血红素加氧酶-1抗人血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的转染pcDNA3HO1入人血管内皮细胞(HUVEC)并表达,研究血红素加氧酶_1(HO_1)保护细胞凋亡的作用。方法将构建好的质粒用DOTAP包裹转入细胞中表达。用CCLR破碎细胞后,SDS_PAGE鉴定表达量,采用TNF_α诱导细胞凋亡,以流式细胞仪测定细胞的凋亡率;采用Hemin和SnPP分别刺激细胞,促进和抑制HO_1在细胞中的表达。结果经Hemin处理后细胞的凋亡率均在20%以下,而SnPP处理后细胞的凋亡率大幅上升,最高可达到95%以上。实验数据显示HO_1基因表达被抑制时细胞凋亡率是诱导时的5~20倍。结论细胞凋亡率与质粒转染效率和HO_1表达量均成反比,提示HO_1对细胞有保护作用,可以抑制细胞凋亡,在临床具有广泛的应用前景。     

血红素加氧酶-1抑制哮喘气道炎症的研究

目的探讨血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）在小鼠支气管哮喘模型中的抗炎作用。方法用卵清蛋白（OVA）致敏、激发小鼠建立哮喘动物模型,并在致敏、激发过程中分别经Heroin、SnPP处理。分别测定激发后各组动物血清OVA特异性IgE（OVA-SIgE）、支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid,BALF）中细胞总数和嗜酸性粒细胞（eosinophil,EOS）,结合病理切片分析气道炎症状况。结果OVA组、Heine组、SnPP组血清OVA—SIgE和BALF中细胞总数及EOS数明显高于正常对照组,但Heine组IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数明显低于OVA组;而OVA组和SnPP组间IgE水平及BALF中细胞总数和EOS数差异无显著性;病理切片显示OVA组、Heroin组、SnPP组气道组织均以嗜酸性粒细胞浸润为主,但Heroin组气道炎症仍明显轻于OVA组和SnPP组。结论用Heroin诱导HO-1高表达后血清OVA-SIgE明显下降,气道炎症减轻,提示HO-1在支气管哮喘中具有抗炎作用。     

联合转染A20、HO-1基因对大鼠胰岛抗凋亡能力影响的研究

目的 研究A20基因、血红素加氧酶1基因(heme oxygenase 1 gene,HO-1)转染在大鼠胰岛细胞中的表达情况及对体外培养条件下胰岛活性、拮抗放线菌酮(CHX)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的胰岛细胞凋亡作用的影响.方法 构建A20、HO-1和增强绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒转移载体,荧光显微镜连续观察EGFP表达情况,评估转基因效率、确定诱导凋亡时机.Western印迹测定A20和HO-I蛋白表达.超敏ELISA试剂盒检测胰岛素浓度.胰岛经CHX+ TNF-α处理48 h进行TUNEL、流式细胞仪检测凋亡率.Western印迹检测半胱氨酸蛋白酶-3的活化.结果 (1)分别以A20和HO-1慢病毒转染胰岛检测表明A20和HO-1蛋白均呈高表达.(2)胰岛细胞经培养48h和96 h,转基因各组胰岛素浓度高于空白对照组(P＜0.01).(3)CHX+ TNF-α诱导胰岛细胞凋亡后,转A20组胰岛素浓度为(93.58 ±4.12) μg/ml、转HO-1组胰岛素浓度为(88.98±4.77) μg/ml,联合转A20和HO-1组胰岛素浓度(103.33 ±3.16) μg/ml,均高于转EGFP组[(9.03±0.65) μg/ml]和空白对照组[(8.86±0.38) μg/ml,P＜0.001].Western印迹法检测显示联合转A20/HO-1基因组活化型半胱氨酸蛋白酶-3表达水平最低.结论 原代胰岛细胞中高效表达的A20和HO-1蛋白具有抗CHX+ TNF-α诱导的胰岛凋亡作用,联合转A20和HO-1基因有协同抗凋亡效应.     

布地奈德对哮喘大鼠模型肺组织血红素氧合酶-1的调控作用

目的：研究大鼠哮喘模型肺组织血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白及基因表达特点,以及布地奈德(budesonide,BUD)对HO-1蛋白及基因表达的影响。方法：用卵清蛋白(OVA)致敏、激发大鼠建立哮喘动物模型,并在致敏、激发过程中分别经地塞米松(DXM) 、血晶素(Hemin)及BUD处理。分别测定激发后各组动物全血COHb 的百分比含量;计算肺泡灌洗液（BALF）沉渣中细胞总数和分类百分比;进行支气管周围炎性细胞浸润评分;利用免疫组化和RT-PCR检测方式观察HO-1在哮喘大鼠肺组织的蛋白及基因表达。结果：肺组织的病理改变及BALF细胞学检测显示Hemin (H)组、DXM (D)组和BUD (B)组炎性细胞浸润较哮喘(A)组有显著减轻(P<0.01或P<0.05）。与对照(C)组相比,A、H、D和B组HO-1蛋白、基因表达以及碳氧血红蛋白(COHb)含量显著性升高(P<0.01);而与A组相比,H、D和B组HO-1蛋白及mRNA表达亦显著升高(P<0.01或P<0.05）;D组和H组COHb含量显著升高（P<0.05）。结论：哮喘大鼠的肺组织HO-1表达水平及活性显著增加,提示HO-1可能参与了哮喘的发病过程;HO-1对大鼠哮喘模型气道炎症有保护作用;BUD和DXM对大鼠哮喘模型气道炎症有保护作用,可能通过上调肺组织HO-1表达实现。     

血红素加氧酶-1介导Tr1细胞在哮喘动物模型中的免疫调节作用

目的 探讨血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)介导1型T调节细胞(type 1 T regulatory cells,Tr1)在哮喘动物模型中的免疫调节作用.方法 用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏、激发C5786小鼠建立哮喘模型,并在致敏、激发阶段分别经血红素(hemin)和锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin,SnPP)干预.肺泡灌洗液细胞计数和肺脏病理组织学检测评价哮喘动物模型;real-time PCR和Western blot方法分别测定脾脏细胞内HO-1、IL-10mRNA表达和HO-1蛋白量;ELISA方法测定动物血清OVA-特异性IgE(OVA-sIgE)和IL-10水平;流式细胞计数测定脾脏细胞中CD4+CD25+IL-10+Treg、CD4+IL-10R+IFN-γR+Tr1的比例.结果 哮喘小鼠模型经hemin干预后,Tr1数量增加,脾脏细胞内HO-1和IL-10 mRNA表达上调,HO-1蛋白水平明显增加,血清IL-10水平增高,哮喘气道炎症减轻.结论 在哮喘动物模型中HO-1可能通过诱导Tr1细胞,增加IL-10的分泌,抑制哮喘气道炎症.     

姜黄素对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制

目的探讨姜黄素对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法首先用5～15μmol.L-1姜黄素处理H9c2心肌细胞12 h,双波长法检测血红素加氧酶-1(HO-1)活性。其次用400μmol.L-1过氧化氢(H2O2)处理H9c2心肌细胞3 h,以建立细胞氧化应激损伤模型,给予15μmol.L-1姜黄素预处理12 h,或在姜黄素预处理1 h前给予HO-1抑制剂Znpp-Ⅸ10μmol.L-1共孵育。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;采用流式细胞术Annexin-V FITC/PI染色和Caspase-3活性检测评估细胞凋亡;硫代巴比妥酸显色法检测细胞丙二醛(MDA)水平,氮蓝四唑显色法检测细胞总超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用Western blot法检测细胞核因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平。结果 HO-1活性检测显示,与对照组比较,5～15μmol.L-1姜黄素能够呈浓度依赖性地诱导HO-1活性增加。MTT和细胞凋亡检测显示,与H2O2组比较,15μmol.L-1姜黄素能够显著上调细胞存活率,下调细胞凋亡率和Caspase-3活性。细胞MDA水平和总SOD活性检测显示,15μmol.L-1姜黄素能够显著降低细胞MDA水平,提高总SOD活性。此外,与H2O2组相比,15μmol.L-1姜黄素能显著下调细胞NF-κB蛋白表达水平。HO-1抑制剂Znpp-Ⅸ能够部分逆转姜黄素的上述作用。结论姜黄素可能通过上调HO-1活性,抑制NF-κB激活以及维持细胞氧化还原平衡状态,对抗H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤。     

GATA-6基因在内源性一氧化碳抑制肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨GATA-6基因在内源性一氧化碳（CO）抑制肺动脉平滑肌细胞（PVSMCs）增殖中作用。方法体外培养雄性SD大鼠的PVSMCs，用血小板衍生生长因子（PDGF）诱导其增殖，用不同浓度氯血红素（Hemin）诱导血红素加氧酶（HO-1）．促进CO生成，用四唑盐（MTT）法测定不同条件下PVSMCs的细胞增殖，氚掺入法测定DNA合成，RT-PCR测定GATA-6基因mRNA的表达。结果CO可抑制PDGF诱导的PVSMCs增殖，此抑制作用呈剂量和时间依赖关系，高浓度Hemin可明显抑制PVSMCs增殖和DNA合成，在PDGF刺激后2h，PVSMCs的GATA-6表达明显下调，6h开始恢复，而CO可阻止GATA-6这种下调。结论CO可抑制PDGF诱导的PVSMCs增殖，PDGF可引起GATA-6基因表达下调，这种下调可被CO阻止；提示在抑制PVSMCs异常增殖过程中，CO可能通过调节GATA-6表达发挥作用。     

高氧暴露对早产儿血单个核细胞血红素加氧酶-1蛋白表达水平及活性的影响

目的观察高氧暴露早产儿血单个核细胞血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达水平及活性变化。方法选择2008年2月至2009年8月本科住院吸入高浓度氧的40例早产儿（高氧组）和吸入常压空气的40例早产儿（对照组）,用Western Blot法检测血中单个核细胞HO-1蛋白表达水平、血清胆红素水平和血浆一氧化碳血红蛋白（COHb）百分比,并进行比较分析。结果与对照组相比,高氧组HO-1蛋白表达明显增加[（1.78±0.25）比（1.12±0.31）,P〈0.01],胆红素生成量（nmol.mg-1.h-1）及血浆COHb含量（μmol/L）均显著增加[（76.25±11.33）比（53.47±8.73）,（6.73±0.42）比（2.47±0.34）,P均〈0.01]。结论高氧暴露可上调早产儿血单个核细胞HO-1的表达及活性。     

小分子干扰技术缄默Survivin基因表达对Jurkat细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的研究应用短发夹RNA(shRNA)技术缄默Survivin基因表达后对白血病细胞株Jurkat细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响。方法构建shRNA-Survivin重组质粒,电击转染至Jurkat细胞,G418筛选得到稳定表达重组质粒的细胞系,反转录(RT)-PCR检测转染细胞中Survivin mRNA表达水平变化,化疗药物长春新碱(VCR)及柔红霉素(DNR)分别作用各转染组细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定各组细胞的增殖抑制率,流式细胞术测定药物对各组细胞的凋亡效应。结果 DNA测序证实表达质粒构建成功,RT-PCR检测结果显示重组质粒能明显抑制Jurkat细胞Survivin mRNA表达,与对照组及阴性质粒转染组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。VCR及DNR作用转染细胞后,可有效抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡,与对照组及阴性质粒转染组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论 Survivin基因对Jurkat细胞生长有重要作用,转染shRNA-Survivin表达质粒能有效抑制细胞Survivin mRNA表达,缄默Survivin基因表达的细胞对化疗药物的敏感性显著增高。     

Apollon siRNA联合川芎嗪对白血病细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察Apollon siRNA 靶向沉默Apollon 基因联合川芎嗪（TMP）对人慢性粒细胞白血病细胞株K562 增殖及凋亡的影响。方法 根据前期实验筛选出的干扰效果最佳的Apollon siRNA 片段,构建pGPHIGFP-Neo-Apollon 真核表达载体,并将构建成功的载体转染至K562 细胞。将实验分为细胞对照组（未行任何处理）、阴性对照组（转染阴性质粒载体）和RNA 干扰组（转染pGPHI-GFP-Neo-Apollon 质粒载体）,利用RT-PCR 法和细胞免疫荧光法分别检测各组细胞Apollon mRNA 及蛋白的表达情况;再于上述分组基础上新增TMP 组（施加320 μg/mL TMP）、TMP+ 阴性对照组和TMP+RNA 干扰组,应用MTT 法和流式细胞术分别检测各组K562 细胞的增殖能力和细胞凋亡率。结果 构建的pGPHI-GFP-Neo-Apollon 载体能在K562 细胞内稳定表达;RNA 干扰组Apollon mRNA 及其蛋白的相对表达水平明显低于细胞对照组和阴性对照组（均P<0.05）;RNA 干扰组K562细胞的增殖抑制率和凋亡率高于细胞对照组（P<0.05）,与RNA 干扰组及TMP 组比较,siRNA 转染联合TMP能显著提高K562 细胞的增殖抑制率和凋亡率（均P<0.05）。结论 Apollon siRNA 转染能显著抑制K562 细胞增殖并促进其凋亡,且与TMP 联合使用对提高K562 细胞的增殖抑制率和凋亡率具有显著协同作用,提示siRNA技术联合药物在白血病治疗中具有重要的潜在价值。