乙型脑炎病毒减毒活疫苗生产株SA14—14—2基因组全序列的测定

目的：对乙型脑炎减毒活疫苗SA14－14－2生产株进行全序列测定和分析,为进一步了解其基因组结构与疫苗减毒机制的关系及研究疫苗生产的遗传学质控标准奠定基础。方法：根据已发表的SA14－14－2株及SA14株的序列,设计6对相互重叠片段的引物,通过RT－PCR扩增出SA14－14－2疫苗生产株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至TG1受体菌中,挑取阳性克隆进行鉴定后测定全序列。结果：SA14－140－2生产株基因组全序列长10976个核苷酸,96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基酸。与国外测定的SA14和SA14－14－2株的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同源性均在99％以上,突变位点分散于各个区域,以往推测的7个可能与减毒相关的位点均未发生改变。1296－1506间有4个突变位点,有可能作为疫苗质控的遗传学标记。结论：乙脑减毒活疫苗生产株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干不同位点产生的原因可能在于病毒株的不同传代。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理及疫苗的遗传学质控标准具有一定意义。     

流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2基因稳定性研究

目的 通过研究流行性乙型脑炎活疫苗减毒株基因稳定性，从分子水平证实流行性乙型脑炎活疫苗的遗传稳定性。方法分析流行性乙型脑炎活疫苗主种子、工作种子及其相应的疫苗病毒E蛋白基因核苷酸和氨基酸序列，并与其强毒株和基因库中乙脑病毒减毒株(AF15119)比较。结果乙脑活疫苗主种子、工作种子及其相应的疫苗病毒的E蛋白基因核苷酸序列完全相同。这些病毒E蛋白的氨基酸序列与基因库中乙脑病毒弱毒株(AF315119)比较显示第E447位点氨基酸有差异。结论乙脑病毒活疫苗减毒株遗传学特性稳定。     

乙型脑炎病毒活疫苗生产株SA14-14-2的感染性克隆构建

目的　构建乙型脑炎病毒 (乙脑病毒 )活疫苗生产株SA1 4 14 2的感染性克隆。方法　在对SA1 4 14 2株全长基因组测序基础上 ,引入适当酶切位点和T7RNA聚合酶启动子 ,采用分部连接策略 ,获得全长基因组cDNA ,体外转录RNA后 ,转染细胞获得感染性克隆 ,病毒传代培养、抗体中和试验和乳鼠脑腔攻击试验鉴定病毒。结果　由疫苗株cDNA构建了病毒感染性克隆 ,经鉴定为乙脑病毒 ,且病毒毒力比野毒株弱。结论　获得了乙脑病毒活疫苗生产株SA1 4 14 2的感染性克隆 ,为进一步研究疫苗的减毒机理及开发新一代疫苗奠定了基础     

乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2感染性克隆的构建、鉴定及稳定性分析

目的 构建稳定的乙型脑炎病毒(JEV)疫苗SA14-14-2感染性克隆.方法 用基因重组技术把SA14-14-2全长 cDNA克隆到质粒pACNR中,并以其为模板转录RNA,将RNA电转导入BHK21细胞包装病毒,用蚀斑实验和间接免疫荧光法检测病毒,对病毒进行传代实验及序列分析,并比较恢复病毒和疫苗株在蚀斑大小、神经毒力等方面的差别.结果 酶切及测序表明质粒模板成功构建,用免疫荧光技术检测到恢复病毒蛋白表达,恢复病毒感染BHK21后可致细胞病变效应(CPE),传代实验表明病毒可以稳定感染BHK21细胞,测序表明:除人为引入的突变外(碱基473 A→C)无任何碱基突变,并发现恢复病毒在蚀斑形成、小鼠的神经毒力等特性方面同疫苗株相同.结论 成功构建了稳定的JEV感染性克隆,建立了用于JEV研究的反向遗传学方法,为研究JEV的致病机理、疫苗的减毒机制以及嵌合病毒疫苗的研发奠定基础.     

诺如病毒广州株全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的诺如病毒基因组分子结构特点和基因组类型。方法 参考GenBank上的诺如病毒MD145-12基因组设计分段扩增引物，进行RT-PCR分段扩增诺如病毒基因组，克隆于T载体上，测定序列，用Clustal W／X、DNAStar、RAT（recombination analysis tool）等软件分析基因组序列。结果 诺如病毒NVgz01全基因组为7558bp，提交到C,enBank上的序列号为DQ369797，3’端非编码区末端长45bp，病毒基因组有3个开放阅读框（ORF），ORF1长5100bp（5～5104nt），ORF2基因长1623bp，位于基因组中5085～6707nt之间，ORF3基因长807bp（6707～7513nt），其中ORF1、ORF2两基因有19个核苷酸的重叠区；NVgz01全基因组核苷酸序列与GenBank上诺如GI组Norwalk68、Southampto、BS5、Chiba、WUG1的同源相似性在43％～44％之间，与GⅡ组MD145、Farmington　Hills、B4S5、Hawaii、Lordsdale、SaitamaU1、Mc37同源相似性在76％～90％之间。NVgz01的ORF1与Mc37核苷酸序列同源性为94％，但ORF2与Mc37的同源性只有65％；NVgz01的ORF2与Fannillgton Hills（AY502023）同源性为最高（94％），ORF1的同源性为88％。结论广州地区儿童腹泻感染的诺如病毒NVgz01株全基因组序列为7558bp，GenBank序列号为DQ369797，NVgz01与诺如病毒的GⅡ组同源性较高，确认NVgz01株属于诺如病毒GⅡ组；根据ORF1、ORF2的同源性差异和RAT程序分析初步认为NVgz01可能是重组病毒。     

登革2型病毒04株基因组全序列的测定

目的 对我国登革２型病毒０４株（Ｄ２－０４）基因组进行全序测定及分析，为了解其基因组织结构与生物功能的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法 根据登革２型国际标准株ＮＧＣ的序列，设计１３对重叠引物，通过ＲＴ－ＰＸＣＲ扩增同Ｄ２－０４株不同的ｃＤＮＡ片段，分别克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体，转化受体菌ＤＨ５α，挑取阳性克隆进行ＰＣＲ、酶切鉴定及序列测定。结果 Ｄ２－０４株的基因组全长１０７２３个碱基，     

流行性乙型脑炎病毒脑脊液分离株"47株"全基因组特征分析

目的 对1950年分离自我国黑龙江省患者脑脊液的乙脑病毒"47株"进行全基因组序列的测定和分析,全面了解其全基因组特征.方法 复苏毒种提取病毒RNA,使用自行设计的乙脑病毒全基因组扩增测序引物,完成对病毒全基因组序列的测定.采用DNAStar、Modeltest、Phylip等生物软件完成全基因组核苷酸、氨基酸序列差异分析和乙脑病毒全基因组的系统进化分析.结果 乙脑病毒"47株"全长10 977个核苷酸.96至10 391位为开放读码框ORF,共10 296个核苷酸,编码3432个氨基酸."47株"与5株疫苗株在全基因组水平的核苷酸差异在2.4%～4.4%之间,氨基酸差异在0.3%～1.1%之间.乙脑病毒全基因组最适进化模型为GTR+I+G.全基因组进化分析显示"47株"属于基因Ⅲ型乙脑病毒.结论 "47株"全基因组核苷酸和氨基酸高度保守,属于基因Ⅲ型乙脑病毒.     

乙型脑炎病毒高株部分基因序列分析

乙型脑炎病毒 (ＪＥＶ)高顺生株 (高株 )是我国学者于 6 0年代从病人脑内分离到的乙脑病毒野毒株 ,其血凝活性的ｐＨ值较宽 ,与其他乙脑毒株不同 ,国内外对高株分子生物学研究尚未开展。我们对高株这两段基因保守区进行了ＤＮＡ序列分析 ,以初步了解高株与其他乙脑野毒株基因序列的不同 ,为进一步阐明高株基因组结构与功能的关系奠定基础。1　材料和方法1 1　病毒的培养　将中国预防医学科学院病毒学研究所虫媒病毒研究室冻存的感染高顺生野毒株的鼠脑在无菌状态下仔细研磨 ,离心取上清 ,10倍稀释后接种单层ＢＨＫ细胞 ,数天后出现典型细胞…     

乙型脑炎病毒持续感染株E区序列变异与病毒性状的关系

目的研究乙型脑炎病毒（JaGAr-01株和Nakayama株）持续感染变异株性状与E区基因序列的关系.方法将两种乙脑病毒野生株分别感染人肝癌KN73细胞,建立乙型脑炎病毒持续感染系.采用PFU法进行病毒滴度测定;为探讨持续感染病毒的增殖性,将两种病毒野生株及其持续感染株分别感染KN73细胞;利用E区特异引物以RT-PCR法得到两种病毒E区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株E区序列进行比较.结果在KN73细胞中两种持续感染株的增殖性比野生株明显低下.E区基因测序显示：与JaGAr-01野生株比较,其持续感染变异株有4个氨基酸发生置换（第61位酪氨酸→天门冬氨酸,第219位组氨酸→酪氨酸,第384位缬氨酸→谷氨酸,第418位脯氨酸→丙氨酸）;持续感染Nakayama株与其野生株相比有11个氨基酸发生置换（第51位精氨酸→丝氨酸,第61位酪氨酸→天门冬氨酸,第83位赖氨酸→谷氨酸,第123位丝氨酸→精氨酸,第209位精氨酸→赖氨酸,第227位脯氨酸→丝氨酸,第276位天门冬氨酸→丝氨酸,第290位精氨酸→赖氨酸,第387位赖氨酸→精氨酸,第418位亮氨酸→脯氨酸,第454位精氨酸→甘氨酸）.对比还显示基因变异后的持续感染JaGAr-01株和持续感染Nakayama株氨基酸排列的相同性达99.2%.结论乙脑病毒的持续感染变异株增殖性低于野生株;乙脑病毒变异株E区存在基因变异.     

A retrospective investigation on the phenotype and stability of the E-protein gene in Japanese Encephalitis （JE） virus strain SA14-14-2 used live-attenuated JE vaccine

InfectionwithJapaneseEncephalitis(JE)virus leadingtotheacuteinflammationofcentralner voussystemisthemostserioustypeofviralen cephalitis.Thevirusistransmittedthroughazoo noticcycle,andthecasefatalityrateofpatients causedbythisvirusisratherhigh,displayingpersistentneurologicalorpsychologicalconsequences inmorethanhalfofthesurvivors.ThegenomeofJEvirusisasingle,positively strandedRNAofapproximately11kb[5′C prM M E NS1NS2a NS2b NS3NS4a NS4b NS53′],whichencodes3structuralproteins,capsid(…     

The stability of E protein gene of the Japanese encephalitis live attenuated vaccine virus SA_(14)-14-2

Japanese encephalitis (JE) virusis one of the ma-jor causes of serious encephalitis throughout Eastand South Asia .Itistransmittedto humans mainlyby infected mosquitoes . Nowadays there are twokinds of Japanese encephalitis vaccines ,inactivat-ed vaccine and live attenuated vaccine , on themarket in China . The Japanese encephalitis wildstrain SA14wasisolatedforthefirsttimein Xi-an,China in1954 .Threelive attenuated vaccine can-didates,SA14-14-2 [1] ,SA14-5-3 [2] and SA14-2-8 [3] , wer…     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

Vero cell-derived inactivated West Nile (WN) vaccine induces protective immunity against lethal WN virus infection in mice and shows a facilitated neutralizing antibody response in mice previously immunized with Japanese encephalitis vaccine

A novel Vero cell-derived inactivated WN vaccine (WN-VAX) was prepared from virus strain NY99-35262. Two immunizations with WN-VAX induced high levels of neutralizing antibody to WN virus. All immunized mice were protected against challenge with a lethal dose of WN virus. No WN viremia was detected, and the level of WN virus-neutralizing antibody increased rapidly. WN-VAX was then examined for immunogenicity in mice previously immunized with Japanese encephalitis vaccine (JE-VAX). Immunization with WN-VAX induced WN virus-neutralizing antibody in all mice previously immunized with JE-VAX but in only half of the control mice at 10 weeks. These results indicate that WN-VAX induced complete protective immunity against lethal WN infection and that the WN-VAX-induced antibody response is facilitated in JE-VAX-immunized mice. This WN-VAX is thus a candidate WN vaccine for humans.     

日本脑炎病毒和乙型肝炎病毒抗原真核表达载体的体外共表达

作者构建了日本脑炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＪＥＶ）前膜蛋白囊膜蛋白（ｐｒＭＥ）和乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）前Ｓ蛋白（ｐｒｅＳ）的真核表达载体，分别命名为ｐｃＤＮＡ３Ｅ和ｐＳＧ５ｐｒｅＳ。等量混合这两种质粒，转染ＣＯＳ７细胞进行瞬间表达，应用单克隆抗本ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗原。结果表明，单独及混合转染的细胞培养上清中均有特异性抗原表达。本项研究为进一步发展新型日本脑炎病毒和乙型肝炎病毒核酸疫苗打下了基础，也初步显示了核酸疫苗技术在联合疫苗研制中的应用前景