不同年龄兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性分析

目的观察不同年龄兔骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外分离、培养、扩增的过程,并对其生长特性进行初步比较分析,为BMSC的临床应用提供技术方法和依据。方法选取出生1月、18月、36月的健康中国白兔,分成新生、成年、老年3组,采用密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,分离培养BMSC,用噻唑蓝(MTT)法观察其增殖及生长特征,用流式细胞仪检测细胞表面标志。结果各组BMSC均贴壁生长,呈成纤维细胞样BMSC典型形态,贴壁率的观察和生长曲线显示,在相同的培养条件下,新生兔细胞增殖最快,细胞可扩增能力最强,而老年兔细胞增殖最慢,细胞可扩增能力最弱,成年兔细胞介于两者之间。结论利用密度梯度离心法结合贴壁培养法可以从不同年龄兔中获得高纯度的BMSC,干细胞的活性和增殖能力随着年龄的增加而降低。     

Ferrociphenol lipid nanocapsule delivery by mesenchymal stromal cells in brain tumor therapy

The prognosis of patients with malignant glioma remains extremely poor despite surgery and improvements in radio- and chemo-therapies. Thus, treatment strategies that specifically target these tumors have the potential to greatly improve therapeutic outcomes. “Marrow-isolated adult multilineage inducible” cells (MIAMI cells) are a subpopulation of mesenchymal stromal cells (MSCs) which possess the ability to migrate to brain tumors. We have previously shown that MIAMI cells were able to efficiently incorporate lipid nanocapsules (LNCs) without altering either their stem cell properties or their migration capacity. In this study, we assessed whether the cytotoxic effects of MIAMI cells loaded with LNCs containing an organometallic complex (ferrociphenol or Fc-diOH) could be used to treat brain tumors. The results showed that MIAMI cells internalized Fc-diOH-LNCs and that this internalization did not induce MIAMI cell death. Furthermore, Fc-diOH-LNC-loaded MIAMI cells produced a cytotoxic effect on U87MG glioma cells in vitro. This cytotoxic effect was validated in vivo after intratumoral injection of Fc-diOH-LNC-loaded MIAMI cells in a heterotopic U87MG glioma model in nude mice. These promising results open up a new field of treatment in which cellular vehicles and nanoparticles can be combined to treat brain tumors.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制研究

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)mRNA的表达,以了解MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和试验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP)-2,胶原酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12 h PTN mRNA的表达。结果接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10～14 d融合。第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12 h变形细胞增多,细长突起相互连接。24 h后变形细胞增多不明显。诱导后12 h大部分细胞表达NSE(64.79±0.07)%、MAP-2(60.05±0.09)%,未检测到GFAP的表达,RT-PCR半定量检测有NSE mRNA的表达(0.66±0.15)。实验组诱导后12 h细胞有PTN mRNA的表达(0.689±0.017)。结论建立了稳定的成人MSCs培养增殖体系,MSCs可体外诱导分化为神经元样细胞,在分化过程中有外观形态变化和特异性标志物NSE和MAP-2的表达,同时有PTN mRNA的表达,提示PTN可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞体外增殖及凋亡的影响

目的观察地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响。方法利用1.073g/mLPercoll分离液以梯度密度分离法获取人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,进行体外培养。成骨诱导组细胞用地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠处理,分别进行ALP染色和矿化结节染色。实验组细胞分别以10^-9mol/L、10^-8mol/L、10^-7mol/L和10^-6mol/L地塞米松加以干预,MTT法检测各组细胞的增殖率;流式细胞仪定量分析hMSCs的凋亡率。结果成骨诱导组细胞ALP染色和矿化结节染色均为阳性,对照组为阴性;低浓度（10^-9mol/L）地塞米松对细胞的体外增殖无明显影响（P〉0.05）,10^-8mol/L及以上浓度地塞米松可明显抑制细胞的增殖（P〈0.01）;hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高（P〈0.01）。结论地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠可促使hMSCs成骨分化,10^-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖,地塞米松能促进体外培养的人骨髓间充质干细胞凋亡。     

骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞迁移能力变化的研究

目的研究体外定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞的方法,探讨其分化后迁移能力变化的分子机制。方法体外培养BMSCs,以β-巯基乙醇(BME)1 mmol·L-1诱导分化,于诱导后12 h、24 h分别观察细胞形态变化,RT-PCR鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(Neurofilament)、胶质纤维酸性蛋白(β-tubulinⅢ)mRNA的变化。Western blot检测CXCR4表达变化,细胞迁移实验检测BMSCs诱导前后迁移能力的变化。结果诱导后,BMSCs胞体收缩,突起伸出;RT-PCR发现诱导出的神经元样细胞的NSE、Neurofilament、β-tubulinⅢmRNA明显增加;Western blot结果表明神经元样细胞表面CXCR4的表达明显增加,细胞迁移实验发现神经元样细胞向SDF-1α的迁移能力明显增加。用CXCR4特异的抑制剂AMD3100处理后细胞迁移被明显抑制。结论在体外骨髓基质干细胞以BME为诱导剂可定向分化为神经元样细胞,且发现其迁移能力明显增加,其机制可能与其表面CXCR4表达上调有关。     

人骨髓基质干细胞体外分离培养的优化及定向分化的调控

目的 通过改进人骨髓基质干细胞（hBMSCs）的体外培养和定向诱导为神经细胞的方法,以获得纯化hBMSCs以及阳性率更高的神经细胞。方法 采用Percoll-Paque液（1．073g／m1）分离hBMSCs,Mensen Cult培养基体外培养扩增,流式细胞仪检测纯化率。至P3代加入特定组合诱导剂进行定向诱导分化,观察hBMSCs分化为神经细胞的形态学变化,免疫组化和免疫荧光检测特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞数。结果Mensen Cult培养hBMSCs的扩增速度快,纯化率高;在加入特定诱导剂后细胞出现胞体收缩、突起伸出等神经细胞的形态改变,NSE、NF、GFAP均有不同程度阳性率。结论 Mensen Cult是一种较为优秀的hBMSCs体外培养基,而且我们使用的诱导配方效果确切。     

骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞具有取材简单、增殖速度快、培养过程中始终保持多向分化的潜能等特点,已经成为干细胞研究领域的热点,是最好的组织工程种子细胞之一,还可以诱导分化为神经细胞。本文对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展作一综述。     

大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的体外诱导动态观察

目的 动态观察体外定向诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化为神经细胞的时程变化。方法 采用Percoll-Paque液(1．073g／ml)分离BMSCs体外扩增培养后，加入丁羟茴醚 二甲基亚砜诱导其分化为神经细胞，分别于1、2、3、4h后光镜下观察形态变化及通过免疫组化和免疫荧光染色测定特异性神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数。结果 BMSCs在加入诱导剂后1h出现胞体收缩，突起伸出，有不同程度NSE、NF、GFAP表达，3h后汰高峰。结论 丁羟茼醚 二甲基亚砜在一定时间内是一种较好的体外诱导剂。     

烧伤小鼠血清对离体培养的骨髓基质细胞的影响

目的　研究小鼠烧伤血清对离体培养的骨髓基质细胞的影响。方法　利用流式细胞仪、HE染色等技术观察小鼠烧伤后不同时间的血清对小鼠骨髓基质细胞 (BMSC)贴壁率和基质祖细胞 (CFU F)集落形成的作用及对不同剂量的6 0 Coγ射线体外照射后的BMSC的影响。结果　小鼠烧伤后 1～ 11d的血清对基质细胞贴壁率和CFU F的形成主要表现为抑制作用 ,13～ 15d的血清主要表现为刺激作用。小鼠烧伤后 15d的血清可明显减少 5 0、70Gy照射后BMSC的凋亡和坏死。 结论　小鼠烧伤后不同时间的血清对BMSC的作用不同 ,可能与血清内细胞因子的变化有关。     

大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响

目的观察大黄素对骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响,以探讨大黄素对骨质疏松发生时伴随的脂肪增多现象中所起的作用。方法16只3mon龄SD大鼠随机分成4组:对照组、激素组、复方碳酸钙治疗组、大黄素治疗组。给药90d后收集骨髓基质细胞。应用油红O染色法及RTPCR的方法判断是否成功诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化,同时观察大黄素对骨髓基质细胞成脂分化后脂肪细胞的数目和脂蛋白脂酶mRNA表达的影响。结果体内灌胃给予泼尼松的激素组大鼠的骨髓基质细胞体外培养时分化为脂肪细胞的能力明显增强。复方碳酸钙组和大黄素组大鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞的能力较激素组明显下降,其中大黄素下调脂蛋白脂酶mRNA表达的作用强于复方碳酸钙。结论体内给予糖皮质激素后,骨髓基质细胞体外培养时自发向脂肪细胞方向分化的能力和经体外诱导后向脂肪细胞方向分化的能力都明显增强,大黄素可能有对抗糖皮质激素成脂诱导的作用。     

人参皂苷Rg1对培养大鼠骨髓间充质干细胞增殖影响的机制研究

目的研究人参皂苷Rg1对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖影响的可能机制。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,分为药物干预组、对照组,药物干预组以1×10-6mol.L-1人参皂苷Rg1孵育48h,对照组未加药物常规培养;分别用骨髓CFU-F体外培养法、胸腺嘧啶核苷参入法及MTT法测定大鼠BMSC的增殖情况,同时测定BMSC的GATA转录因子1～3的表达及其与DNA结合活性。结果人参皂苷Rg1刺激后BMSC的GATA1和GATA2 mRNA表达与对照组相比分别上调1.42±0.31(P<0.01)和2.70±0.73(P<0.01)倍,并且人参皂苷Rg1刺激后BMSC的GATA与DNA结合活性明显增高。结论人参皂苷Rg1可促进大鼠BMSC增殖,其机制可能是通过上调GATA1和GATA2的表达以及其与DNA的结合活性来实现。     

应用密度梯度离心法分离扩增兔骨髓基质细胞的体会

目的探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSc)的条件,为组织工程学选择合适的种子细胞奠定基础。方法采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果兔．BMSc在第7代前性状稳定,生长曲线相似;第4天分裂指数最高为15％;传代后10h贴壁率高达90％。结论密度梯度离心法是分离兔BMSc的理想方法,BMSc能为未来组织工程提供足量种子细胞。     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

还原型谷胱苷肽诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化形成神经细胞

目的 研究还原型谷胱苷肽(GSH)对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的诱导分化作用.方法 用SD大鼠股骨、胫骨以及肱骨骨髓细胞体外培养.采用GSH诱导rBMSCs 24h,免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)表达率.结果 诱导6、24h时,MSCs分化成神经元样细胞,形成网络状结构,免疫细胞化学染色诱导出的神经元样细胞NSE表达阳性率分别为(64.0±4.3)%和(71.0±5.0)%.结论 GSH可诱导MSCs分化形成神经元样细胞.     

淫羊藿苷对体外在无地塞米松培养基中诱导培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的：探讨在无地塞米松（dexamethasone）时淫羊藿苷（icariin,ICA）对体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响,并试图寻找一种新的或更强的促体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的诱导剂。方法用1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷或1×10－8 mol·L －1的地塞米松对大鼠骨髓基质细胞分别进行药物干预,细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞增殖,碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,茜素红染色检测钙化结节数量,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的信使 RNA（mRNA）表达情况。结果1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷在无地塞米松的培养基中能显著提高大鼠骨髓基质细胞 ALP 活性;明显增加大鼠骨髓基质细胞钙化结节数目;显著上调BMP、OPG mRNA 水平以及 OPG／RANKL mRNA 比值。结论淫羊藿苷可能是一种潜在的促体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的新诱导剂。     

人骨髓基质干细胞向神经元分化的实验方法改进

目的 改进人骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化的方法,使诱导分化后的神经元样细胞存活时间延长,为其将来可能的临床应用提供理论基础。方法 采用Percoll液分离成人骨髓基质干细胞(hBMSCs),体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达．应用丁羟茴醚(BHA)和二甲基亚砜(DMSO),NT-3和PDGF定向诱导hBMSCs分化为神经元样细胞。结果 hBMSCs在体外扩增后,流式细胞检测结果显示CD29、CD44表达阳性,CD11b、CD45表达阴性;加入诱导剂一定时间后,细胞形态发生改变,同时神经丝蛋白表达阳性,胶质纤维酸性蛋白表达阳性。结论 成人骨髓基质干细胞在体外可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞,而且较单独使用BHA DMSO诱导的方法延长了诱导后的细胞存活时间。     

骨髓基质细胞在不同载体表面生长碱性磷酸酶活性的表达

目的研究骨髓基质细胞在牙骨质和骨片表面生长ALP活性的表达情况。方法将骨髓基质细胞与牙骨质片和股骨片在体外共同培养,分别在第7天、第28天进行光镜观察及碱性磷酸酶的测定。结果骨髓基质细胞在牙骨质片和骨片表面生长,两组均有ALP的表达,牙骨质组较弱。结论结果表达在体外矿化液培养条件下,骨髓基质细胞在牙骨质和骨片表面生长附着良好,可向成骨样细胞转化。     

脑脊液对骨髓基质细胞作用的动态观察

目的 动态观察脑脊液对骨髓基质细胞向神经元方向分化的作用。方法 采用Percoll液分离大鼠骨髓基质细胞,体外扩增。当第2或第3代细胞生长达60％～70％融合时,加入不同病人脑脊液,分别于不同时间观察其形态学改变,取诱导后的细胞作免疫细胞化学鉴定。结果 在颅咽管病人脑脊液中骨髓基质细胞的分化速度较快,且发生政变的程度较大;而在脑外伤积水的病人脑脊液中骨髓基质细胞的分化速度相对较慢,且发生改变的细胞数较前者少。免疫细胞化学染色NSE呈弱阳性,NF呈弱阳性。结论 脑脊液可诱导骨髓基质细胞向神经元方向分化。     

诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨细胞诱导分化的能力。方法选用不同代次的MSCs,使用条件培养基,观察细胞的形态变化,采用细胞化学和免疫组化的方法检测碱性磷酸酶、钙盐沉积及Ⅰ型胶原的表达。结果MSCs在条件培养基中,15d后可见细胞变为多边形,碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原染色阳性,形成钙结节,表现成骨细胞分化特点。结论在一定培养条件下成功诱导人MSCs向成骨细胞分化。在骨组织工程学方面MSCs作为种子细胞具有潜在的应用价值。