酸性染料比色法测定钩吻及其制剂的总生物碱含量

采用酸性染色-溴麝香草酚蓝测定钩吻及其制剂——盐酸钩吻碱注射液中总生物碱含量。选择最佳比色条件,测得钩吻生药的总生物碱含量为0.621%、盐酸钩吻碱注射液的含量为5.02%;平均回收率为96.87%。     

高速逆流色谱分离纯化钩吻中钩吻素己和1-甲氧基钩吻碱

目的 建立高速逆流色谱技术分离纯化钩吻素己和1-甲氧基钩吻碱的方法 .方法 采用高速逆流色谱分离技术分离纯化钩吻生物碱单体,以氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCl(4∶4∶2)为溶剂体系;高效液相色谱技术分析所提产物的质量分数;核磁共振谱、质谱分析确证单体的化学结构.结果 从300 mg钩吻总碱中经过一次高速逆流色谱技术分离纯化获得19.4 mg钩吻素己和21.2 mg 1-甲氧基钩吻碱,质量分数分别为95.4%、98.6%;经过电喷雾质谱及核磁共振的结构鉴定分析,证实分离得到的两种生物碱分别是钩吻素已和1-甲氧基钩吻碱.结论 高速逆流色谱技术可高效分离纯化钩吻素已和1-甲氧基钩吻碱,为钩吻生物碱的研发提供了制备技术.     

钩吻发酵减毒的谱效关系

目的研究钩吻发酵解毒的机理。方法运用双向固体发酵原理与技术,将不同药用真菌接种到灭菌的钩吻药性基质上,在特定条件下进行发酵,得到药性菌质;用HPLC法对发酵前后菌质中的钩吻碱甲、钩吻素子、葫蔓藤碱甲、钩吻绿碱、葫蔓藤碱乙含量进行测定。结果相同发酵条件下,不同真菌对钩吻的发酵情况有所不同,灵芝、云芝、赤芝能够正常生长,其生物碱含量与钩吻生品比较呈下降趋势。结论双向固体发酵后菌丝体生长良好的菌质中,钩吻的液相色谱行为发生了质和量的变化。     

钩吻碱的镇痛作用和无依赖性

小鼠热板法、醋酸扭体法和大鼠光辐射热甩尾法测试,均证实钩吻碱有提高痛阈的作用,小鼠im,sc钩吻碱有增强戊巴比妥钠与水合氯醛的催眠作用。小鼠连续ip钩吻碱5d,未见镇痛作用产生明显的耐受性。小鼠ip钩吻碱连续7次后,不出现sc烯丙吗啡诱发的跳跃反应。小鼠ip钩吻碱无吗啡样S形竖尾反应。钩吻碱对瘾猴的戒断症状,无替代吗啡的作用。ip钩吻碱0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mg/kg对醇母致热大鼠无明显解热作用。     

钩吻炮制减毒存效的物质基础分析

目的:在前期研究基础上,检测钩吻炮制前后的6种主要生物碱成分的变化情况,以期揭示钩吻炮制后减毒存效的内在机制。方法:采用HPLC同时测定钩吻素甲、胡蔓藤碱丙、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙6个成分的含量,色谱条件为流动相甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0~10 min,22%A;10~20 min,22%~30%A;20~30 min,30%~40%A),流速1 m L·min^-1,检测波长254 nm,柱温30℃,进样量10μL。采用聚类分析和主成分分析法对钩吻炮制前后化学成分变化情况进行分析。结果:炮制前上述6种成分在12批生品中的平均质量分数分别为1.444,1.129,3.590,1.603,2.376,1.631 mg·g^-1;炮制后六者的平均质量分数则依次为2.258,0.343,1.176,0.115,0.459,0.281 mg·g^-1;毒性最强成分钩吻素己质量分数下降最为显著,下降率达92.83%,而毒性较小的钩吻素甲炮制后质量分数升高了56.37%,其他4个成分质量分数均有不同程度的降低。聚类分析结果表明钩吻炮制前后可明显分为2个类别,主成分分析表明钩吻炮制后第1主成分由钩吻素子变为钩吻素甲。结论:钩吻炮制后毒性成分钩吻素己被显著降解,胡蔓藤碱丙、钩吻素子、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙成分含量下降以及钩吻素甲的含量升高可能是钩吻炮制后减毒存效的内在机制之一。     

钩吻生物碱化在不同湿热灭菌条件下的成分动态变化

目的:探讨钩吻生物碱类化学成分随湿热灭菌条件的变化规律。方法:采用高压蒸汽灭菌、低温间歇灭菌等不同条件,将钩吻藤茎粉末进行湿热灭菌,用HPLC法对灭菌前后的化学成分中的钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、胡蔓藤碱乙的含量进行监测。结果:60℃,70℃灭菌3次,钩吻生物碱成分含量未见明显变化,钩吻碱甲在各灭菌条件下较稳定。钩吻素己80℃灭菌4次分别降低29.3%,28.2%,26.4%,32.8%,其余生物碱影响不大;90℃灭菌4次,钩吻素子分别降低8.5%,15.4%,15.4%,17.4%;钩吻素己分别降低32.8%,48.3%,55.2%,56.9%;胡蔓藤碱乙降低了1.3%,12.7%,12.7%,11.9%;121℃,21min高压灭菌对钩吻多种生物碱成分的破坏均较大,其中钩吻素己含量降低多达89%。结论:钩吻生物碱受湿热温度影响较大,其中钩吻素己最显著,80℃间歇灭菌4次是保证对钩吻灭菌较彻底且破坏性最低的灭菌方法。     

钩吻总碱对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

目的研究钩吻总碱对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管生成的影响。方法制备CAM模型,取50个鸡胚随机分为5组:空白对照组、阳性对照组及实验组(钩吻总碱高、中、低剂量组),于CAM上植入混合纤维素酯微孔滤膜药物载体,实验组加入不同浓度的钩吻总碱,空白对照组不加药品,阳性对照组加入PBS溶液,观察各组CAM新生血管生长的情况。结果钩吻总碱高、中剂量组及阳性对照组均有抑制CAM新生血管生成作用,而钩吻总碱低剂量组无抑制作用,与空白对照组作用相当。结论钩吻总碱具有抑制CAM新生血管生成的作用,并呈量效关系。     

钩吻总碱对人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的:探讨钩吻总生物碱提取物(钩吻总碱)促进人结肠癌HT-29细胞凋亡的机制。方法:钩吻总碱体外干预HT-29细胞24 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法评估其对细胞增殖的影响,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法及流式细胞术(Annexin V-FITC/PI)观察HT-29细胞的凋亡情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察HT-29细胞B型淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax),Bcl-2 mRNA表达情况,利用紫外分光光度法检测含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(Caspase-3)表达量的变化。结果:钩吻总碱可抑制HT-29细胞增殖,200 mg·L~(-1)钩吻总碱干预24 h后,对HT-29细胞增殖的平均抑制率达54.17%。DAPI染色及流式细胞术(Annexin V-FITC/PI)观察到钩吻总碱可促进HT-29细胞凋亡。RT-PCR观察到钩吻总碱能降低HT-29细胞Bcl-2 mRNA表达(P0.05),对Bax mRNA表达无明显影响,提高了Bax/Bcl-2 mRNA表达(P0.05)。利用紫外分光光度法检测到随着钩吻总碱浓度的升高,HT-29细胞的Caspase-3表达呈上升趋势(P0.05)。结论:钩吻总碱能有效地抑制HT-29细胞的增殖,促进HT-29细胞的凋亡,其机制可能与通过Bax/Bcl-2途径诱导细胞凋亡相关。     

1-甲氧基钩吻碱抗慢性疼痛作用

目的 1-甲氧基钩吻碱对福尔马林足底注射所致炎性痛及小鼠坐骨神经慢性压榨性损伤(CCI)所致神经病理性疼痛的作用.方法 建立小鼠福尔马林炎性疼痛模型,以注射福尔马林后l h内小鼠舔足时间为指标.观察1-甲氧基钩吻碱对炎性痛第二相痛反应的影响;建立小鼠CCI模型,于术后第3天至术后第9天sc 1-甲氧基钩吻碱,每天2次,连续7 d,以双足热痛缩足潜伏期比值为指标,观察1一甲氧基钩吻碱对小鼠足底热痛缩足潜伏期的影响.结果 1-甲氧基钩吻碱具有显著对抗小鼠福尔马林致炎性疼痛第二相痛反应作用,作用争剂量依赖性,ED50为4.59 mg/kg.1-甲氧基钩吻碱具有显著的抗CCI小鼠热辐射痛敏的作用,镇痛效应呈剂量依赖性;高剂量组小鼠给药后2 d显效,镇痛疗效持续至停药后36 h;术后第9天,1-甲氧基钩吻碱镇痛效应ED50为3.84 mg/kg.结论 1-甲氧基钩吻碱具有抗炎性疼痛作用与抗神经病理性疼痛作用.     

高速逆流色谱分离制备钩吻素子

目的 建立应用高速逆流色谱技术分离纯化中国钩吻中钩吻素子的方法。方法 从中国钩吻中提取得到的钩吻总碱以氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCl(4 ∶ 4 ∶ 2 ,V/V/V)为溶剂体系,通过高速逆流色谱进行分离,得到的目标单体采用高效液相色谱分析纯度,核磁共振谱氢谱、质谱分析确证化学结构。结果 进样300 mg钩吻总碱,分离得到生物碱单体为75 mg,经结构鉴定确证为钩吻素子,高效液相色谱分析得到质量分数为99.2 %。结论 高速逆流色谱技术可高效分离纯化钩吻素子。     

常绿钩吻碱对人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨常绿钩吻碱促进人结肠癌HT-29细胞凋亡的机制。方法:常绿钩吻碱体外培养HT-29细胞24 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法评估其对细胞增殖的影响,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法观察HT-29细胞的凋亡情况,蛋白印迹法(western-blot)观察HT-29细胞的B型淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白和B型淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)的表达情况。结果:常绿钩吻碱可抑制HT-29细胞增殖,8μg/mL常绿钩吻碱干预24 h后,对HT-29细胞增殖的平均抑制率达58.81%。DAPI染色法观察到常绿钩吻碱可促进HT-29细胞凋亡。western-blot法观察到常绿钩吻碱能降低HT-29细胞Bcl-2蛋白表达(P<0.05),对Bax蛋白表达无明显影响(P>0.05)。结论:常绿钩吻碱能有效地抑制HT-29细胞的增殖,促进HT-29细胞的凋亡,其机制可能与通过Bcl-2/Bax途径诱导细胞凋亡相关。     

正交试验优化钩吻生物碱回流提取工艺

目的采用正交试验优化钩吻生物碱回流提取工艺。方法以生物总碱提取率、钩吻素子和钩吻素甲含有量为评价指标,乙醇体积分数、料液比、氢氧化钠溶液质量分数、提取时间为影响因素,正交试验优化提取工艺。结果最佳条件为乙醇体积分数75%,料液比1∶11,氢氧化钠溶液质量分数3.5%,提取时间1.5 h,生物总碱提取率1.015%,钩吻素子和钩吻素甲含有量分别为33.512 mg/g和21.431 mg/g。结论该方法简单、省时、高效,可用于回流提取钩吻生物碱。     

钩吻总碱的镇痛,镇静及安全性研究

本文探讨了钩吻总碱注射液的镇痛镇静作用及安全性。实验结果表明：钧吻总碱能显著抑制醋酸所致的扭体反应，减轻热刺激所致的疼痛，提高小鼠痛阈作用．并能增强戊巴比妥钠的睡眠作用及抑制小鼠活动，其量效呈正比关系，且无累积性毒性表现，尾静脉注射的LD50为3．07mg/kg，肌肉注射的LD50为3．60mg／kg。     

钩吻二氯甲烷部位化学成分HPLC指纹图谱研究

目的建立钩吻二氯甲烷部位的化学成分指纹图谱。方法采用RP-HPLC方法,依利特色谱柱(250 mm×4.6mm,5μm);流动相A为乙腈,流动相B为水(含0.3%磷酸-0.5%三乙胺);梯度洗脱;流速1 ml·min-1;柱温40℃;进样体积20μl;检测波长254 nm。并对钩吻二氯甲烷部位进行指纹图谱定性分析。结果 10份不同产地钩吻二氯甲烷部位的指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》分析相似度较高,共检出9个相对位置稳定的共有峰,通过与标准品的保留时间及紫外光谱比较,可鉴定为钩吻碱甲和钩吻碱丙,保留时间分别为17.18 min和32.52 min。结论钩吻药材二氯甲烷部位指纹图谱的建立为药材质量控制提供了科学依据。     

钩吻总碱对肝癌细胞HepG2的体外抑制作用

以结晶紫染色法测定钩吻总碱对肝癌细胞HepG2细胞的抑制作用,光镜观察HepG2的细胞形态变化,流式细胞仪测定分析HepG2的细胞周期变化。钩吻总碱浓度为10μg/ml时,显著抑制HepG2细胞增殖（P＜0．05）,其作用具有剂量和时间依赖性。经钩吻总碱作用后,HepG2细胞呈现核染色体断裂、核固缩等形态变化,在细胞DNA直方图上出现明显的亚二倍体峰。结果表明钩吻总碱对肝癌细胞HepG2生长有明显的抑制作用,这种作用可能与其诱导肿瘤细胞产生凋亡相关。     

钩吻总碱的抗炎作用研究

钩吻总碱对角叉菜胶性和蛋清性大鼠足爪肿胀及棉球肉芽肿增生均有明显抑制作用,对幼年大鼠的胸腺及肾上腺重量无明显影响,对大鼠血浆皮质醇含量也无明显影响。钩吻总碱能使大鼠炎性组织释放的PGE的量明显降低。     

钩吻的化学成分研究

目的研究马钱科胡蔓藤属植物钩吻Gelsemium elegans的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、HPLC等色谱方法进行分离纯化,通过理化性质及核磁共振谱学数据对分得的化合物进行结构鉴定。结果从钩吻的95%乙醇提取物中分离得到15个化合物,分别鉴定为钩吻素子(1)、钩吻素甲(2)、钩吻绿碱(3)、钩吻素己(4)、花椒毒素(5)、香柑内酯(6)、异茴芹内酯(7)、欧前胡素(8)、蛇床子素(9)、对羟基苯甲酸(10)、香草酸(11)、β-谷甾醇(12)、β-胡萝卜苷(13)、钩吻内酰胺(14)、16-表伏康树卡平碱(15)。结论化合物5～9为首次从该种植物中分离得到。     

钩吻生物碱成分的薄层色谱研究

目的对钩吻根、茎、叶、花、果实生物碱进行薄层色谱研究。方法以钩吻碱甲和钩吻素子为对照,对不同产地钩吻的根、茎、叶、花、果实生物碱进行薄层色谱研究,考察了5种提取方法、4种展开系统、5种薄层板、3种检视方式以及不同温度和湿度对钩吻生物碱薄层色谱的影响。结果以方法 5提取,过PXC柱(阳离子交换树脂),以三氯甲烷-甲醇(9∶1)为展开系统,稀碘化铋钾试液-10%三氯化铁乙醇溶液(10∶1)混合溶液为显色剂,钩吻生物碱薄层色谱信息保留较多,分离较好,薄层效果最佳。结论该方法可作为鉴别钩吻的较专属鉴别方法。     

胆汁混合蒸制前后钩吻成分差异及急性毒性研究

目的 探讨钩吻经胆汁混合蒸制前后成分及毒性的差异,旨在为钩吻减毒存效提供新的炮制方案。方法 采用胆汁混合蒸制法炮制钩吻,建立10个批次钩吻生品与胆汁蒸制品(胆钩吻)HPLC指纹图谱,采用层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)多元化统计分析方法钩吻生品与胆钩吻指纹图谱信息,筛选成分差异,通过小鼠急性毒性实验比较钩吻生品与胆钩吻急性毒性死亡率。结果 10批钩吻生品及胆钩吻HPLC指纹图谱中分别有15、17个共有色谱峰,其中12个峰为两者所共有,共有峰相似度分别为0.744～0.979、0.998～1.000;HCA分析结果表明10个批次钩吻生品与胆钩吻聚为2类;PCA结果显示建立的HPLC指纹图谱基本能客观反映10个批次钩吻生品与胆钩吻的样本信息;OPLS-DA结果显示钩吻素子、钩吻素己、胡蔓藤碱乙及2号未知物是差异成分,其中前3种成分在钩吻生品中含量较高,2号未知物在胆钩吻中含量较高;小鼠急性毒性实验结果表明钩吻生品致死量为0.2 g/kg,胆钩吻剂量为4 g/kg时小鼠死亡率为0%。结论 钩吻经胆汁炮制后成分及毒性差异显著,具有减毒作...     

地西泮对钩吻总碱急性中毒小鼠的解毒作用

目的研究地西泮对钩吻总碱急性中毒小鼠的解毒作用。方法 ICR小鼠腹腔注射不同剂量的地西泮30 min后,分别灌胃给予1.321、1.64、2.05、2.56、3.2、4 mg/kg的钩吻总碱,给药后14 d内,观察小鼠的毒性反应及死亡情况。结果钩吻总碱急性中毒小鼠的半数致死量(LD50)为2.13 mg/kg,其95%可信区间(95%CI)是1.96~2.31 mg/kg;0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/kg地西泮预处理钩吻总碱急性中毒小鼠的LD50(95%CI)分别是2.25(2.04~2.47)、3.14(2.72~3.63)、2.60(2.32~2.91)、2.82(2.45~3.24)、2.56(2.24~2.93)、1.90(1.66~2.18)mg/kg,提示0.625~10 mg/kg地西泮预处理均可降低钩吻总碱急性中毒小鼠的死亡率。与3.2 mg/kg钩吻总碱中毒小鼠相比,经2.5~20 mg/kg的地西泮预处理,这些中毒小鼠的阵挛发作时间均显著延迟(P0.05或P0.01);1.25~20 mg/kg的地西泮亦显著延长它们的生存时间(P0.01)。仅腹腔注射5、20 mg/kg地西泮的小鼠则未见死亡。幸存动物观察14 d未见异常现象发生,大体解剖也未见重要脏器的异常变化。结论一定剂量的地西泮预处理能有效抑制钩吻总碱急性中毒小鼠的毒性发作和死亡。