组织工程化气管上皮细胞培养的技术进展

组织工程化气管是气管缺损外科修复的替代物,它是利用组织工程学技术和原理在体外构建出具有生理功能及生物活性的人工气管。与其他种类的气管替代物相比,组织工程化气管的优点为无免疫原性,具有生物活性,有潜在的生长能力。种子细胞是组织工程研究中最为重要的方面,是组织工程化组织或器官形成的物质基础,气管上皮细胞作为种子细胞是组织工程化气管中不可缺少的一部分。文章就气管上皮细胞分离培养技术研究进展进行综述,并指出组织工程化气管研究领域所面临的问题和今后的研究方向。     

气管异位移植模型大鼠气管上皮细胞对闭塞性细支气管炎的影响

背景:目前很多实验已证明气管上皮细胞是引起这种慢性炎症的关键因素,气管上皮起到免疫应答的"靶器官"作用,可激活细胞免疫和体液免疫的应答.目的:探讨在大鼠气管异位移植中气管上皮细胞对闭塞性细支气管炎发生的影响.方法:建立大鼠去上皮组织的气管异位模型.将大鼠随机分4组:①上皮组:Wistar大鼠一SD大鼠,气管模型建立不需要消化气管上皮,直接灌入培养液.②去上皮组:Wistar大鼠→SD大鼠,没有上皮细胞的Wistar大鼠气管,将气管模型移植于SD大鼠的背部皮下.③对照组1:Wistar大鼠Wistar大鼠,气管灌入生理盐水植入皮下.④对照组2:Wistar大鼠→Wistar大鼠,将去上皮组织的气管植于皮下.结果与结论:上皮组气管内发生了闭塞,闭塞率随着移植天数的增加而增加.去上皮组气管内没有堵塞.对照组管内没有闭塞.在大鼠气管异位移植模型中得到证实,气管上皮细胞在闭塞性细支气管炎的发生发展中起重要作用.     

兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的:建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型,观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法:实验于2005-03/07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养:日本大耳兔20只,利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞,无血清生长因子培养基(成分:DMEM:Ham’sF12为1∶1,并加入以下激素及生长因子:10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20μg/L甲状腺素、0.4mg/L氢化可的松、7.5mg/L内皮细胞生长支持物、25μg/L表皮生长因子、1mmol/L-谷氨酰胺,100IU/mL青霉素,50mg/L链霉素)体外培养。②细胞纯度及鉴定:用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应,二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果:①气管上皮细胞的分离:低温消化加刷洗法获得的气管上皮细酶胞数量较多,呈圆形,较大,悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征:皿接种细胞24h后,贴壁率约为60%,细胞增大,并进入分裂套相。五六天后细胞增殖旺盛,部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长,在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃,第3周纤毛逐渐消失成遗迹,细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察:见纤毛由细胞顶膜伸出,大部分集结成束,除纤毛外,还可有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定:抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性,细胞达(91±3)%。结论:酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养,以建立兔气管纤毛可上皮细胞的原代培养模型,具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

两种消化酶在培养晶状体上皮细胞中的消化作用

目的：分析Ⅰ型胶原酶和胰酶在晶状体上皮细胞体外培养中的不同消化作用,以寻找更好的实验方法。方法采用胰酶消化培养法,Ⅰ型胶原酶消化培养法,分别进行晶状体上皮细胞的原代培养,设立对照组和实验组,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况,并通过台盼蓝染色观察经消化酶解后游离细胞的存活数量,判别两组间消化作用的差异。结果Ⅰ型胶原酶消化的组织片更容易贴壁,生长速度更快,其游离细胞台盼蓝不着色率为（78．85±6．78）％,胰酶消化法为（27．20±3．28）％,两种酶消化后细胞存活率比较,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论Ⅰ型胶原酶消化法培养晶状体上皮细胞的成功率远优于传统改良的胰酶消化法。     

兔膀胱移行上皮细胞的体外培养

目的:对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,探索用于泌尿系统组织工程的膀胱移行上皮种子细胞的最佳培养方法。方法:实验于2005-09/2006-01在吉林大学药学院生物工程实验室完成。①取1月龄新西兰大耳白兔,耳缘静脉行空气栓塞处死,超净台内无菌取膀胱。②采用中性蛋白酶分离膀胱各层组织。③胰蛋白酶消化获得膀胱移行上皮细胞。④将获取的膀胱移行上皮细胞分别接种到含体积分数为0.01,0.05,0.1血清的DMEM-F12培养液进行培养。④每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况;分别在第1,3,5,7,9天以四甲基偶氮唑盐法作细胞生长曲线。结果:①原代移行上皮细胞于接种后34～48h贴壁,培养六七天时可达80%融合,呈典型铺路石状。②传代后的细胞生长稳定快速,24～36h贴壁,五六天可达80%融合。③应用四甲基偶氮唑盐法检测不同体积分数血清对移行上皮细胞增殖的影响,显示膀胱移行上皮细胞在含有体积分数为0.05血清的DMEM-F12培养中生长状态最佳。结论:采用中性蛋白酶与胰蛋白酶联合消化法,对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,是一种稳定、快速的膀胱移行上皮细胞的培养方法。     

人支气管上皮细胞原代培养方法的对比研究

目的:探索简单有效的人支气管上皮细胞原代培养方法.方法:通过组织贴块法、蛋白酶消化 + 机械刮刷法、纤支镜刷检法分离获得人的支气管上皮细胞,用无血清培养基进行细胞培养.结果:组织贴块法可获得纯度高、存活率高、数量多的支气管上皮细胞,蛋白酶消化+机械刮刷法获得支气管上皮细胞中混杂较多的成纤维细胞,纤支镜刷检法获得的支气管上皮数量少且易老化,其中混杂大量的红细胞,影响上皮细胞的贴壁和生长.结论:组织贴块法是一种简便、有效的培养人的支气管上皮细胞的方法,无血清培养基可提供满意的生长条件,提高上皮细胞的纯度,为进一步研究不同的呼吸系统疾病提供了良好的基础.     

兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的：建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型，观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法：实验于2005-03／07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养：日本大耳兔20只，利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞，无血清生长因子培养基（成分：DMEM：Ham＇sF12为1：1，并加入以下激素及生长因子：10mg／L胰岛素、5mg／L转铁蛋白、20μg／L甲状腺素、0．4mg／L氢化可的松、7．5mg／L内皮细胞生长支持物、25μg／L表皮生长因子、1mmol／L-谷氨酰胺，100IU／mL青霉素，50mg／L链霉素）体外培养。②细胞纯度及鉴定：用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应，二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果：①气管上皮细胞的分离：酶低温消化加刷洗法获得的气管上皮细胞数量较多，呈圆形，较大，悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征：套皿接种细胞24h后，贴壁率约为60％，细胞增大，并进入分裂相。五六天后细胞增殖旺盛，部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长，在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃，第3周纤毛逐渐消失成遗迹，细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察：可见纤毛由细胞顶膜伸出，大部分集结成束，除纤毛外，还有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定：抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性，细胞达（91&;#177;3）％。结论：酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养，可以建立兔气管纤毛上皮细胞的原代培养模型，具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

系统性红斑狼疮小鼠胸腺上皮细胞的体外培养

目的培养符合实验要求的系统性红斑狼疮小鼠胸腺上皮细胞。方法剪切、胶原酶消化自发性系统性红斑狼疮小鼠(BXSB小鼠)胸腺,进行原代培养,胰蛋白酶消化法传代培养,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果经剪切、胶原酶消化的BXSB胸腺植块,在体外培养2～3天后,可见上皮样细胞从植块长出,8～15天后胸腺上皮细胞在培养瓶底部长满,细胞间通过胞浆突起连接成网孔结构。当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95%以上。结论剪切、胶原酶消化法简便易行,可获得符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,建立了稳定的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系。     

体外连续传代培养人腮腺腺上皮细胞的观察

实验于2004-11/2005-03在天津市口腔医院中心实验室完成。取材于一成年人腮腺良性肿瘤切除后弃用的正常腮腺组织。首先制备鼠尾胶原,取成年大白鼠2只,无菌条件下抽取鼠尾肌腱筋膜,收集浸泡在500mL1g/L的冰醋酸中,铺被时将胶原冰醋酸溶液浸润培养板和培养瓶底壁,与盛有氨水烧杯一同放置在一无菌器皿中,在37℃温箱中保存72h。然后采用酶消化法从腮腺组织分离培养腺上皮细胞,以鼠尾胶原作培养底物,在1∶1DMEM/F12培养基中加入胰岛素、异丙基肾上腺素、氢化考的松等生长刺激因子,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态学特征。结果表明腮腺上皮细胞原代培养4d时成极性排列,形成大小不等的腺腔与导管样结构。腮腺上皮细胞传代培养在50d的培养周期中传代至F3代,F3代细胞液氮冻存后复苏成活。苏木精-伊红染色见细胞体积较大,胞质丰富核膜清晰,1～2个核仁,部分可见核分裂相,无异常核分裂相。     

组织工程化人正常食管上皮细胞的培养

目的：在体外分离、培养食管上皮细胞，是研究组织工程食管的最基本环节。实验拟寻找适用于组织工程食管研究的食管上皮细胞培养方法。方法：实验于2007—05／11在兰州大学医学实验中心完成。①实验材料：取食管癌患者手术切除的正常食管长2．0～3．0cm，患者对试验知情同意。②实验方法：获取可用于组织工程的食管上皮细胞，常规传代培养。⑨实验评估：免疫组织化学染色、倒置相差显微镜下观察培养20min，1～4d细胞在含血清培养基DMEM＋F12（1：1）中的生长情况；四甲基偶氮唑盐法测绘1～6d细胞的生长曲线。结果：①免疫组织化学方法检测结果显示，90％以上细胞呈阳性，证明培养的细胞为食管上皮细胞。②正常细胞较大，呈球形悬浮于培养基中；约20min后开始贴壁，1d后大部分细胞贴壁生长并呈不规则圆形或多边形；2d后细胞开始成簇生长；三四天细胞达生长高峰，胞浆丰富，核大而圆。⑧培养第3天细胞生长达高峰，其吸光度值与第1，2，5，6天比较，差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：应用含血清培养基DMEM＋F12（1：1）培养食管上皮细胞，方法简便，适合推广应用。     

Comparison of three different methods to confirm tracheal tube placement in emergency intubation

OBJECTIVES: Verification of endotracheal tube placement is of vital importance, since unrecognized esophageal intubation can be rapidly fatal (death, brain damage).The aim of our study was to compare three different methods for immediate confirmation of tube placement: auscultation, capnometry and capnography in emergency conditions in the prehospital setting. DESIGN AND SETTING: Prospective study in the prehospital setting. PATIENTS AND INTERVENTIONS: All adult patients (>18 years) were intubated by an emergency physician in the field. Tube position was initially evaluated by auscultation. Then, capnometry was performed with infrared capnometry and capnography with infrared capnography. The examiners looked for the characteristic CO(2) waveform and value of end-tidal carbon dioxide (EtCO(2)) in millimeters of mercury. Determination of final tube placement was performed by a second direct visualization with laryngoscope. Data are mean +/- SD and percentages. MEASUREMENTS AND RESULTS: Over a 4year period, 345 patients requiring emergency intubation were included. Indications for intubation included cardiac arrest ( n=246; 71%) and non-arrest conditions ( n=99; 29%). In nine (2.7%) patients, esophageal tube placement occurred. The esophageal intubations were followed by successful endotracheal intubations without complications. The capnometry (sensitivity and specificity 100%) and capnography (sensitivity and specificity 100%) were better than auscultation (sensitivity 94% and specificity 83%) in confirming endotracheal tube placement in non-arrest patients ( p<0.05). Capnometry was highly specific (100%) but not sensitive (88%) for correct endotracheal intubation in patients with cardiopulmonary arrest (capnometry versus auscultation and capnometry versus capnography, p<0.05). CONCLUSION: Capnography is the most reliable method to confirm endotracheal tube placement in emergency conditions in the prehospital setting.     

构建组织工程气管上皮细胞和成纤维细胞联合培养的模式:与常规培养的比较

目的:构建体外组织工程化气管种子细胞的共培养模式,并与常规培养相比较,为细胞复合材料构建组织工程化气管奠定研究基础.方法:实验于2006-0512007-05在解放军第四军医大学唐都医院呼吸科实验室完成.①实验材料:1个月龄雄性健康新西兰兔3只,体质量(250.00±0.75)g.②实验过程:联合培养模式:分离气管上皮细胞和成纤维细胞,联合培养7～10 d后,根据两种细胞对胰酶浓度耐受性不同的特性,A孔中加入0.5 g/L胰酶消化,用体积分数为0.05的胎牛血清的培养液DMEM重悬细胞后移入培养板B孔中(成纤维细胞):A孔中再次加入2.5 g/L胰酶继续消化后,用K-FSM培养液重悬细胞后移入培养板C孔中(气管上皮细胞).常规培养法:分别进行气管上皮细胞分离培养和成纤维细胞分离纯化.③实验评估:观察细胞生长曲线与四甲基偶氮唑盐检测细胞的生长状态,并与常规培养的细胞进行比较.结果:①细胞生长状态:联合培养的两种细胞生长状态良好,A孔加入胰酶消化后,细胞间隙增大;B孔细胞呈现长梭形,未见铺路石状细胞;C孔出现片状生长的铺路石状细胞,未见长梭形细胞.②细胞生长曲线:分离后的细胞与常规方法培养的细胞生长曲线一致.③细胞增殖情况:四甲基偶氮唑盐检测联合培养组细胞增殖与常规方法培养差异无显著性(P＜0.05).结论:联合培养模式较常规方法更加简便易行,可以作为一种较好的气管组织工程种子细胞体外培养模式得到应用.     

三种方法制备组织工程气管支架的比较

背景:气管支架制备是组织工程学方法修复长段气管缺损的关键步骤。目的:通过比较分析3种制备异体脱细胞气管支架的方法,为组织工程气管支架制备寻找更适宜的途径。方法:手术获得兔新鲜气管,分为对照组、玻璃化液冷冻法组、酶洗法组、改良玻璃化液冷冻法组。处理后对各组标本行苏木精-伊红染色,电镜扫描观察,并测量气管最大拉伸力、破裂力和组织拉伸率等生物力学性能。结果与结论:组织学观察显示对照组、玻璃化液冷冻法组可见部分完整黏膜上皮细胞,酶洗法组、改良玻璃化液冷冻法组未见黏膜上皮细胞。电镜观察示对照组、玻璃化液冷冻法组、改良玻璃化液冷冻法组有丰富的细胞外基质和胶原纤维,而酶洗法组无细胞外基质,只有胶原纤维。组间两两比较,气管支架的最大拉伸力、最大破裂力和组织拉伸率比较,差异均无显著性意义。说明应用改良玻璃化液冷冻法制备气管支架能够有效地去除抗原性、保留细胞外基质,并维持生物力学性能,是一种较为理想的组织工程气管支架制备方法。     

三种方法制备组织工程气管支架的比较

背景：气管支架制备是组织工程学方法修复长段气管缺损的关键步骤。目的：通过比较分析3种制备异体脱细胞气管支架的方法,为组织工程气管支架制备寻找更适宜的途径。方法：手术获得兔新鲜气管,分为对照组、玻璃化液冷冻法组、酶洗法组、改良玻璃化液冷冻法组。处理后对各组标本行苏木精-伊红染色,电镜扫描观察,并测量气管最大拉伸力、破裂力和组织拉伸率等生物力学性能。结果与结论：组织学观察显示对照组、玻璃化液冷冻法组可见部分完整黏膜上皮细胞,酶洗法组、改良玻璃化液冷冻法组未见黏膜上皮细胞。电镜观察示对照组、玻璃化液冷冻法组、改良玻璃化液冷冻法组有丰富的细胞外基质和胶原纤维,而酶洗法组无细胞外基质,只有胶原纤维。组间两两比较,气管支架的最大拉伸力、最大破裂力和组织拉伸率比较,差异均无显著性意义。说明应用改良玻璃化液冷冻法制备气管支架能够有效地去除抗原性、保留细胞外基质,并维持生物力学性能,是一种较为理想的组织工程气管支架制备方法。     

三种方法培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞的比较

背景：原代培养方法被广泛应用于正常和哮喘大鼠气道平滑肌细胞的培养,但少见用于慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞培养的报道。目的：建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型,比较组织块法、酶消化法和改良组织块消化法原代培养模型大鼠气道平滑肌细胞生长情况的差异。方法：将16只清洁级雄性健康SD大鼠随机分成2组,对照组正常饲养,慢性阻塞性肺疾病组用熏烟法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型,显微镜下观察大鼠肺组织病理学特点。分别应用上述3种方法原代培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞,相差显微镜下观察细胞形态,用α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定细胞类型。结果与结论：经病理学证实成功构建慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。在倒置相差显微镜下见培养的细胞表现为典型的＂谷-峰状＂生长。经免疫细胞化学染色后,可见胞质呈棕色阳性反应,所培养的细胞有94%以上为气道平滑肌细胞。3种方法在耗时和细胞质量方面均无明显差别,但组织块法更经济、稳定可靠和简单。     

三种方法测定血浆直接胆红素的方法学比较

目的分析改良Malloy-Evelyn法、钒酸盐氧化法和干化学法在测定血浆直接胆红素(DBIL)时的偏倚,为室间评估结果提供参考依据.方法依据美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP9-A文件,分别用三种方法测定样本直接胆红素含量并进行相关回归分析和偏倚估计.结果以干化学法(X)为对比方法,对钒酸盐氧化法(Y)和改良Malloy-Evelyn法(Z)进行评估.钒酸盐氧化法(Y)和干化学法(X)测定DBIL的回归方程式为Y=1.012X+1.992,相关系数r2=0.999;改良Malloy-Evelyn法(Z)和于化学法(X)测定DBIL的回归方程式为Z=0.725X+2.334,相关系数r2=0.988.DBIL浓度为10μmmol/L、100μmol/L、300μmol/L时,钒酸盐氧化法(Y)的相对偏倚分别为21.1%、3.2%和1.9%,改良Malloy-Evelyn法(Z)的相对偏倚分别为4.2%、25.2%和26.7%.结论钒酸盐氧化法与干化学法在测定血浆DBIL时,测定结果的相对偏倚随DBIIL浓度增加而降低;改良Malloy-Evelyn法与干化学法在测定血浆DBIL时,测定结果的相对偏倚随DBIL浓度增加而增加;建议临床实验室建立本实验室直接胆红素测定的参考值范围,以保证实验结果判断的准确性.     

改良回血方法在血液透析中的应用

目的探讨改良回血法在血液透析中的应用效果,以期为临床护理工作提供理论依据。方法选取21例规律血液透析患者为研究对象,采用自身对照方法,每例患者每周依次采用3种回血方法进行透析。比较回血过程中停泵时间、总回血时间、残余血量、回输生理盐水量、并发症发生率及透析器凝血状况。结果改良法的停泵时间及总回血时间分别为（18．64±3．86）,（250．03±27．81）s,均低于单向法的（42．16±8．49）,（262．95±33．24）s和双向法的（82．05±18．84）,（306．16±23．19）s,差异均有统计学差异（F分别为444．55,67．94;P〈0．01）;改良法的残余血量及回输生理盐水量分别（2．81±0．42）,（100．56±23．90）ml,与单向法的（2．81±0．51）,（100．37±21．41）ml比较,差异无统计学意义（P〉0．05）,但与双向法的（3．00±0．47）,（148．57±23．55）ml比较,差异有统计学差异（P〈0．05）;改良法的并发症发生率为3．1％低于单向法的11．9％,差异有统计学意义（X2=7．07,P=0．008）,但与双向法的3．9％比较,差异无统计学差异（x2=0．132,P〉0．05）;透析器凝血状况3组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论改良回血法能最大限度减少回血中停泵时间和总回血时间,降低并发症发生率,减少残余血量及回输生理盐水量。     

人支气管上皮细胞的体外培养

背景:人支气管上皮细胞培养在呼吸系统疾病研究中应用越来越广泛.目的:探索美国典型培养物保藏中心人支气管上皮细胞体外培养方法的可行性.方法:对人支气管上皮细胞培养条件进行反复摸索,最终确定应用含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养.结果与结论:实验培养的人支气管上皮细胞扁平,呈多边形,长满后呈"铺路石"样分布,经免疫组化检测发现培养的细胞表达上皮细胞标志物细胞角蛋白.在支气管扩张症患者痰液上清刺激下,细胞表达的核因子κB、肿瘤坏死因子α和白细胞介素8明显增强,证实培养的人支气管上皮细胞获得成功.提示不必拘泥于美国典型培养物保藏中心推荐的培养条件,改进的培养方法简便易行,有应用价值.