TNF-α对大鼠Leydig细胞的作用及机制研究

目的观察TNF-α对睾丸细胞功能的影响并探讨其可能机制。方法通过Percoll不连续密度梯度分离获取大鼠Leydig细胞进行原代培养。HE染色进行细胞形态学观察。Leydig细胞培养48h后在培养液中分别加入不同浓度的大鼠TNF-α,使其终浓度达到0.1、1、10、100ng/ml,分别在培养的第1、2、3、4天取上清,通过放免法测定上清液中睾酮的含量,应用MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞术与丫啶橙(AO)染色检测及观察Leydig细胞凋亡情况。结果原代细胞通过提纯后的细胞纯度可达70%~80%。HE染色后可见细胞胞质含量丰富,含有分泌颗粒,胞核圆。TNF-α在0.1~100ng/ml浓度范围内能呈剂量依赖的方式抑制Leydig细胞睾酮的基础分泌。0.1、1、10、100ng/mlTNF-α作用24h后,对Leydig细胞睾酮分泌量的抑制率分别为22.03%、34.98%、52.95%、74.83%。各组Leydig细胞睾酮的分泌量随时间延长呈减少的趋势,但除100ng/ml组外,其他各组各时间点比较差异无统计学意义。高浓度TNF-α(10、100ng/ml)组具有抑制Leydig细胞增殖和促进其凋亡作用,其增殖抑制率分别达到38.35%±4.17%、76.35%±8.65%,而凋亡率分别为13.23%±1.11%、26.43%±5.82%,与对照组比较有统计学意义(P<0.01)。AO染色见高浓度TNF-α(10、100ng/ml)组出现明显的细胞凋亡。结论TNF-α对Leydig细胞睾酮的基础分泌具有抑制作用,在较高浓度时该作用可能与其抑制Leydig细胞增殖并促进细胞凋亡有相关。     

地高辛对人B细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制的研究

目的通过观察强心甾类药物地高辛对人B细胞淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的影响,研究其可能的分子机制。方法体外培养Raji细胞,实验组细胞培养基中加入二甲基亚砜溶解的地高辛,分别以不同浓度地高辛对其进行干预;对照组细胞培养基中加入与实验组等体积的二甲基亚砜。通过四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖的变化,流式细胞术检测其对细胞周期的影响及细胞凋亡情况,反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析细胞内Survivin、Caspase-3 mRNA的变化。结果地高辛体外对Raji细胞增殖具有明显的抑制作用(P<0.05),在一定范围内与时间、剂量呈依赖关系。实验组地高辛作用于Raji细胞48 h后,与对照组相比,G0/G1期细胞数减少,G2/M期细胞数增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组出现明显的凋亡峰,对照组未见凋亡峰,或仅有低平的凋亡峰。与对照组相比,Raji细胞中Survivin mRNA的表达减少,Caspase-3 mRNA的表达增加(P<0.05),并与剂量呈依赖关系。结论地高辛对Raji细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用,通过阻滞细胞于G2/M期,抑制Raji细胞的增殖,通过下调Survivin的表达进而激活Caspase-3诱导其凋亡,此可能为地高辛抗肿瘤作用的机制之一。     

雷公藤内酯醇对胆囊癌GBC-SD细胞株增殖与凋亡的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇(TP)对体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞株增殖和凋亡的影响.方法 体外培养的人胆囊癌GBC-SD细胞,分别加入0、5、10、20、50、100ng/ml(终浓度)TP,24、48、72h后采用MTT测定细胞生长抑制率,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布情况.结果 随剂量增加和作用时间延长,TP对GBC-SD的增殖抑制作用增强.TP不仅能引起细胞形态的变化,而且能诱导GBC-SD细胞凋亡,改变细胞周期分布.结论 TP能诱导胆囊癌细胞凋亡,并抑制其增殖,从而发挥抗肿瘤作用.     

葛根素对火药烟雾诱导支气管上皮细胞凋亡的防护作用

目的 探讨葛根素对火药烟雾诱导的支气管上皮细胞(BEAS-2B)凋亡的保护作用及其机制.方法 体外培养BEAS-2B细胞,随机分为对照组(不加任何干预)、烟熏组(火药烟雾4g,作用10min)、烟熏+葛根素组(12.5、25、50、100μg/ml).细胞接种12h后加入葛根素,继续培养至24h后烟雾作用10min,继续培养2h后进行检测.采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,流式细胞仪检测Annexin V-PI双染细胞及caspase-3阳性率.结果 与对照组相比,烟熏组BEAS-2B细胞活力明显下降(P＜0.01),不同浓度葛根素能够不同程度地对抗烟熏的作用,其最佳保护浓度为25μg/ml.与烟熏组相比,烟熏+葛根素组Hoechst染色细胞凋亡率、Annexin V-PI双染细胞凋亡率及caspase-3阳性率均明显降低(P＜0.05,P＜0.01).结论 火药烟雾可致体外BEAS-2B细胞凋亡,而葛根素对火药烟雾诱导的BEAS-2B气管上皮细胞凋亡具有一定防护作用.     

低频超声联合苦参素对人卵巢癌OVCAR-3细胞生物学特性影响

目的研究低频超声和苦参素联合应用对人卵巢癌OVCAR-3细胞生物学行为的影响。方法培养人卵巢癌OVCAR-3细胞,采用随机分组分为4组:对照组、低频超声组、苦参素组和联合组(低频超声+苦参素)。分别给予如下处理:低频超声组为超声840 k Hz,0.75 W/cm~2×3 min辐照;苦参素组为药物浓度为10 mg/ml培养24 h;联合组叠加处理因素。应用CCK-8检测各组细胞增殖;流式细胞仪检测各组细胞凋亡;Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果单独应用低频超声或苦参素均可抑制OVCAR-3细胞增殖、诱导细胞凋亡、促进细胞侵袭。与单独应用组相比,低频超声和苦参素联合,上述作用显著增强。结论低频超声可增强苦参素诱导的抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭能力以及诱发凋亡的作用。     

肌卫星细胞体外培养及其对胰岛素样生长因子Ⅰ刺激的反应

目的原代分离、纯化、培养大鼠肌卫星细胞，观察体外培养肌卫星细胞的增殖与分化特性及对类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）刺激的反应。方法选用Wistar大鼠，切取双下肢及背部肌肉，两步酶消化法分离卫星细胞，不连续密度梯度离心法纯化后体外培养，观察其生长与分化特性，绘制生长曲线及融合率曲线，MTT法测定卫星细胞对不同浓度IGF-Ⅰ刺激的反应，并对其生长分数及融合率给予观察。结果此方法可以获得足量、纯度较高的肌卫星细胞。结论适宜浓度（100ng／ml）的IGF-Ⅰ对肌卫星细胞有较强的促增殖及促分化作用。     

雷公藤内酯醇对人宫颈癌CaSki细胞株的体外作用研究

目的探讨雷公藤内酯醇(TPL)对人宫颈癌CaSki细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT比色法检测不同浓度(0、5、10、20ng/ml)TPL作用24、48、72h后对CaSki细胞增殖的影响,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,细胞免疫化学法检测Ki-67及p53蛋白表达的改变。结果倒置相差显微镜观察可见TPL处理后细胞皱缩变圆变粗糙,体积缩小,且不断地脱落悬浮于培养液中,数量减少,细胞间隙增大,且随药物浓度增加及作用时间延长,这种变化趋于明显。5、10、20ng/ml TPL在体外对CaSki细胞的生长具有抑制作用,且呈剂量、时间依赖方式(P<0.01)。免疫细胞化学检测显示TPL作用后CaSki细胞Ki-67及p53蛋白表达下调,且呈剂量、时间依赖方式(P<0.01)。结论 TPL可抑制CaSki细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制癌细胞Ki-67及p53蛋白表达有关。     

超小超顺磁性氧化铁微粒对神经干细胞生物学活性的影响

目的应用超小超顺磁性氧化铁微粒Sinerem标记大鼠骨髓源性神经干细胞（NSCs），探讨Sinerem的安全性及合适的标记浓度。方法分离、培养大鼠骨髓源性NSCs。制备Sinerem多聚赖氨酸复合物，以不同浓度Sinerem对细胞进行标记。普鲁士蓝染色和电镜观察细胞内铁，CCK-8法检测细胞生长增殖情况，AnnexinV—PI法检测细胞凋亡及死亡情况。结果普鲁士蓝染色显示细胞质内大量铁颗粒存在，标记率在99％以上。电镜观察见Sinerem标记干细胞内含纳米铁颗粒。CCK-8法检测结果表明，25～1500μg/ml不同浓度范围的Sinerem对细胞增殖的影响差异无统计学意义。AnnexinV—PI检测结果显示，Sinerem在25～200μg/ml范围内的不同浓度对细胞凋亡和死亡的影响差异无统计学意义。结论超小超顺磁性氧化铁微粒Sinerem可以有效标记大鼠骨髓源性NSCs，可以应用25～200μg／ml浓度范围的Sinerem标记细胞。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌细胞增殖的抑制作用研究

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 采用不同浓度(0、25、50、100、200、400mg/L)EGCG作用于HepG2细胞,于24、48h后采用MTT方法检测细胞增殖抑制率.以不同浓度(0、50、100、200mg/L)EGCG作用于HepG2细胞,24h后采用流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期、细胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)及Smad3蛋白的表达,RT-PCR检测CDC25A和Smad3 mRNA的表达.结果 MTT检测结果显示,不同浓度EGCG对HepG2细胞均有生长抑制作用,且具有时间和剂量依赖性(P＜0.01).随着EGCG浓度升高,细胞增殖指数(PI)明显降低(P＜0.01),细胞凋亡率明显增高(p＜0.01),CDC25A蛋白和mRNA表达水平下降(p＜0.05),Smad3蛋白和mRNA表达水平上升(p＜0.05).结论 EGCG可能通过下调CDC25A、上调Smad3的表达,抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,从而对肝癌细胞起到生长抑制作用.     

大负荷运动及其恢复期间大鼠骨骼肌超微结构及MGF的变化

目的:观察大负荷运动及其恢复期间大鼠骨骼肌超微结构及机械生长因子(MGF)的变化。方法:36只8周龄健康雄性SD大鼠随机分为6组,每组6只:安静对照组(C组)和力竭运动后即刻组(E0组)、12h组(E12组)、24h组(E24组)、48h组(E48组)、72h组(E72组)。各力竭运动组尾部负重为3%体重,进行1周负重力竭性游泳运动,每天1次,并于末次力竭后不同时间点取材。采用ELISA方法检测大鼠血清及腓肠肌MGF表达,电镜下观察大鼠股直肌超微结构变化。结果:(1)1周大负荷游泳运动之后,骨骼肌超微形态结构发生了程度不同的改变,具体表现为肌间隙增宽,内质网、线粒体可见轻度变形,肌原纤维疏松变细,出现Z线扭曲等。E0组和E24组上述改变更加明显。(2)与安静对照组相比,力竭运动各组骨骼肌MGF均明显增加(P<0.05),其中E24组与安静对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。血清MGF也有相似变化,E0组与安静对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。结论:1周大负荷游泳运动可引起一定程度的骨骼肌微损伤,大负荷运动及其恢复期间,大鼠骨骼肌和血清MGF明显增加,提示MGF可能与肌肉组织的微损伤修复有关。     

股中间肌卫星细胞移植对大鼠骨骼肌钝挫伤的修复作用

目的:探讨体外培养的股中间肌卫星细胞对大鼠骨骼肌钝挫伤的修复作用,为提高对肌肉损伤的治疗提供参考依据。方法:分别取体外培养SD大鼠股中间肌卫星细胞悬液(实验组)与生理盐水(对照组),注入大鼠骨骼肌钝挫伤模型损伤部位,观察比较两组动物损伤修复进程及差异。结果:移植后实验组比对照组恢复效果好。(1)卫星细胞移植后5、10、15天,实验组肌肉组织内荧光标记的肌卫星细胞逐渐减少,形成肌管并最终融合成肌纤维参与损伤修复;(2)移植后5、10、15天大鼠肌电图的纤颤电位和正尖波均逐渐减少,而实验组大鼠异常自发活动的消失较对照组早,且损伤侧肌肉肌电强度振幅和波宽依次增大,逐渐接近正常侧,而对照组肌电强度振幅与波宽则增加缓慢;(3)随着损伤修复的进程,实验组肌肉湿重恢复率逐渐降低并接近1;(4)随着修复的进程,HE染色灰度值逐渐增加,且实验组灰度值大于对照组。结论:股中间肌卫星细胞移植对骨骼肌钝挫伤有明显修复作用。     

复方苦参联合5-氟尿嘧啶调控Cyclin D1分子抑制结肠癌增殖作用研究

目的探讨复方苦参与5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合用药对结肠癌细胞增殖和凋亡的作用以及对细胞周期素1(CyclinD1)表达的影响。方法 CCK-8细胞增殖实验与流式细胞术对比联合用药组(复方苦参+5-Fu)与对照组(二甲基亚砜+5-Fu)处理后的结肠癌SW480细胞增殖与凋亡情况;蛋白免疫印迹法观察两组SW480细胞CyclinD1的表达情况。结果联合用药组处理后的SW480细胞的增殖能力弱于对照组,两组间48 h、72 h及96 h 3个时间点的细胞增殖抑制情况比较,差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药组SW480细胞的凋亡率(12.7%)高于对照组(6.18%),Cyclin D1的表达弱于对照组,组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论复方苦参联合5-Fu能抑制结肠癌细胞SW480的增殖,促进其凋亡,作用机制可能与其抑制CyclinD1的表达有关。     

低频超声联合顺铂对卵巢癌细胞影响研究

目的探讨低频超声联合顺铂对人卵巢癌A2780细胞增殖和凋亡的影响。方法培养人卵巢癌A2780细胞,将其随机分为对照组、低频超声组、顺铂组和联合组。低频超声组给予超声840 k Hz,0.75 W/cm23 min辐照;顺铂组给予顺铂5 n M,培养48 h;联合组给予低频超声+顺铂处理。应用CCK-8检测各组细胞的增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡以及细胞周期。结果与单独应用低频超声或顺铂比较,低频超声联合顺铂抑制人卵巢癌A2780细胞增殖的能力更强,更明显地诱导癌细胞的凋亡以及细胞周期S期阻滞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低频超声联合顺铂可抑制人卵巢癌细胞的增殖,诱导癌细胞的凋亡以及细胞周期S期的阻滞作用。     

外源性FGF9对体外肺泡Ⅱ型上皮细胞作用的实验研究

目的观察外源性成纤维细胞生长因子9（fibroblast growth factor 9,FGF9）对体外大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ细胞）生长的影响。方法体外原代分离、纯化、培养成年大鼠ATⅡ细胞,锥虫（台盼）蓝拒染法测定细胞活力,透射电镜鉴定细胞,碱性磷酸酶（AKP）染色法确定细胞纯度。实验组分别用10,30,50 ng/ml FGF9和200μg/ml肝素处理细胞24 h,对照组为未经药物处理的ATⅡ细胞。选择30 ng/ml FGF9浓度后,再通过噻唑蓝检测法（MTT法）分别检测24,48,72和96 h的细胞存活率。结果原代培养ATⅡ细胞的产量约为2×107个/鼠,细胞活力〉90%,电镜下观察到ATⅡ细胞典型细胞结构——板层小体,细胞纯度〉90%。采用30和50 ng/ml浓度FGF9刺激细胞24 h,ATⅡ细胞存活率明显增高（P〈0.01）。采用30 ng/ml FGF9刺激ATⅡ细胞不同时间（24,48,72和96 h）发现,24,48,72和96 h细胞存活率均明显高于对照组（P均〈0.01）。结论利用弹性蛋白酶消化分离和大鼠IgG免疫黏附纯化,可获得高产量、高纯度及高活力的原代ATⅡ细胞。FGF9以浓度和时间依赖的方式促进ATⅡ细胞增殖。     

一次性离心运动对大鼠骨骼肌骨架蛋白表达和肌力的影响

目的:探讨一次性离心运动对大鼠骨骼肌肌力和收缩蛋白myosin,细胞膜骨架蛋白dystrophin、a-DG、-DG,细胞外基质蛋白laminin-2、collagen IV表达的影响,以及上述蛋白与骨骼肌收缩力和拉断力的相关关系。方法:42只雄性Wistar大鼠分成对照组(n=6)和运动组(n=36)。运动组大鼠进行一次性离心运动,坡度为-16°,跑速为26.8 m/min,运动5 min,间歇1 min,共进行10组。分别于运动后即刻、4小时、24小时、48小时、72小时、7天,将大鼠腓肠肌在半离体状态下固定于微型材料实验机,用电刺激法测试大鼠腓肠肌收缩力,然后测拉断力,后取材测试血清CK、LDH,用免疫组化法测定大鼠腓肠肌myosin、dystrophin、-DG、-DG、laminin-2、collagen IV蛋白和laminin-2基因表达。结果:一次性离心运动后即刻,大鼠血清CK和LDH与对照组相比均有显著性增加(P<0.05)。一次性离心运动后即刻和48小时,大鼠腓肠肌收缩力与对照组相比显著下降(P<0.05),运动后24小时拉断力与对照组相比显著下降(P<0.05)。收缩力与拉断力呈正相关(r=0.501,P<0.01);一次性离心运动即刻laminin-2基因表达与对照组相比显著下降(P<0.05),运动后24小时laminin-2蛋白含量与对照组相比显著增加(P<0.05)。骨架蛋白含量与大鼠腓肠肌收缩力无相关关系,laminin-2蛋白含量变化与大鼠腓肠肌拉断力呈负相关(r=-0.727,P<0.01)。结论:(1)一次性离心运动致骨骼肌损伤,收缩力下降和肌肉损伤有关。(2)大鼠腓肠肌的材料力学特性在一次性离心运动后24小时最弱。(3)大鼠腓肠肌收缩力和骨架蛋白变化无相关关系。(4)大鼠腓肠肌拉断力在一次性离心运动后和laminin-2蛋白含量高度负相关,其内在机制值得进一步探讨。     

阿伐他汀对辐射致血管内皮细胞损伤的保护作用研究

目的 观察阿伐他汀对血管内皮细胞(VEC)血栓调节素(TM)表达的影响和辐射损伤的防护作用。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞和主动脉内皮细胞,用阿伐他汀10 μmol／ml作用于生长期内皮细胞1 h,分别经γ射线照射2和25 Gy,24 h后检测VEC 的TM表达、蛋白C含量及细胞形态学变化。结果 阿伐他汀处理后24 h,正常对照组VEC表面TM表达水平迅速提高了77%(t=27.395,P＝0.000),2和25 Gy照射组分别提高59%(t=26.420,P=0.000)和61%(t=58.065,P=0.000)。2和25 Gy照射后,蛋白C含量比正常VEC组下降23%和34%,但阿伐他汀处理后分别比各自对照组增加79%和76%。照后24h,阿伐他汀处理可使2和25 Gy照射组VEC凋亡率分别降低6%和16%(t=4.178,P=0.006;t=17.863,P=0.000)。结论 阿伐他汀可显著增强VEC的TM表达,激活蛋白C的形成,从而增强内皮细胞抗凝血与抗炎功能,并有效减轻辐射所致的内皮细胞损伤。