR‐pQBI25 cells were then continuously exposed to doxorubicin and methotrexate for 96 and 48 h, respectively; HepG2‐pEGFP cells were continuously exposed to doxorubicin for 48 h. The levels of c‐fos, c‐jun and rsGFP mRNA, as well as the levels of rsGFP protein, in the FR‐pQBI25 cells were found to be significantly higher following exposure to doxorubicin. However, the level of rsGFP protein was not changed by exposure to methotrexate. The level of EGFP protein in the HepG2‐pEGFP cells was also significantly higher following exposure to doxorubicin. To examine the effect of cessation of doxorubicin exposure, FR‐pQBI25 cells that had been exposed to doxorubicin for 48 h were re‐plated in fresh medium without doxorubicin for a further 48 h. The increased levels of c‐fos, c‐jun and rsGFP mRNA and rsGFP protein seen after treatment with doxorubicin had reduced by 48 h after the cessation of exposure to doxorubicin. These findings suggest that CMV‐driven exogenous gene expression may be regulated by doxorubicin.     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

靶向survivin的siRNA对肝癌HepG2细胞增殖和转移能力的影响

目的探讨针对人survivin基因的siRNA对肝癌细胞HepG2的体内外抑制作用。方法合成survivin基因的RNA干涉（RNA interferance,RNAi）特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染HepG2细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过AnnexinV法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下HepG2移植瘤的形成。结果成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞HepG2／pSiS。与HepG2、HepG2／pSi（空质粒对照细胞）相比,HepG2／pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义（P〈0．01）;Westernblotting显示,HepG2／pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加（P〈0．01）。HepG2／pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论Survivin特异性siRNA可明显促进肝癌细胞HepG2的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。     

新型阳离子聚合物非病毒载体介导野生型p53基因体外转染效果的研究

目的:研究新型阳离子聚合物非病毒载体———尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因体外转染人肝癌细胞系HepG2的效果。方法:载体UAC包裹含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因和wt-p53治疗基因的质粒(pEGFP-p53)转染HepG2细胞,利用流式细胞术和荧光显微术检测细胞内GFP的表达,优选最佳转染条件;采用RT-PCR法检测细胞内p53mRNA的表达,流式细胞术评价基因转染对细胞周期的影响,Western blot法检测细胞内p53及其下游细胞周期调控蛋白的表达。结果:在低pH(pH=6.9)条件下,采用低壳聚糖分子量(20000)的UAC作为载体,与pEGFP-p53形成高N/P(N/P=30)的UAC/pEGFP-p53复合物转染HepG2细胞,可获得最佳转染效果;载体UAC介导wt-p53基因转染细胞后,p53mRNA表达水平明显上调,G0/G1期出现显著阻滞,p53、p21和Rb蛋白表达水平明显上调,cyclin D1和CDK4蛋白表达水平明显下调。结论:载体UAC可成功介导wt-p53基因转染HepG2细胞,并诱导其产生细胞周期阻滞。     

人的核糖体蛋白S3a基因克隆、表达、纯化与亚细胞定位

目的克隆人核糖体蛋白S3a（Ribosomal protein S3a,RPS3a）基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21（DE3）中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni~（2＋）-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础     

慢病毒介导的microRNA-155过表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响

摘要： 目的 通过构建慢病毒 （LV） 介导的miRNA-155 （miR-155） 过表达载体， 探讨上调miR-155对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。方法 针对目标序列合成特异性miR-155过表达片段并克隆入慢病毒载体pGCSHL-GFP， 将重组miR-155-hRNA-LV和阴性对照空病毒载体转染HepG2细胞， 建立稳定过表达miR-155的细胞系。细胞设过表达组 （H组）、 阴性对照组 （negative control， NC组） 和正常组 （normal， N组）。实时荧光聚合酶链式反应 （qRT-PCR） 方法检测各组miR-155和PTEN的表达水平； Western blot检测各组PTEN、 CyclinD1、 CyclinA1+A2蛋白表达情况； 细胞增殖-毒性检测 （CCK-8） 细胞增殖情况。结果 H组miR-155表达量明显高于其NC组及N组， 靶基因PTEN的表达量低于NC组及N组 （均P＜0.05）。H组PTEN蛋白的表达量明显低于NC组和N组， 而CyclinD1、 CyclingA1+A2蛋白的表达量明显高于NC组和N组 （均P＜0.05）。CCK-8结果显示3组12 h时吸光度值开始出现差异， 24 h、 48 h、 72 h H 组吸光度值均明显大于NC组和N组 （P＜0.05）， 但后2组差异无统计学意义。结论 过表达miR-155可促进肝癌细胞系HepG2细胞增殖。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

Nucleophosmin基因表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的克隆Nucleophosmin(NPM)的编码序列,构建含Nucleophosmin基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌多药耐药中的作用奠定基础。方法根据已发表的Nucleophosmin基因的核苷酸序列设计合成一对引物,以人乳腺癌组织抽提的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,用限制性内切酶酶切重组质粒pEGFP/NPM和DNA序列测定进行鉴定。用脂质体法将pEGFP/NPM导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组织化学法和RT-PCR鉴定其表达。结果 RT-PCR扩增出长894bp的特异性片段,经克隆至pEGFP-N1后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pEGFP/NPM在HepG2细胞中有稳定表达。结论成功克隆了NPM的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pEGFP/NPM/1,有助于对NPM基因在肝癌多药耐药中的机制做进一步研究。     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及稳定感染HepG2单克隆细胞株的建立

目的 构建PRL -3基因RNA干扰慢病毒载体并建立被稳定感染的HepG2单克隆细胞株.方法 设计PRL -3基因特异性RNAi靶序列,合成靶序列的DNA oligo,退火形成双链DNA,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL- GFP线性化载体连接,产生重组慢病毒质粒LV - PRL3 - siRNA,转化感受...