大鼠鼠胚海马神经细胞原代培养及神经元鉴定

目的建立大鼠鼠胚海马神经元原代培养的方法。方法取孕龄17-18天的Wistar大鼠腹中胎鼠,血清培养法进行海马神经元的原代培养,然后用倒置显微镜进行形态学观察和神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方法进行神经元的鉴定。结果培养8天后的海马神经元经形态学和组织化学方法观察证实神经细胞发育成熟。结论大鼠鼠胚海马神经元原代培养是一种新型的培养方法,具有明显的优势。     

SD乳鼠海马神经细胞原代培养方法的探讨

目的 寻求一种简单、廉价的原代SD乳鼠海马神经细胞培养方法.方法 采用胰蛋白酶消化法制备游离海马神经细胞悬液,进行培养.结果 通过多次探索、观察、成功的进行了原代海马神经细胞培养.结论 本方法适合一般实验室开展海马神经细胞培养.     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良

（1）目的：建立较理想的新生大鼠海马神经细胞体外原代培养方法。（2）方法：采用低浓度，长时间胰酶消化和机械分离相结合的方法进行单层原代培养。（3）结果：在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化，并能形成典型的神经细胞网络。（4）结论；该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．     

脑溢安颗粒剂对缺糖损伤后海马神经细胞凋亡的影响

根据ｓａｄｒｏｚａｄｅｎ报道的方法复制胎鼠海马神经细胞原代培养缺糖损伤模型。采用细胞形态学、ＤＮＡ裂解率、流式细胞仪方法,观察缺糖损伤后,原代培养的胎鼠海马ＣＡ１神经细胞的形态结构,ＤＮＡ完整性、神经细胞发生凋亡的数量;结果,缺糖损伤后,培养神经细胞ＤＮＡ裂解率随时间延长而增加,１２ｈ达到８３％,脑溢安颗粒剂（ＮＹＡ）对缺糖损伤后神经细胞ＤＮＡ裂解率的抑制作用大于模型组,差异具有统计学意义（Ｐ＜０     

脊髓神经细胞的培养及鉴定

目的:探索体外培养原代脊髓神经细胞的方法,为研究脊髓损伤及修复的分子机制、药物作用机制提供前提条件。方法:将妊娠15 d的孕鼠处死后取出胎鼠脊髓,分离出神经细胞作为原代细胞进行培养,观察神经元细胞形态学特征,并采用DAPI和NSE双重染色对所培养细胞进行鉴定。结果:胎鼠脊髓神经细胞在体外培养生长好,纯度高,经免疫荧光鉴定,所培养细胞荧光染色符合神经细胞特点。结论:采用该实验方法进行脊髓神经细胞培养方法简便,纯度高,能满足各种神经科学研究的需要。     

大鼠海马神经细胞原代培养及塑料孔板原位鉴定

目的 原代培养大鼠海马神经细胞,探讨简单、有效的塑料孔板原位鉴定方法.方法 采用Hiroaki等的方法并做了改良,在塑料孔板里进行胎鼠海马神经细胞原代培养,7 d后分别用传统和改良的甲苯胺蓝(TB)染色法、改良的神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)染色法对海马神经细胞进行鉴定.结果 无血清细胞培养法神经细胞结构特征明显,能形成明显的神经网络结构.传统的TB染色法染色单一,均为淡蓝色;改良的TB染色法红蓝匹配,对比度好;改良的免疫组化NSE染色法胞质阳性.结论 无血清培养法是海马神经细胞培养的理想方法,塑料孔板细胞培养原位染色简单易行,对细胞及分子水平研究有重要意义.     

大鼠胚胎小脑提取液对培养脊髓神经细胞的作用

为探讨不同胎龄大鼠小脑提取液(CE)对体外培养脊髓神经细胞的影响,制备不同蛋白浓度的14d、16d、18d和20d胎鼠(E14,E16,E18,E20)CE,加入原代培养的E18胎鼠脊髓神经细胞中,24h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果显示,实验各胎龄CE均能促进培养脊髓神经元的存活,并有蛋白浓度依赖关系,与对照组及其它各实验组相比有极显著性差异(P<0.01),E14和E18CE分别在蛋白浓度为0.20mg/ml和0.40mg/ml时有最大神经营养活性。结果提示CE对培养脊髓神经细胞具有明显的营养作用,为利用胚胎小脑移植修复脊髓损伤提供了实验依据。     

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的 建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法.方法 取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7～8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周.经鉴定,海马神经元纯度达96%以上.结论 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础.     

大鼠脊髓神经元原代细胞的分散培养

目的　建立一种简单、易行、满足基本科研需要的脊髓神经元原代细胞分散培养法。方法　取Wistar大鼠胎鼠或新生鼠的脊髓 ,以胰蛋白酶消化和机械吹打相结合 ,将组织分散成细胞悬液 ,培养于含10 %胎牛血清和阿糖胞苷 (抑制胶质细胞的增殖 )DMEM培养基中 ,观察脊髓神经元细胞生长状况。结果　3～ 6h细胞开始贴壁 ,胞体周围渐有突起 ;2～ 3d胞体明显增大 ,突起生长旺盛 ,连接呈网络 ;10d时细胞形态最为丰满 ;3周后细胞开始退化 ,胞内出现空泡。结论　培养的脊髓神经元形态发育符合正常规律变化 ,适用于形态学、生化、遗传、药理等学科研究     

骨髓间充质干细胞培养及向神经细胞诱导分化的实验研究

目的：体外培养骨髓间充质干细胞(BM—MSC)，诱导BM—MSC向神经细胞分化。方法：采用DMEM培养液加胎牛血清(DMEM／FBS)或无血清培养基体外培养人BM—MSC，测定细胞倍增时间；免疫组织化学法分析BM—MSC的表面标记；纤维母细胞集落形成(CFU—F)试验检测BM—MSC增殖能力；应用二甲基亚砜／羟丁苯甲酯(DMS0／BHA)化学因子诱导BM—MSC向神经细胞分化。结果：BM—MSC为单层贴壁生长，呈现规则的集束辐射状排列。在对数生长期，细胞倍增时间约为46h。CFU—F试验表明，体外培养的MSC的集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)的15000倍以上。免疫组化分析表明，BM—MSC为CDl3和CDl05阳性，CD34阴性。DMS0／BHA化学因子能诱导BM—MSC分化为神经细胞，但是分化后即失去增殖能力，并于48h后逐渐死亡。结论：通过体外培养可以获得大量高度均一的BM—MSC。BM—MSC可向神经细胞诱导分化，但尚缺乏实际应用的可能性。     

机械分离并培养螺旋神经节神经元方法的建立

目的　建立机械分离并培养小鼠耳蜗螺旋神经节神经元 (SGN )细胞模型的方法。方法　对出生后1～ 6 d的小鼠耳蜗螺旋神经节组织进行机械分离和培养 ,用倒置相差显微镜对原代培养的 SGN细胞的形态学和轴突生长情况进行观察 ,并应用荧光显微镜对 SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。结果　新生小鼠 SGN在机械分离、体外培养条件下 ,可以获得良好的细胞形态和轴突再生能力 ,其存活细胞的数量为 (78.10± 4 .33) / cm2 (5～ 7d) ,生长周期为 7～ 14 d。结论　成功建立了机械分离并培养 SGN细胞模型的方法 ,SGN存活细胞的数量和周期可以满足体外多种实验的需要。     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

新生大鼠中脑黑质神经细胞的原代培养

对新生1天大鼠中脑黑质神经细胞进行原代培养，以建立稳定的神经细胞培养模型。通过光镜对培养各阶段的神经细胞系统地观察，描写了它们的生长发育过程和形态特征，同时用特异性诱发荧光技术和酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学方法，进一步确定培养的黑质神经细胞的化学性质。本方法与通常从胚胎鼠取材比较，具有难度小，取材范围大的优点。     

大鼠胚胎脊髓神经细胞的原代培养及其神经营养素受体表达的初步研究

目的：建立哺乳动物胚胎脊髓神经细胞体外培养的细胞模型，提高培养用脊髓神经细胞的产率以及活性，使实验的细胞模型有良好的一致性和可比性。方法：18d的大鼠胚胎的脊髓经取材、分离、消化后作原代细胞培养，从细胞形态学及细胞计数角度观察细胞生长与分化过程。应用免疫细胞化学技术，观察了神经营养素受体TrKA、TrKB、TrKC在脊髓神经细胞的表达。结果：大鼠胚胎的脊髓神经细胞在体外条件下，可良好存活并有正常的表型分化，TrKA、TrKB、TrKC在细胞膜上呈阳性反应。其细胞数量(集落数)与形态以及存活周期可满足体外实验的基本要求。结论：这种分离培养方法简便、成功率高、稳定性强、细胞产量高且质量好，有助于离体研究的开展。     

钙激活钾通道在钙离子致神经细胞损伤中的作用

采用膜片钳单通道记录方法,观察原代培养新生ＳＤ大鼠皮层神经元的钙激活钾通道（ＫＣａ）特征及胞内不同游离钙水平对通道开放动力学的调节。结果显示：培养ＳＤ大鼠皮层神经元的ＫＣａ以大电导活动占优势,胞内游离钙为１０－８ｍｏｌ／Ｌ时,通道几乎不开放,在１０－６ｍｏｌ／Ｌ时达最大激活。由此表明神经元上ＫＣａ通道开放概率明显依赖于胞浆中钙离子和膜电位,ＫＣａ对胞内钙离子浓度变化极为敏感。钾通道的开放剂可能有一定的神经细胞保护作用。     

胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养

目的 原代培养胚胎大鼠背根神经节神经元(DRGn),并观察其生长特性。方法 取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化法分离成单细胞,通过密度梯度离心法和差速贴壁法进行分离纯化,在无血清培养基中培养,用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体鉴定神经元。结果 纯化培养神经元生长状态良好,纯度可达93%左右。结论 该方法具有较好的可操作性和可重复性,用于DRGn的相关实验研究。     

三种皮质神经元原代培养方法的改良及对比

目的：改良并比较机械分离法、胰蛋白酶消化法和木瓜蛋白酶消化法在大鼠皮质神经元培养中的优缺点,为研究工作者根据各自条件选择合适的培养方法提供理论依据。方法：采用胎龄为16-18天的SD大鼠胚胎,分别用机械分离、胰酶消化以及木瓜蛋白酶消化三种方法对SD胎鼠皮层神经元进行培养,并对不同培养时间的神经元进行形态学观察和免疫荧光显微镜纯度鉴定。结果：三种方法均能成功培养出杂质少且纯度高的皮层神经元,其在不同生长阶段具有典型的形态学特征。经NSE免疫荧光染色,神经元纯度分别在96.28%,95.63% 及97.34％,三组间无统计学差异(P>0.05)。结论：本实验改良并比较了三种皮质神经元的培养方法,三种方法均成功培养出杂质量较少且纯度高的皮层神经元,均可作为神经元体外培养的良好实验模型,且三种培养方法都有其不同的特点。