WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因真核表达载体的构建

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,为进一步研究打下基础。方法以Hela细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pCDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,并用酶切分析和序列测定进行鉴定。结果经酶切鉴定和测序证实,人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)。结论真核表达质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1的构建为今后的研究打下了基础。     

增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白与人肝细胞生长因子基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法:在HGF两端设计并合成分别带有Sac I和BamH I两酶切位点的一对引物,对pcDNA3.0-HGF载体进行PCR扩增,将扩增出的目的基因与pMD18-T载体相连,并转化大肠肝菌,进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆.用Sac I和BamH I将目的片段用双酶切切下后,纯化提取凝胶中的目的DNA片断,然后插入pIRES-EGFP相应的酶切位点,构建pIRES-EGFP/HGF真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体法转染至人脐带血管内皮细胞(HUVEC)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达及Western blotting检测HGF的表达情况.结果:重组克隆载体内的目的片段序列与GENE BANK上报道的HGF基因序列完全一致.pIRES-EGFP/HGF酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blotting结果表明HGF基因得到了有效表达.结论:本实验成功构建EGFP和HGF真核共表达载体并可在真核细胞中有效表达.     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

人resistin基因原核表达载体构建和表达

【目的】构建人resistin基因原核表达载体并观察其表达，为开展对resistin的研究打下实验基础。【方法】酚氯仿一步法从一位2型糖尿病合并胆管癌患腹壁皮下脂肪组织抽取总RNA，RT-PCR法扩增出resistin基因cDNA，经测序后，PCR产物亚克隆入 T载体，用EcoR I和Kpn I分别酶切重组T质粒和原核表达载体pGENKS，然后resistin基因片段和表达载体通过T4DNA连接酶进行定向连接，用核酸内切酶EcoR I、KpnI酶切和测序方法鉴定出重组表达质粒。重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，经1mmol／LIPTG在32℃诱导表达2h，裂解细菌，进行PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp，序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后，从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoR I和Kpn I双酶切后能产生出327bp、4980bp大小的两个片段，序列分析表明重组表达质粒包含人resistin基因完整编码区，基因编码无移位，PAGE凝胶电泳表明在细菌裂解上清有分子质量为39．5kD的融合蛋白。【结论】成功构建了人resistin基因原核表达载体，且构建的载体能表达出含目的蛋白的融合蛋白，为下一步研究打下了实验基础。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

[目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

结核杆菌Ag85B的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的通过结核杆菌Ag85B基因的克隆和在大肠杆菌表达的研究,探讨Ag85B蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性。方法用PCR技术,扩增人结核杆菌Edman株Ag85B基因序列,并将扩增的DNA片段插入克隆质粒载体pUC18,用质粒酶谱和DNA序列分析鉴定重组克隆。克隆的Ag85B基因插入原核表达质粒pBV220,构建重组Ag85B表达质粒,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠杆菌表达的重组蛋白。结果成功克隆了结核杆菌Ag85B基因,构建了Ag85B的原核表达载体,获得了高效表达菌株,目的蛋白的表达量达菌体总蛋白的25％～30％。结论获得了高效表达人结核杆菌Ag85B成熟蛋白的工程菌株,为Ag85B保护性抗原位点分析和新型结核疫苗的研制奠定了基础。     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

hVEGF165和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达

目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达.方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0.对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定.结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达.结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础.     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

抵抗素体外对胆管癌细胞侵袭和转移的影响及其机制

目的:观察重组人抵抗素(resistin)对胆管癌细胞系QBC939增殖、侵袭、转移及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。方法:分别采用噻唑蓝(MTT)比色法、Matrigel侵袭实验和迁移实验检测不同浓度的抵抗素对QBC939细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot检测抵抗素对QBC939细胞内MMP-2蛋白表达的影响。结果:当抵抗素浓度高于10 ng/ml时,对QBC939细胞增殖具有明显的促进作用(P<0.01),并呈一定的剂量依赖性;经10、50、100 ng/ml抵抗素处理24 h后,QBC939细胞体外侵袭及迁移能力均较空白对照组明显增强(P<0.01);Western blot法检测抵抗素作用QBC939细胞24 h后MMP-2表达水平显著增加。结论:抵抗素对人胆管癌QBC939细胞的侵袭和转移能力有明显的促进作用,该作用机制可能与提高MMP-2表达水平有关。     

腺病毒介导的p53对胆管癌细胞生长的抑制作用

目的 研究Ｐ５３基因对胆癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒Ｐ５３转移到人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９,用ＲＴ－ＰＣＲ、克隆形成实验、流式细胞仪、ＤＮＡ片段化分析等方法对Ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ａｄ－ＬａｃＺ进行重组体腺病毒转导致率的检测,发现当ＭＯＩ为１００以上时,重组体腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９,细胞被传导,用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测,在胆管癌ＱＢＣ９     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

过表达miR-29b可抑制胆管癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡

目的研究miR-29b在胆管癌中的表达情况,及其对胆管癌细胞QBC939增殖和凋亡的影响。方法Real-time PCR检测 miR-29b在胆管癌细胞QBC939与良性胆管细胞株H-69中的表达;及胆管癌组织与正常胆管组织中的表达。将对数生长期的 QBC939细胞分为3组,空白对照组,阴性对照组,miR-29b过表达组。MTT和细胞克隆形成实验分别检测过表达miR-29b对细 胞增殖和克隆形成率的影响;流式细胞术检测过表达miR-29b对细胞周期和凋亡的影响。结果miR-29b在胆管癌细胞及胆管 癌组织中表达较正常胆管细胞和组织中均显著降低（P<0.01）。miR-29b过表达组QBC939细胞的miR-29b较阴性对照组表达 明显升高（P<0.01）。在QBC939细胞中,过表达miR-29b可以显著抑制细胞的增殖和克隆形成（P<0.01和P<0.05）;过表达miR- 29b可阻滞细胞在S期（P<0.05）,并且导致细胞凋亡明显增加（P<0.01）。结论miR-29b作为一种抑癌microRNA,在胆管癌中 低表达,过表达miR-29b可以抑制胆管癌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：研究ｐ５３基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒ｐ５３和顺铂联合作用于人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９，对ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ａｄ－ＬａｃＺ进行复组腺病毒转导效率的检测，发现当ＭＯＩ为１００以上时，重组腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９细胞被传导，用ＲＴ－ＰＣＲ方法，在胆管癌ＱＢＣ３９细胞系中ｐ５３无表达。重组体腺病毒能介导外源基     

内脂素对人胆管癌细胞QBC939侵袭及增殖影响的体外研究

目的:研究人内脂素(visfatin)对胆管癌细胞QBC939体外增殖和侵袭能力的影响,并初步探讨可能存在的机制.方法:培养胆管癌细胞QBC939,在不同浓度的内脂素作用不同时间后,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力,用Transwell小室检测内脂素(200ng/ml)24 h后对胆管癌QBC939细胞侵袭...     

Effect of ligand pioglitazone activating PPAR-gamma on the invasiveness of cholangiocarcinoma cell in vitro and the expression regulation of related genes]

OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of ligand pioglitazone (PGZ) activating PPAR-gamma on the invasiveness of cholangiocarcinoma cell in vitro. METHODS: Human hilar cholangiocarcinoma cell line QBC939 was selected and cultured in vitro for this research. The rate of QBC939 cell growth inhibition was detected by MTT, and the influence of PGZ on the expression of MMP-7 mRNA and TIMP-1 mRNA was measured by using FQ-PCR. The in vitro invasiveness and mobility of QBC939 were quantified by Matrigel invasion assay and crossing-river test. RESULTS: Among the low concentration (5 micromol/L-40 micromol/L) groups at the point of 12-hours, PGZ did not show to inhibit significantly the growth of QBC939 cells (P>0. 05). However, the PGZ could down-regulate the expression of MMP-7 mRNA in QBC939 cells (P<0. 01), and up-regulate the TIMP-1 mRNA expression to be without obvious statistics significance (P>0. 05). At last, PGZ could reduce the number of QBC939 cell breaking through the matrigel and prolonging the time of crossing-river significantly (P< 0. 01) in a dose-dependent manner. CONCLUSION: For ligand PGZ to activate PPAR-gamma can inhibit the invasiveness of QBC939 cells in vitro via regulating the expression of MMP-7 and the mobility of QBC939 cells probably.