含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的用所构建的弓形虫pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答.方法碱裂解法大量制备pcDNA3-ROP1质粒,免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射100ug, 两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.于免疫后第50天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清IgG抗体90天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异.结论 pcDNA3-ROP1质粒DNA免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生IgG抗体.     

表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3的重组腺病毒免疫小鼠的研究

目的构建表达HCV非结构蛋白3（NS3）的重组腺病毒RAd／NS3，探讨其免疫小鼠后诱导机体产生特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增编码NS3蛋白（329～935位氨基酸）的基因片段，定向克隆至重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌，利用细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒，转染293细胞，以包装、扩增重组腺病毒。将重组腺病毒以1×10^8 pfu剂量经皮下注射免疫BALB／c小鼠，并以100μg重组质粒pRC／NS3经肌内注射途径免疫小鼠为对照。ELISA法检测免疫小鼠血清抗体水平，^51 Cr释放法检测免疫小鼠细胞毒性T淋巴细胞体外杀伤功能。结果重组腺病毒经皮下免疫小鼠后可刺激机体产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，且免疫效果强于重组质粒pRC／NS3组，初次免疫后2周，前者20只小鼠抗-HCV全部阳转，而后者10只小鼠仅3只阳转，未观察到明显的不良反应。结论表达HCV NS3抗原的重组腺病毒载体疫苗能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答。     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的　用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法　碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射１００ｕｇ,两周后同量加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０ 天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果　免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清ＩｇＧ抗体９０天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异。结论　ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒ＤＮＡ 免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生ＩｇＧ抗体     

沙眼衣原体MOMP基因真核表达载体免疫小鼠的研究

目的：用pcDNA3-MOMP真核表达质粒直接免疫小鼠，观察小鼠对沙眼衣原体MOMP基因疫苗的免疫应答。方法：大量制备重组质粒pcDNA3-MOMP,给小鼠肌肉注射，每3周免疫1次，共免疫3次。用微量免疫荧光及MTT法检测小鼠血清抗体及脾细胞对沙眼衣原体的特异性增殖反应。结果：初次免疫接种后小鼠血清中检测出特异性抗体，加强免疫后抗体水平明显上升，免疫荧光滴度最高达1：256。脾细胞对沙眼衣原体的刺激指数明显高于对照组（P＜0．01）。结论：pcDNA3-MOMP在小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性细胞免疫应答。     

乙型及丙型肝炎DNA疫苗联合重复接种小鼠的免疫应答

目的 :观察由编码 HBs Ag与 HCV- CE2 抗原的两种重组真核细胞表达质粒制备的 DNA疫苗重复联合接种 BAL B/c小鼠后 ,其诱生的特异性免疫应答反应。方法 :应用上述两种 NDA疫苗重复联合免疫小鼠 ,动态观察血中特异性抗体水平、特异性细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )体外杀伤活性 ,并进行 CTL杀伤活性活体诱生实验。结果 :两种 DNA疫苗联合重复免疫小鼠 ,能够诱生机体特异性体液免疫及细胞免疫完全应答。其小鼠荷瘤表达目的抗原的靶细胞后 ,生存率明显高于未免疫鼠 (P <0 .0 5 )。结论 :乙型及丙型肝炎联合 DNA疫苗的重复接种 ,可有效地诱生小鼠机体特异性免疫应答反应。 DNA疫苗诱生的 CTL应答可与体液免疫应答分离存在 ,可能是 DNA疫苗免疫保护的更重要方面。     

幽门螺杆菌ureI核酸疫苗免疫活性的初步研究

目的 观察幽门螺杆菌ureI核酸疫苗诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答及细胞免疫应答水平.方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/ureI、空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分别肌注免疫C57BL/6小鼠.ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平以及脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IFN-γ含量,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,PCR和免疫荧光组化法检测ureI基因和蛋白表达.结果 pcDNA3.1(+)/ureI能够诱导小鼠产生特异性IgG抗体,该组小鼠脾淋巴细胞经UreI重组蛋白刺激后,其刺激指数和培养上清中IL-4、IFN-γ含量明显升高; ureI基因可在小鼠肌细胞中有效表达.结论 pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗能刺激C57BL/6小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研究该疫苗的免疫保护作用奠定了基础.     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的　探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法　用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果　重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论　HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 ,HRP2重组蛋白疫苗具有潜在的应用前景     

重组SARS病毒M蛋白的免疫效应研究

目的 检测SARS冠状病毒重组M蛋白疫苗诱导小鼠的免疫应答能力。方法 PCR扩增M蛋白基因，构建至原核表达质粒pET-23a，pET-23a-M重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，诱导表达蛋白经SDSPAGE、免疫印迹分析和纯化后免疫BALB／c小鼠，3次免疫后测定免疫功能，进行免疫效果评价。结果 成功构建pET-23a—M重组质粒，转化宿主菌后诱导表达27kuM蛋白。检测M蛋白免疫鼠体内有特异性抗体产生，抗体效价达1，10^4；脾脏CD8^＋比例升高，CD4^＋／CD8^＋比值下降；免疫鼠血清IFN-y／和IL-4水平无显著变化。结论 SARS病毒重组M蛋白疫苗能诱导BAI。B／c小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株不同期基因重组质粒混合接种小鼠后的免疫反应

寻找有效的抗恶性疟原虫混合基因疫苗 ,探讨其在宿主体内的免疫反应。将恶性疟原虫重组质粒 pc DNA 3-EBA175 / HRP 经骨骼肌途径单独注射或与有性期阶段的重组质粒 pc DNA3- Pfs2 5混合注射免疫 Balb/ c小鼠。对小鼠的骨骼肌进行预处理 ,即于注射前 7d在左后肢股四头肌注射 0 .5 %盐酸布比卡因 5 0μl,注射深度为 2 m m。观察免疫后不同时间点小鼠血清 Ig G抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4+ / CD8+ T细胞亚群比率和 NK细胞杀伤活性的变化。结果显示 ,pc DNA3- EBA 175 / HRP 单独肌肉注射或与 pc DNA3- Pfs2 5混合肌肉注射免疫小鼠 ,均可见血清 Ig G抗体滴度增高、经恶性疟原虫抗原刺激后的特异性 T淋巴细胞增殖反应增强、CD4+ / CD8+ T细胞比率下降以及 NK细胞杀伤活性增强 ;加强免疫注射机体的免疫反应能增强。提示肌肉注射 DNA疫苗为一有效的免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫两个基因的重组质粒单独免疫或与编码不同阶段基因的重组质粒混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫和 NK细胞杀伤活性     

肺炎嗜衣原体MOMP和人IL-2融合基因DNA疫苗的免疫原性研究

目的构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(MOMP)单基因及momp和人IL-2融合基因的真核表达载体并比较其免疫反应性,为研制Cpn核酸疫苗提供理论和实验依据。方法扩增Cpn momp及人IL-2基因并将二者融合,将momp和momp-IL-2分别克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体;制备纳米粒DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫荧光组化法检测重组质粒在小鼠组织内的稳定表达;ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体和小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。结果成功制备了pcDNA3.1(+)-momp和pcD-NA3.1(+)-momp-IL-2的纳米核酸疫苗;Cpn momp单基因和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生特异性抗体,且pcDNA3.1(+)-momp-IL-2能诱导小鼠产生更高效价的特异性抗体(P<0.05);pcDNA3.1(+)-momp-IL-2诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ的量及对特异抗原的刺激指数明显高于pcDNA3.1(+)-momp。结论Cpn momp单基因核酸疫苗和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答;pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的免疫效果强于pcDNA3.1(+)-momp。     

The humoral immune responses elicited in mice by inoculations with a recombinant protein or DNA based on the circumsporozoite-protein gene of Plasmodium falciparum

The humoral responses elicited in mice by inoculation, in various doses and by several routes, with plasmid DNA containing the gene coding for the circumsporozoite protein (CSP) of Plasmodium falciparum FCC1/HN were compared with those evoked by inoculation with a recombinant expressed protein based on the CSP. With the DNA vaccine, intramuscular inoculations appeared the most effective, followed by intravenous and then subcutaneous injections, the responses in each case being dose-dependent. In both standard ELISA and dot-ELISA, sera from the mice immunized with the DNA were found to have much lower titres of antimalarial antibodies than the corresponding sera from mice immunized with the recombinant protein. Although both 'vaccines' elicited humoral immune responses in BALB/c mice, that based on plasmid DNA took much longer than the recombinant protein to induce high-titre antibody responses.     

乙型肝炎病毒核心抗原与表面抗原"a"决定簇融合疫苗的免疫效果

目的 评价乙型肝炎病毒核心蛋白作为类病毒颗粒载体融合表面抗原"a"决定簇的基因疫苗和蛋白疫苗的免疫效果,为寻求有效的慢性乙型肝炎治疗性疫苗奠定基础.方法 体外分别扩增编码乙型肝炎病毒HBsAg 100～162 aa部分、HBcAg 1～78 aa部分和HBcAg 83～144aa的基因序列,目的 基因连接后定向克隆到真核表达载体pcDNA3的多克隆位点内.将嵌合基因亚克隆到原核表达载体,诱导表达并纯化获得融合蛋白.分别用真核表达质粒和纯化融合蛋白免疫BALB/c小鼠,加强免疫并定期采血,检测血清中特异性抗体并进行淋巴细胞增殖实验以评价体液和细胞免疫应答效果.实验结果进行重复测量资料的方差分析和单向方差分析. 结果嵌合基因免疫后可以产生有效的抗-HBs"体液免疫"应答,免疫0、2、4、6、8、10、12,14周时的S/N值分别为1.05±0.20、2.69±0.38、4.48±0.50、6.61±0.49、6.95±0.19、7.43±0.31、8.11±0.14、7.43±0.31,F值分别为1202.021和200.059,P<0.01.未引起明显的抗-HBc"体液免疫"应答却获得了明显的HBcAg特异性细胞免疫应答.融合蛋白免疫后也能获得有效的抗-HBs"体液免疫"应答,但针对HacAg的体液应答却较强;可以产生较强的HBcAg特异性增殖反应,而没有明显的HBsAg特异性增殖反应.嵌合基因免疫组较融合蛋白组的细胞免疫应答明显增强,体液免疫应答相对较弱. 结论 以该乙型肝炎病毒核心蛋白为载体的包含HBsAg"a"决定簇的融合基因疫苗相对于其融合蛋白具有良好的细胞和体液免疫效果.     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒DNA直接免疫接种诱导BALB／c小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫DNA疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒pcDNA3－Pf8，PCR法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中pcDNA3－Pf 8，ELISA、T淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用PCR法从上述组织中均检测到pcDNA3－Pf8，ELISA法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达12560，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒pcDNA 3-Pf 8 直接免疫接种, 能特异性地剌激BALB/c 小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答, 其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体, 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）, 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达, 将纯化的表达产物免疫接种小鼠, 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定, 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带;表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加, 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答, 并提高小鼠ＮＫ细胞活性的作用     

猪囊尾蚴病重组DNA疫苗pcDNA 3.1-TSO45W在小鼠体内诱导的体液免疫效应

目的观察基于六钩蚴期的猪囊尾蚴病基因疫苗TSO45W诱导的小鼠体液免疫应答。方法碱裂解法大量制备重组质粒pcDNA3.1-TSO45W及对照质粒pcDNA3.1。将45只雌性昆明小鼠(4~6周)随机分为3组,每组15只。A组(生理盐水组):每只小鼠肌肉注射生理盐水100μl;B组(空质粒pcDNA3.1对照组):每只小鼠肌肉注射空质粒100μg;C组(重组质粒pcDNA3.1-TSO45W组):每只小鼠肌肉注射重组质粒100μg。分别于免疫后2、4、6、8、10周以ELISA方法检测小鼠血清免疫球蛋白IgG,IgM及IgA含量。结果 pcDNA3.1-TSO45-4B免疫组小鼠血清IgG、IgM、IgA均于第4周开始升高,分别为(17.36±1.85)μg/ml、(9.25±1.78)μg/ml和(9.41±0.88)μg/ml,并分别于第8、第6、第8周达到最高,含量分别为(24.26±2.52)μg/ml、(10.69±0.52)μg/ml和(11.22±1.23)μg/ml,与空质粒对照组(B组)和生理盐水对照组(A组)比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论猪囊尾蚴保护性抗原TSO45WDNA疫苗能在小鼠体内诱导体液免疫效应。     

以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究

目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果。方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDSPAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体。小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%。结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值。     

恶性疟原虫Pf12基因重组质粒DNA接种诱导小鼠的免疫应答

目的　观察重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠所产生的免疫应答 ,分析Pf12基因的抗原性和作为疫苗抗原候选分子的可能性。方法　构建重组质粒VR10 12 -Pf12 ,直接免疫BALB/c小鼠 ,通过NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平、ELISA、体外抑虫试验测定 ,观察其诱导的细胞和体液应答以及体外抑虫效果。结果　重组质粒VR10 12 -Pf12免疫BALB/c小鼠 ,NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平明显高于对照组 (P <0 0 1) ,诱导小鼠产生的抗体水平明显增高 (P <0 0 1) ,免疫血清在体外能抑制恶性疟原虫的生长、发育。结论　重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠产生一定水平的体液和细胞免疫应答 ,其免疫血清在体外对恶性疟原虫的生长、发育有明显的抑制作用。