缺氧对乳鼠脊髓神经元低氧诱导因子-1α的影响

目的研究缺氧对脊髓神经元低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达和凋亡的变化,探讨HIF-1α在耐受缺氧和诱导凋亡机制中的作用。方法以体外培养的乳鼠脊髓神经元细胞为研究对象。采用激光共聚焦显微镜(LCSM)、DNA琼脂糖凝胶电泳观察缺氧诱导脊髓神经元凋亡的变化;免疫组化检测HIF-1α在缺氧脊髓神经元中的表达;流式细胞术(FCM)检测缺氧对脊髓神经元p53、Bcl-2蛋白水平表达的影响。结果持续缺氧显著抑制脊髓神经元细胞的生长;荧光显微镜下可见脊髓神经元细胞呈典型凋亡的形态学改变。脊髓神经元缺氧2、4 h时HIF-1α、P53、Bcl-2表达上调(P<0.01),8 h时其表达下调(P<0.05)。结论缺氧预处理诱导的HIF-1α的表达,在脊髓神经元的耐受缺氧和诱导凋亡机制中起着重要的作用。     

糖皮质激素对大鼠海马神经元影响的体外研究

目的　探讨在体外条件下糖皮质激素 (glucocorticoids ,GCs)对海马神经元的影响及其机制。方法　取新生大鼠海马组织进行原代分离培养 ,通过细胞形态学观察、细胞酶学噻唑蓝 (methylthiazolyl,MTT)测定、DNA原位末端标记 (TdT mediateddUTPNickEndLablelingmethod ,TUNEL)法以及凋亡相关蛋白Bcl 2、Bax的表达观察 0、10 - 9、10 - 8、10 - 7、10 - 6 、10 - 5mol/L不同浓度的地塞米松 (dexam ethasone ,DEX)作用 2 4h对大鼠海马神经元的影响。结果　高浓度的DEX可以引起明显的海马神经元形态变化 ,降低海马神经元的活性 ,并通过上调Bax的表达 ,下调Bcl 2的表达促进海马神经元的凋亡。结论　高浓度糖皮质激素可促进海马神经元的凋亡从而降低海马神经元的活性。     

缺氧后胚鼠神经元自噬及凋亡相关蛋白的表达

目的观察缺氧致胚鼠神经元损伤后,凋亡和自噬的发生及变化情况,并探讨其在脑细胞缺血缺氧中的意义。方法取大鼠的胚鼠皮质神经元进行体外原代培养,建立缺氧(oxygen deprivation,OD)损伤模型,通过Western blot方法检测不同缺氧时间点自噬微管相关蛋白轻链3抗体(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)以及半胱天冬蛋白酶3(caspase-3)的表达情况。结果神经元于缺氧后可观察到自噬的发生,同时凋亡也随之出现,两者的标志蛋白于OD 0.5h开始表达,并且表达逐渐增加,于OD 4h时间点到达高峰,OD 6h时后凋亡标志蛋白caspase-3继续上调,自噬的标志蛋白LC3表达不再增强。结论 (1)除凋亡外,单纯缺氧能诱导胚鼠神经元发生自噬现象;(2)缺氧所致神经元的损伤过程中,凋亡与自噬同时发生,且表达趋势在OD 4h内一致,OD 4h后细胞凋亡增强。     

磷酸化C—JUN不参与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡

观察磷酸化 C- JUN与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关系。在培养的小脑颗粒神经元建立谷氨酸凋亡模型 ;采用 MTT法分析细胞存活率 ,相差显微镜观察形态学 ,DNA凝胶电泳法分析细胞凋亡和原位细胞荧光免疫组织化学法检测磷酸化 C- JUN。结果显示 ,谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元细胞体积缩小 ,突触断裂、消失 ,DNA电泳呈典型的“梯状”条带 ;谷氨酸处理 2 4 h后细胞存活率为 2 8.6%± 5.2 %。神经元在谷氨酸处理 5,30 min及 1 ,2 ,4,8,1 6和 2 4 h后均未检测到有磷酸化 C- JUN阳性细胞 ,与去极化组 ( 2 5mmol/L KCl)相同。而复极化组 ( 5mmol/L KCl)则在 30 min检测到大量的磷酸化 C- JUN阳性细胞 ,4h荧光最强并持续。处理 4h后 ,40 0倍荧光显微镜下 ,复极化组、去极化组和谷氨酸组的磷酸化 C- JUN阳性细胞数分别为 1 2 4± 1 7,8± 3,5± 3。上述结果提示 ,谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡 ,磷酸化 C- JUN不参与谷氨酸诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡。     

磷酸化C-JUN不参与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡

观察磷酸化C-JUN与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡的关系.在培养的小脑颗粒神经元建立谷氨酸凋亡模型;采用MTT法分析细胞存活率,相差显微镜观察形态学,DNA凝胶电泳法分析细胞凋亡和原位细胞荧光免疫组织化学法检测磷酸化C-JUN.结果显示,谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元细胞体积缩小,突触断裂、消失,DNA电泳呈典型的"梯状"条带;谷氨酸处理24 h后细胞存活率为28.6 %±5.2 %.神经元在谷氨酸处理5,30 min及1,2,4,8,16和24 h后均未检测到有磷酸化C-JUN阳性细胞,与去极化组(25 mmol/L KCl)相同.而复极化组(5 mmol/L KCl)则在30 min检测到大量的磷酸化C-JUN阳性细胞,4 h荧光最强并持续.处理4 h后,400 倍荧光显微镜下,复极化组、去极化组和谷氨酸组的磷酸化C-JUN阳性细胞数分别为124 ±17,8±3,5±3.上述结果提示,谷氨酸诱导小脑颗粒神经元凋亡,磷酸化C-JUN不参与谷氨酸诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡.     

PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元死亡中作用

目的 探讨PERK通路在内质网应激诱导的中脑多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法 利用小鼠原代培养成纤维细胞,应用Western blot和免疫荧光染色法,观察内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin)对PERK通路的激活,利用小鼠原代培养中脑多巴胺能神经元,应用TH免疫荧光染色法对存活的中脑多巴胺能神经元进行计数,以观察PERK抑制剂GSK2606414对长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡的影响。结果 在Thapsigargin处理后的原代成纤维细胞中p-PERK、p-eIF2α、ATF4水平均显著升高,Thapsigargin诱导中脑多巴胺能神经元死亡,PERK抑制剂GSK2606414可显著减少长时程Thapsigargin处理诱导的中脑多巴胺能神经元死亡。结论 内质网应激激活PERK通路;长时程内质网应激导致中脑多巴胺能神经元死亡,抑制PERK通路的激活可以缓解长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元死亡,PERK通路参与了长时程内质网应激导致的中脑多巴胺能神经元变性死亡。     

铜诱导原代皮层神经元凋亡的信号传导通路研究

目的 研究铜诱导皮层神经元凋亡的机制以及凋亡信号调节激酶-1(ASK1)抑制剂硫氧还蛋白(trx)的保护作用,探讨ASK1介导的c-Jtm氨基末端激酶(JNK)/caspase-3信号传导通路的可能作用机制. 方法 醋酸铜和trx预处理体外培养的原代皮层神经元,MTT法检测神经元活力,Annexin-V/PI法检测神经元凋亡,Western blot检测不同浓度和时间点磷酸化的ASK1、JNK和caspase-3蛋白表达. 结果 体外培养原代皮层神经元经醋酸铜诱导后,凋亡率上升,细胞活力下降,浓度越大下降越多,trx能拮抗此作用.Western blot检测发现磷酸化ASKl和JNK在4h时开始出现升高,48h表达达到高峰,呈时间和浓度梯度依赖;活化的caspase-3在24h出现活性表达,48h达到高峰.使用trx后,磷酸化ASK1、JNK和caspase-3蛋白表达减少,细胞凋亡率下降,活力升高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 铜能诱导体外培养原代皮层神经元发生凋亡,ASK1介导的JNK/caspase-3信号转导通路在铜的神经元毒性过程中发挥了重要作用:trx对铜沉积导致的皮层神经元损伤可能起到保护作用.     

siRNA细胞色素c基因静默对大鼠脑皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的影响

目的探讨体外模拟缺血再灌注（ischemia／reperfusion，IS／RE）后大鼠脑皮质神经元内质网应激凋亡的机制及抑制细胞色素c（Cyt c）表达对内质网应激的影响。方法体外培养SD乳鼠脑皮质神经元，用免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度；用流式细胞术AnnexinV、PI双标检测调亡率及活性Caspase-3，-7，-9表达水平；用Westernblot免疫印迹方法检测Caspase-12、GRP78、Bcl-2、Cytc蛋白表达水平。结果SD乳鼠皮质神经元可纯化体外培养；空转染组神经元模拟缺血6h再灌注24h及48h（IS6h／RE24h、48h）细胞凋亡率分别是17．95％、22．62％；CytC基冈静默后凋亡率分别降至10．26％、9．37％，空转染组与转染组比较有统计学意义（P＜0．05）；空转染组神经元模拟缺血再灌注后GRP78、Cytc、活性Caspase-3、caspase-9、caspasel2表达均增加．Bcl2表达减少；siRNA Cyt c基因静默后神经元Bcl-2表达增加，GRP78、活性caspase-12、caspase-3、caspase-9表达明显降低，2组比较有统计学意义（P＜0．05）；空转染组和转染组均未检测到caspase-7表达。结论体外模拟缺血再灌注后脑皮质神经元发生凋亡，线粒体、内质网应激参与了神经元凋亡；抑制细胞色素c释放对内质网应激凋亡有抑制作用。     

一氧化氮在缺氧复氧性神经元凋亡中的作用

目的观察神经元缺氧复氧损伤时NO的动态变化及其与神经元凋亡的关系。方法取孕13~15d ICR小鼠,无菌条件下对胎鼠大脑皮质神经元进行原代分离培养,建立缺氧复氧诱导的皮质神经元凋亡模型。用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用MTT测定细胞活性,并在电镜下观察细胞形态学变化。结果经缺氧复氧处理的神经元,随着缺氧时间延长细胞存活率逐渐下降,神经元凋亡率呈时间依赖性升高,NO含量逐渐升高,至缺氧8h复氧24h达到高峰,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。细胞超微结构呈现凋亡样改变。结论NO介导了缺氧复氧性神经元凋亡过程。     

糖氧剥夺诱导神经元磷酸化Rb蛋白表达特点及其与凋亡关系研究

目的观察糖氧剥夺(OGD)诱导体外培养的皮层神经元细胞内磷酸化Rb蛋白(p-Rb)的表达特点并探讨其与神经元凋亡的关系。方法将体外培养的皮层神经元随机分为对照组、OGD1 h后恢复糖氧供给(OGD/R)6 h、12 h和24 h组。应用免疫荧光细胞化学染色观察神经元p-Rb表达特点及其与TUNEL染色的关系。结果 p-Rb在OGD/R各组神经元的表达率较对照组明显增高,主要在神经元细胞浆内强表达,OGD/R6h组p-Rb与TUNEL染色共定位细胞比例开始增高,12 h达最高,与对照组比较差异明显(P<0.01)。OGD/R24 h组很少观察到两者共定位染色。结论 Rb磷酸化介导的神经元细胞周期紊乱可能是缺血缺氧诱导的神经元早期凋亡机制之一。