人工反义基因对HLF细胞α1（Ⅰ）胶原基因表达的抑制作用

目的 研究纤维增生性疾病与Ⅰ型胶原蛋白异常表达的关系。方法 通过构建人工反义α1(Ⅰ）胶原基因真核表达质粒,探索反义RNA对人胚肺成纤维细胞（HLF细胞）α1(Ⅰ）胶原基因表达的抑制作用。结果 含有第Ⅰ内含子与第Ⅲ外显子区域的反义α1(Ⅰ）胶原基因片段的真核表达质粒能够在转录和翻译两个水平抑制α1(Ⅰ）胶原基因的表达。其中mRNA水平的抑制率为56．84％;蛋白水平的抑制率为54．24％。结论 反义RNA能够在转录和翻译两个水平抑制HLF细胞α1(Ⅰ）胶原基因的表达。     

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的 体外研究锤头型α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件。同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响。方法 将含α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ),经体外³²P标记转录后形成产物靶RNA。同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-gⅠ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录,产物(核酶)与各自的³²P-靶RNA按不同的条件混和反应,电泳后放射自显影观察结果。将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内,采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响。结果 两种核酶在37 ℃、42 ℃均能有效切割各自的靶RNA,对Mg²⁺浓度的要求范围较宽(10~20 mmol/L);反应温度从65 ℃逐渐降至并维持在37 ℃的条件下核酶切割活性显著提高。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低,胶原蛋白生成降低,胶原生成明显受抑制。结论 针对α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成。     

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的 体外研究锤头型α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件。同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响。方法 将含α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ)，经体外^32P标记转录后形成产物靶RNA。同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-gⅠ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录，产物(核酶)与各自的^32P-靶RNA按不同的条件混和反应，电泳后放射自显影观察结果。将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内，采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响。结果 两种核酶在37℃、42℃均能有效切割各自的靶RNA，对Mg^2 浓度的要求范围较宽(10～20mmol／L)；反应温度从65℃逐渐降至并维持在37℃的条件下核酶切割活性显提高。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低，胶原蛋白生成降低，胶原生成明显受抑制。结论 针对α1Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成。     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

金属蛋白酶组织抑制因子-1RNA干扰靶位的筛选

目的筛选金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）的RNA干扰靶位,从而有效抑制肝星状细胞的活化,阻断纤维化进程。方法针对TIMP-1基因,设计3个RNA干扰候选靶位,化学合成双链RNA（dsRNA）,分别转染经TGF-βl刺激活化的大鼠肝星状细胞。48h后通过荧光定量PCR测定TIMP-1、前胶原-α1（proc01-α1）mRNA相对表达量,计算抑制率;并取上清液检测肝纤维化指标,进行比较分析。结果针对TIMP-1基因的3个靶位,dsRNA都能不同程度抑制TIMP-1基因表达（,TIMP—1 mRNA相对表达抑制率在3个靶位分别为26．61％、17．42％和68．55％）,其下游Proeol-α1基因表达也受到抑制（抑制率在3个靶位分别为6．01％、6．57％和62．84％）;肝纤维化指标Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、透明质酸（HA）和层粘蛋白（LN）的表达也降低,而且针对第3靶位时降低最明显。结论针对TIMP-1基因第3靶位的dsRNA,即“TIMP—1．3组”对TIMP-1及其下游基因表达的抑制作用最强。成功筛选出,TIMP．1最有效的RNA干扰靶住,为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打了基础。     

反义α_1(Ⅰ)型前胶原基因片段真核细胞表达质粒的构建与鉴定

为利用反义RNA下调成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达，根据α1（Ⅰ）前胶原基因的核苷酸序列，我们自行设计了6条寡核苷酸引物，从正常人外周血全基因组DNA中分别扩增α1（Ⅰ）前胶原基因的转录起始区域及第Ⅰ，Ⅱ外显子区域3个基因片段。片段长度分别为229、166、195hP。为了后续进行定向克隆，在引物上分别引入了限制性内切酶酶切位点，并附加酶切保护碱基。由于1、刀、皿、V、力型多种胶原由不间断的重复的氨基酸序列（Gly－X－Y）n组成，其中X多为脯氨酸，而Y多为羟瞄氨酸，放各种胶原基因的结构极为相似，而且基因中GC含量很高（Gl…     

HIF-1α靶向RNAi慢病毒载体的构建及对Panc-1细胞HIF-1α抑制作用的研究

目的：构建针对缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体,并研究其对胰腺癌Panc-1细胞HIF-1α基因表达的抑制作用。方法：针对HIF-1α基因序列设计合成4条shRNA片断并构建RNAi慢病毒载体,同时构建HIF-1α基因过表达质粒。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot进行外源筛靶。将外源筛靶成功的干扰质粒psc1516进行慢病毒包装,再感染Panc-1细胞,Western blot和荧光定量PCR检测沉默前后Panc-1细胞中HIF-1α的蛋白及mRNA的表达。结果：经PCR及测序证实4种干扰载体及1种过表达载体构建成功,Western blot外源筛靶显示4个靶点均能有效敲减目的基因的表达。细胞试验表明psc1516干扰载体能有效抑制Panc-1细胞中HIF-1α的mRNA及蛋白的表达,当MOI=4时,对HIF-1αmRNA的抑制率为87.4%,蛋白抑制率达90.0%以上。结论：RNAi慢病毒载体可有效地抑制胰腺癌Panc-1细胞中HIF-1α的表达。     

RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖. 方法: 分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值(HA),观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力. 结果: 荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达65.0%. 蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为64.5%和69.6%. 半定量RT-PCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%;pEGFP/NP PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为71.4%和69.3%. 而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP PA的作用最为显著,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%,75.0%和96.9%. 结论: NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.     

黄河裸裂尻鱼MSTN基因RNA干扰研究

目的 利用反义寡合甘酸技术抑制肌肉生长抑制素（myostatin, MSTN）的表达,评估MSTN基因的沉默效果,并检测RNA干扰后对下游基因的影响。方法 通过构建黄河裸裂尻鱼（Schizopygopsis pylzovi）MSTN基因RNA干扰（RNAi）重组腺病毒载体1P3（DSP MSTN 273+250+1737）和1P2（DSP MSTN 195+1670）,并将其注射黄河裸裂尻鱼肌肉组织,进行活体RNA干扰;利用Real-time PCR和Western-blotting评估MSTN基因的沉默效果,并检测MSTN基因RNA干扰后肌肉肌酸激酶（muscle-type creatine kinase, M-CK）基因转录水平的调控作用。结果 Real-time PCR分析结果表明,与HK组（病毒通用阴性对照组）和N组（空白对照组）相比,重组腺病毒载体1P3对黄河裸裂尻鱼肌肉MSTN基因的转录具有明显的干扰作用（P<0.05）,抑制率达53.5%;而重组腺病毒载体1P2对MSTN基因的转录无明显干扰作用（P>0.05）。Western-blotting分析结果与Real-time PCR结果相一致。同时,经1P3干扰后随着MSTN基因转录水平的下降,其肌肉肌酸激酶M-CK基因表达水平显著上升。结论 通过RNAi技术能够有效的抑制MSTN基因的表达,并能够上调M-CK基因的表达量。因此,证明了在黄河裸裂尻鱼中MSTN能够抑制M-CK的转录。揭示高原土著鱼类MSTN 基因的对肌肉的生长发育起到调控作用。     

小鼠α2(Ⅰ)型原胶原基因启动子活性研究

明确纤维化形成中调控Ｉ型胶原基因高水平转录的启动子片段，逐段研究小鼠α２（Ⅰ）原胶原基因２ｋｂ的启动子序列。方法从小鼠α２（Ⅰ）原胶原基因转录起始点上游－２ｋｂ－＋５４ｂｐ的片段中，取长度不等的片段作为启动子，与含氯霉素乙酰基转移酶报告基因的质粒组织６个重组体，脂质体转录法转当上连重组体至胶原产生细胞和非胶霉素乙酰基转移酶报告基因的质粒组织６个重组体，脂质体转染法转染上述重组体至胶原产生细胞和非胶     

载体介导的RNA干扰技术对甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆正、反义人PIN1基因（hPIN1）及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体.方法 应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出990bp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1.结果 扩增的cDNA经测秩序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5.3 ＋0.99kb 两条带,与理论计算值完全一致.结论 成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体.     

反义核酸对人白血病HL—60细胞中c—myc基因表达的抑制

研究两个反义核酸（18mer，21mer）对人白血病HL—60细胞中c－myc基因表达的抑制作用。用HL－60活细胞计数，RNA含量的RT－PCR测定和c－myc基因蛋白的免疫组化染色检查。结果：两个反义寡核苷酸都能抑制HL－60细胞的增殖，增殖抑制率为11％～75％。反义核酸还抑制c－mycmRNA和Myc蛋白的表达，而对c－mcy基因正常表达的红白血病细胞K562的增殖和PHA刺激的人淋巴细胞的增殖没有影响。结论：反义寡核苷酸能抑制c－myc基因的过度表达。     

反义技术在心血管病方面的应用

反义（antisense）核酸是指与体内某些RNA或DNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。通过反斗核酸特异性抑制某些基因的表达，可能抑制由于癌基因的表达引起的血管平滑肌细胞增殖，抑制某些心血管病的发生与发展。近年来该领域的研究结果显示：应用反义核酸技术抑制血管平滑肌细胞的增殖将可能成为治疗心血管疾病的新途径之一。     

小干扰RNA对类风湿关节炎相关的人白细胞抗原-DRB1*0405蛋白表达的抑制作用

目的探讨人类白细胞抗原（HLA）DRB1＊0405小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对类风湿关节炎（RA）相关的HLA-DRB1＊0405蛋白表达的影响。方法构建HLA-DRB1＊0405蛋白表达质粒siCHECK^TM-2／HLA-DRB1＊0405,同时针对HLA-DRB1＊0405基因序列设计并构建6个小发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达质粒和1个针对无关序列的shRNA表达质粒。脂质体瞬时共转染两种质粒至人胚胎肾细胞293,以仅转染HLA-DRB1＊0405蛋白表达质粒作为阴性对照,采用实时荧光定量PCR检测293细胞中HLA-DRB1＊0405 mRNA的表达,通过测定荧光素酶强度分析293细胞中HLA-DRB1＊0405蛋白水平。结果所设计的6个HLA-DRB1＊0405 siRNA可不同程度的抑制HLA-DRB1＊0405在293细胞中的表达,对mRNA水平,其抑制率最高可达89．25％,而在蛋白水平,其抑制率达46．70％。结论质粒介导的HLA-DRB1＊0405 siRNA可明显抑制HLA-DRB1＊0405在人胚胎肾细胞株293中的表达,为利用RNA干扰（RNA interference,RNAi抑制RA中HLA-DRB1介导的异常免疫反应提供了试验依据。     

人工反义寡核苷酸对人Ⅰ型胶原基因体外转录体系的抑制作用

目的和方法 过量Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积是增生性瘢痕组织和瘢痕疙瘩形成的重要原因。采用 两个自行构建的ＳＰ６体外转录系统，通过掺入同位素（α３２ＰＧＴＰ）进行放射自显影，探讨不同反义寡核苷酸对Ⅰ型胶原基因体外转录的抑制作用。结果和结论位于ＳＰ６转录起始位点区域的寡核苷酸能够有效抑制体外转录反应；而位于ＳＰ６转录起始位点下游约２００bp的寡核苷酸和作为对照的随机寡核苷酸对转录的抑制作用不明显。     

短发夹RNA干扰胃癌低氧诱导因子-1α表达及其临床意义

目的 探讨RNA T扰对胃癌细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录和蛋白表达的作用以及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建人HIF-1α基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染胄癌细胞BGC-823;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平;MTT法检测转染后对胃癌细胞生长的抑制;TUNEL法观察细胞的凋亡情况;流式细胞术分析转染后胃癌细胞的细胞周期和凋亡率.结果 成功构建了pshRNA-HIF-1α1和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染BGC-823后,与空质粒组相比,pshRNA-HIF-1α1可有效抑制BGC-823细胞HIF-let基因转录和蛋白质表达,抑制率分别可达93.4%和55.7%;MTT法显示转染后细胞生长明显受到抑制;流式细胞术结果表明转染后,其凋亡率明显高于卒质粒绀(P＜0.05),BGC-823细胞增殖活性显著降低,G0～G1期细胞比例明显增加,S期与G2.～M期细胞比例减少;TUNEL法显爪转染后细胞核固缩,核染色质聚集或断裂;体内实验显示,pshRNA-HIF-1α1的抑瘤率为41.75%.结论 体内、外初步实验证实pshRNA-HIF-1α1能有效抑制胃癌细胞BGC-823 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡.     

TGFβ1反义RNA对腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的：研究转化生长因子β1（TGFβ1）反义RNA对体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMC）细胞外基质合成与分泌的影响。 方法：将反义TGFβ1基因真核表达载体转染HPMC，用ELISA法检测转染细胞上清液中纤维连接蛋白（FN）和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）的蛋白质水平；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测转染细胞内FN，PAI-1和胶原Ⅰ（ColⅠ）的mRNA表达，并与未转染HPMC对照组和转染空载体组比较其变化。 结果：TGFβ1反义RNA转染HPMC后，与对照组相比，转染24 h后，FN，ColⅠ，PAI-1 mRNA分别下调17％，26％，9.6％；转染48ｈ后 FN，PAI-1蛋白含量亦明显下降（P<0.05）。 结论：人反义TGFβ1基因真核表达载体可抑制HPMC合成细胞外基质，在腹膜纤维化的研究及防治中有潜在的应用价值。     

转染survivin对HLF细胞增殖及凋亡的影响

 【【目的】 探讨survivin基因表达对人肺纤维母细胞（humanlungfibroblast，HLF）增殖、凋亡的影响。【方法】 构建survivin基因真核表达质粒peDNA3．1／SVN；利用脂质体转染法将其转入不表达survivin mRNA的HLF细胞系。连续培养10周。筛选出稳定表达的阳性克隆（HLF／SVN）及转空质粒对照（HLF／K）。用RT-PCR、免疫组化、Western blot检测细胞中survivin、bel-2和caspase3mRNA表达：通过观察细胞生长曲线、细胞凋亡指数。探讨转染survivin基因对HLF细胞生长、凋亡的影响。【结果】转染peDNA3．1／SVN后。在4、6、8和10周HLF／SVN细胞查见survivinmRNA表达；免疫组化和Westernblot见HLF／SVN细胞survivin阳性表达；转染后caspase3mRNA受到抑制，表达减弱或消失。HLF／SVN细胞凋亡指数（0．3％、1．0％、1．5％）皆低于HLF（0．9％、4．3％、2．1％）及HLF／K（0．8％、1．4％、2．8％）。细胞生长曲线示HLF／SVN细胞生长快于HLF和HLF／K，差异有统计学意义（P〈0．05）。【结论】survivin基因能促进HLF细胞生长。可能通过抑制凋亡和促进细胞分裂而发挥作用。