人外周血树突状细胞的诱导培养及冻存

目的：探讨人外周血树突状细胞（DC）的诱导培养及冻存方法和意义。方法：通过树突状细胞的分离和培养、抗原标本前处理、抗原的装载、实验分组、细胞冻存等，摸索出树突状细胞诱导扩增以及促进成熟的优化实验方案。结果：外周血单个核细胞可作为DC的来源，GM—CSF和IL-4可诱导其前体细胞向DC分化，添加促成熟细胞因子可以让细胞维持细胞生物活性。结论：人外周血DC细胞的诱导培养及冻存具有重要意义。冷冻DC细胞保持了它的特性，但会因冻融过程生物特性有所减低，为此在应用冻存DC细胞时应考虑增加输入细胞量。     

口腔癌患者外周血树突状细胞的体外诱导培养及鉴定

 目前临床对口腔癌的治疗是以手术为主的综合治疗，控制癌变的发展，提高生存率，是口腔癌治疗的趋势。树突状细胞（Dendriticcell，DC）作为功能最强的专职抗原提呈细胞（Antigen-presen-tingcell，APC），在机体免疫应答中的作用受到高度关注。本实验采集口腔癌患者外周血，通过体外培养，诱导扩增获取大量具有典型特征的DC，分析其形态及表型特点，以期为口腔癌的生物治疗建立通路。     

人脐血来源树突状细胞的体外培养及鉴定

目的建立脐血来源树突状细胞（dendritic cells，DC）的体外培养方法，为进一步研究DC的功能、特性及临床应用提供了技术方法。方法取正常人脐血，分离获得单个核细胞，利用贴壁法去除悬浮细胞后，加入1000U／mL rhGM-CSF、500U／mL rhlL-4，至d7再加入500U／mLTNF-α进行培养，收集培养至d10的DC，分别从形态学、免疫表型和功能上加以鉴定。结果体外培养的d10，大量细胞出现典型的树突状形态；经流式细胞仪检测，高表达HLA-DR、CD80、CD83、CD1a、CD11c；混合淋巴细胞反应显示其在体外能有效刺激同种淋巴细胞增殖。结论在合适的细胞因子组合下，能够在体外利用脐血成功诱导出成熟DC。     

脐血来源树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫特异性

[目的]研究脐血来源树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗卵巢癌细胞的免疫效应.[方法]①从脐血中分离单个核细胞(MNCs)后,获得单核细胞(Mo).粒单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化,培养7天后应用流式细胞仪进行细胞表型分析.②诱导单核细胞分化的第3天加入人卵巢癌细胞株3AO的冻融抗原,共培养4天后获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从脐血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3天,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL及上清对人卵巢癌细胞株3AO、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用.[结果]①脐血来源单核细胞(Mo)在GM-CSF和IL-4作用下,7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、HLA-DR、CD83.②DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生.不同浓度CTL及上清对卵巢癌细胞3AO有特异性杀伤、抑制作用(P＜0.05).[结论]脐血中单核细胞可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应.     

树突状细胞体外诱导抗肿瘤免疫

目的以树突状细胞（DC）在体外诱导抗肝癌免疫。方法自肝癌患者外周血中分离DC;以粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）及白介素-4（IL－4）联合刺激DC;以人肝癌细胞系HepG2细胞的肿瘤相关抗原（TAA）激活DC;DC诱导自体T淋巴细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞（CTL）;检测CTL及其上清液对HepG2细胞、BEL－7402细胞、LOVO细胞及HOS－8603细胞的细胞毒作用。结果经人肝癌细胞系HePG2细胞的TAA激活并经GM－CSF及IL－4联合刺激后,肝癌患者外周血DC能够诱导自体T淋巴细胞增殖分化为CTL,该CTL及其上清液对HePG2细胞均有高效杀伤作用（杀伤率分别为92％±10％和41％±8％）,对BEL－7402细胞亦有较强的杀伤力（杀伤率分别为56％±10％和31％±9％）,对SGC－7901细胞、LOVO细胞及HOS－8603细胞则无明显的细胞毒作用。结论肝癌患者外周血DC体外能够诱导高效而特异抗肝癌免疫。提示DC可能在肿瘤治疗及预防其复发和转移中发挥重要作用。     

人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定

目的：建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法：方法：从正常人外周血F1细胞分离单个核细胞，经三种细胞因子——重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rh GM—CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)和重组人肿瘤坏死因子(rh TNFα)联合诱导培养，10天后收获细胞，利用光学显微镜、透射电镜观察其外部形态和细胞超做结构，流式细胞仪检测其细胞表面抗原，自体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的增殖活性：结果：培养收获了高纯度的DC，这些细胞表面有大量的不规则突起，核也呈不规则状，核仁小，核膜异染色质聚集，含有丰富的细胞器，如核糖体、内质网、溶酶体等；细胞表面高水平表达HLA—DR、CD1α、CD80、CD83和CD86；自体混合淋巴细胞反应表明诱导所得的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单个核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟DC。     

健康人外周血树突状细胞的体外诱导及其功能分析

 目的　分析以健康人AB血清与rhCD40L体外诱导健康人外周血树突状细胞（DC）的功能。方法　对健康人外周血单个核细胞进行体外培养,在以健康人AB血清为基础的培养体系中加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、 重组人白细胞介素（rhIL）-4、rhCD40L等细胞因子,诱导单个核细胞分化形成DC,采用倒置显微镜及瑞特-吉姆萨染色观察,流式细胞术行DC表型鉴定,四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法进行混合淋巴细胞反应（MLR）,检测其抗原刺激能力,酶联免疫吸附（ELISA） 法检测DC 培养上清IL-12的分泌。结果　培养7 d后的细胞具有典型的DC 形态,并上调表达DC 特征性表面分子CD83及共刺激分子CD40、CD80、CD86,第0、1 、3、5、7天,5个时间点间CD83、CD40、CD80、CD86、CD14表达差异有统计学意义（F值分别为50.253、243.769、248.181、191.267、226.339,均P＜0.05）。培养后的DC 可较强地刺激同种自体淋巴细胞增殖,GM-CSF加rhIL-4、rhCD40L组较GM-CSF加rhIL-4 组刺激反应能力强。培养的DC 自培养第5天始即有IL-12 分泌,未加CD40L组IL-12 p40分泌量为（42.92±1.54）pg／ml,加CD40L组为（136.18±5.27） pg／ml;培养第7天,IL-12 p40分泌明显增多,两组分别为（60.09±2.27） pg／ml及（322.30±30.60） pg／ml,差异有统计学意义（t＝-44.941、-22.611,均P＜0.05）。结论　健康人外周血单个核细胞可在以健康人AB血清与rhCD40L为主的培养体系中诱导成DC。     

人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法

目的:建立稳定、高效的人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC)体外培养的新方法。方法:离心获取人外周血白膜层细胞,裂解去除红细胞后获得全部白细胞,贴壁培养1 h获得单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 U/ml 重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500 U/ml,体外培养7 d获得DC,以流式细胞术分析表型,体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能。结果:从100 ml全血分离获得具有较好活力的贴壁单核细胞仅需2 h;部分肿瘤患者应用传统分离方法不能获得单个核细胞,用新方法仍能从患者外周血稳定地获得足够数量的单核细胞。新方法培养生成DC的数量为传统方法培养生成DC数量的1.8~2.6倍;其中40%~85%为CD1a ,表达高水平的HLA-DR、CD80、CD86,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖。结论:建立了更为稳定的、得率更高的DC体外扩增培养的新方法。     

树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫反应

目的 研究卵巢癌患者外周血树突状细胞(DC)在体外能否诱导出抗卵巢癌免疫反应。方法 自卵巢癌患者外周血中分离出DC;以人卵巢癌细胞系SKOV3细胞肿瘤抗原粗提物激活DC;以粒/巨噬细胞集落刺激因子及白介素—4联合刺激DC;DC诱导自体混合T淋巴细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL);检测CTL对SKOV3细胞、CAOV3细胞、HepG2细胞及HOS—8603细胞的细胞毒作用。结果 卵巢癌患者DC体外能够诱导自体混合T淋巴细胞增殖、分化为CTL,CTL对SKOV3细胞及CAOV3细胞均有较强杀伤力(89％±12％及62％±9％),而对HepG2细胞和HOS—8603细胞仅有微弱杀伤力(12％±4％和10％±5％)。结论 卵巢癌患者外周血DC在体外能够诱导高效而特异抗卵巢癌免疫。     

两种来源的树突状细胞体外培养及免疫学特征比较

目的对脐血(UCB)和外周血(PB)体外诱导培养成树突状细胞(DC),并进行免疫学特征的比较,探索更好的DC来源。方法UCB和正常成人PB各10例为UCB组和PB组,分离出单个核细胞后,分别加入粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF),白介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF-α)培养基中,培养12d,每天用光镜观察细胞形态,于第3、6d和10d,用流式细胞仪进行CD11c、CD80、CD86及HLA-DR表型分析,于第10d透射电镜和扫描电镜观察细胞形态,并在第12d与淋巴细胞混合培养,对比两种源性DC激发淋巴细胞增殖能力。结果两者均诱导出具有典型形态的DC,UCB组诱导的DC细胞数量明显多于外周血诱导的细胞数(P<0.01)。激发淋巴细胞增殖能力,两者无区别(P>0.05)。结论UCB和PB中的MNs均可在体外诱导为成熟DC,UCB诱导的DC细胞数高于PB,两者激发淋巴细胞增殖能力相同,故UCB有可能成为免疫治疗DC的丰富来源。     

人脐血树突状细胞抗神经胶质瘤的体外免疫效应研究

目的　研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞 (DC)对神经胶质瘤细胞的免疫杀伤效应。方法　应用免疫磁珠分选脐血 CD34细胞 ,经 SCF FL3 GM- CSF IL- 4 TNF- α的联合诱导培养 DC,采用相差显微镜观察树突状细胞的形态 ;流式细胞仪作 DC的表面标志检测 ;MTT比色法测定同种异型的混合淋巴细胞反应能力和诱导CTL 毒性的检测。结果　 (1)脐血 CD34细胞在体外经细胞因子联合刺激后呈典型的 DC形态 ;(2 )流式检测 CD4 0、CD80和 CD86等成熟 DC特异性表面标志呈高表达 ,分别与诱导前比较 ,差异均有显著性 ;(3) MTT法测得脐血来源的 DC较外周血 DC刺激同种异体 T淋巴细胞增殖能力弱 ;经肿瘤抗原负载的 DC体外诱导出较强 CTL 毒性。结论　脐血 CD34细胞经体外扩增诱导的 DC具有典型的 CTL 毒性 ,为临床应用脐血来源 DC抗神经胶质瘤的生物治疗提供了理论依据     

术中失血来源的树突状细胞用于肝癌治疗的体外实验研究

目的 探讨从肝癌患者术中失血来源的单个核细胞中培养树突状细胞(DC)的可行性,为个体化的DC介导免疫治疗提供新的细胞来源.方法 采集9例原发性肝细胞癌患者术中失血及8例脐血,分离其单个核细胞,其中贴壁的单个核细胞经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(RHGM-CSF),重组人白细胞介素4(rhIL-4)诱导和负载癌细胞抗原,制成不同的DC瘤苗,悬浮的单个核细胞经细胞因子处理成为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK).采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定DC激活同源CIK的相对增殖率和CIK对肝癌细胞的杀伤效果.结果 肝癌患者术中失血来源的单个核细胞在体外能够诱导分化为具有典型形态和表型的DC.术中失血来源的DC表面标志物表达水平低于脐血来源的DC,但二者均能有效地激活CIK,并增强其对肝癌细胞的杀伤活性.负载患者自身癌细胞抗原的术中失血IX:和脐血DC,其激活的CIK增殖率分别为(388.9±137.3)%和(315.1±44.5)%,对肿瘤细胞的杀伤率分别为(87.1±8.0)%和(90.0±5.1)%;而负载SMMC-7721抗原的术中失血DC和脐血DC,其激活的CIK增殖率分别为(239.9±48.7)%和(226.3±32.3)%,对肿瘤细胞的杀伤率分别为(76.4±7.9)%和(81.1 ±4.3)%.在激活CIK和增强对肝癌细胞杀伤能力方面,相同抗原负载的两种Dc差异无统计学意义,但负载自身抗原优于负载SMMC-7721抗原.结论 肝癌患者术中失血来源的DC可有效激活CIK,并增强其对肝癌细胞的杀伤效应,为临床研究和应用DC瘤苗提供了一个新的来源.     

Ovarian carcinoma cells effectively inhibit differentiation and maturation of dendritic cells derived from hematopoietic progenitor cells in vitro

Loco-regional dissemination of ovarian carcinoma is associated with immunosuppression of the peritoneal cavity. One marked characteristic of the peritoneal immunity in this disease is the defective function of dendritic cells (DCs). In this study, the affect of ovarian carcinoma cells on DCs derived from hematopoetic progenitor cells was observed. The study demonstrated that the expansion, phenotype, and function of DCs generated from CD34⁺ precursors were significantly altered by the supernatant secreted by ovarian carcinoma cells, and this effect could be partly explained by tumoral overproduction of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). The results indicated that a role of ovarian carcinoma cells in the differentiation and function of DCs could be associated with the immunosuppression and development of ovarian carcinoma.     

α-干扰素与慢性髓性白血病来源的树突状细胞

 各种临床观察肯定了α-干扰素（IFN-α）治疗慢性髓性白血病的疗效,其可明显延长白血病的慢性期及患者生存时间。树突状细胞（DC）作为功能最强的专职抗原递呈细胞,能有效递呈白血病抗原,逆转机体对白血病抗原的耐受,启动特异抗白血病的T细胞应答。IFN-α用于诱导慢性髓性白血病来源的DC,已经取得一定成绩,用IFN-α诱导慢性髓性白血病细胞分化成为具有较强功能的"临床型"DC被寄予厚望。     

树突状细胞在体外诱导FBL-3细胞分化为单核细胞的研究

目的 探讨树突状细胞(DC)对白血病细胞的诱导分化作用机制.方法 应用不同浓度的DC培养上清作用于小鼠红白血病细胞(FBL-3细胞),作用72 h后用瑞氏染色观察分化后细胞的大体形态,透射电镜观察分化后细胞的超微结构,流式细胞术观察分化后细胞表面分子CD14的表达情况.结果 瑞氏染色、透射电镜、流式细胞术结果均显示,DC培养上清能诱导白血病细胞分化为单核细胞,其作用强度与DC培养上清中IL-12浓度呈正相关.结论 DC培养上清可诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞,分化后的细胞在大体形态、超微结构、细胞表型分子标志方面符合单核细胞的特点.且DC培养上清诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞的能力与培养上清中IL-12的浓度呈正相关.     

外周血单核细胞与树突状细胞的命名

单核细胞与树突状细胞系细胞在血液中循环并最终迁移到组织中,它们在组织中进一步成熟并发挥免疫防御等多种功能。近年来,采用流式细胞术对这些细胞的表面标志分子特征进行了详细的分析,发现了相应的细胞亚群。国际免疫学会命名委员会（由英国莱斯特大学免疫学研究所Loems Ziegler-Heitbrock教授为首的18位科学家组成）对这些细胞进行了统一命名,将人和小鼠血液单核细胞分为三种类型：经典型（classical monocytes）、中间型（intermediate monocytes）和非经典型单核细胞（non-classical monocytes）;将人和小鼠血液树突状细胞也分为三种类型：浆细胞样(plasmacytoid dendritic cells)和两类髓样树突状细胞（myeloid dendritic cells)。目前该分类及其命名已被国际免疫学会批准,该命名将更好地促进科学家之间甚至是学科之间更广泛的交流。     

树突状细胞在体外诱导FBL-3细胞分化为单核细胞的研究

目的 探讨树突状细胞(DC)对白血病细胞的诱导分化作用机制.方法 应用不同浓度的DC培养上清作用于小鼠红白血病细胞(FBL-3细胞),作用72 h后用瑞氏染色观察分化后细胞的大体形态,透射电镜观察分化后细胞的超微结构,流式细胞术观察分化后细胞表面分子CD14的表达情况.结果 瑞氏染色、透射电镜、流式细胞术结果均显示,DC培养上清能诱导白血病细胞分化为单核细胞,其作用强度与DC培养上清中IL-12浓度呈正相关.结论 DC培养上清可诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞,分化后的细胞在大体形态、超微结构、细胞表型分子标志方面符合单核细胞的特点.且DC培养上清诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞的能力与培养上清中IL-12的浓度呈正相关.     

卵巢癌患者外周血来源树突细胞的生物学特性

背景与目的：树突细胞（dendritic cells,DCs）是体内功能最强的抗原递呈细胞．在抗肿瘤免疫治疗中起着重要的作用。既往对DCs生物学特性的研究数据大多来自健康个体,而来自肿瘤患者的DCs的特性尚不清楚。本研究旨在探讨卵巢癌患者外周血单核细胞来源的树突细胞（monocyte—derived dendritic cells,MoDCs）的生物学特性。方法：收集8名上皮性卵巢癌患者及13名健康女性志愿者的外周静脉血标本,从中分离出单核细胞,将其置于含人白细胞介素4（interleukin4,IL4）及粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophag ecolony stimulating factor,GM-CSF）的RPMI-1640完全培养基中培养,用肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）刺激其成熟。对诱导7d后的MoDCs进行细胞形态、表型及刺激异体淋巴细胞增殖能力分析。结果：卵巢癌患者及健康妇女外周血单核细胞培养7d后,均诱导出形态学上典型的成熟MoDCs。两组MoDCs均表达丰富的HLA-ABC（MHC-Ⅰ）、HLA-DR（MHC-Ⅱ）和大量共刺激分子CD86和CD80。卵巢癌组HLA-ABC、HLA-DR、CD86及CD80的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）与健康妇女组差异无统计学意义（P〉0．05）。混合淋巴细胞反应（mixed leukocytes reaction,MLR）结果显示,卵巢癌各组（按MoDCs与淋巴细胞的比例分组）的吸光度值均明显低于健康妇女相应各比例组（P〈0．05）。结论：卵巢癌患者的MoDCs刺激异体淋巴细胞增殖能力较健康妇女降低,提示其存在一定程度的免疫学功能异常。     

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。