肝癌细胞抗原负载树突状细胞激活CTL的抗肿瘤作用

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一 ,世界范围内每年约有 10 0～ 12 5万人死于肝癌 ,我国是肝癌高发国家。导致肝癌发生的主要危险因素有HBV ,HCV感染及各种肝硬化等。肝癌化疗、放疗疗效差 ,虽尚有另外多种治疗方法 ,包括手术切除、化疗栓塞、瘤体内注射药物和肝移植等 ,但预后均不理想。研究表明肝癌患者机体免疫功能存在严重障碍。本课题对肝癌患者外周血树突状细胞介导的抗肿瘤功能状态进行了研究 ,现报道如下。1　材料与方法1.1　临床资料6例肝癌患者分别为我院及省肿瘤医院住院病人。年龄范围 36～ 5 6岁 ,平均年龄 4 6 .2岁 ,均经B超、…     

腺病毒介导的AFP基因修饰树突状细胞的体外生物学特性

目的: 探讨腺病毒介导AFP基因修饰树突状细胞瘤苗体外生物学活性。方法:将携带小鼠AFP全长cDNA的重组腺病毒表达载体AdAFP转染BMDC，构建AFPDC肝癌瘤苗，采用电化学发光免疫测定法确证AFPDC转染的有效性，FACS检测表面分子和内吞功能，3HTdR掺入法检测T细胞增殖反应的能力，51Cr 释放法检测CTL活性。结果: AFP基因转染12 h后DC及其培养上清中可检到AFP的表达，表明腺病毒介导的AFP基因转染的有效性。AFPDC与BMDC比较B7分子明显上调，MHC分子也有轻度升高，内吞功能降低(P<0.05)。AFPDC激发同基因型小鼠T细胞增殖功能均明显高于DC对照组和LacZDC组(P<0.05)。AFPDC体外诱导CTL对Hepa16肿瘤细胞的杀伤作用具有特异性。结论: 肝癌相关基因AFP可作为抗肝癌基因治疗的切入点，该研究为肝癌树突状细胞体内免疫治疗提供了实验依据。     

肺癌恶性胸腔积液中树突状细胞的诱导及生物学特性

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，发病率有逐年增高的趋势，常并发恶性胸腔积液，使病情加重，需要反复抽液。而恶性胸腔积液中含有丰富的免疫活性细胞，如能用于患者的免疫治疗，则既避免了细胞的大量丢失，又较化疗等传统方法有其自身的优势。[第一段]     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞诱导的CTL体外作用研究

 目的　研究慢性髓性白血病来源的树突状细胞的免疫功能。方法　分离慢性期CML患者外周血单个核细胞 (PBMNC) ,用细胞因子GM CSF及IL 4在体外诱导培养DC ,检测细胞表型 ,并观察其诱导的CTL体外抗肿瘤效应。用酶联免疫 (ELISA)方法测定CML DC混合淋巴细胞反应 (MLR)上清液中IL 12及IFN γ的量 ,并与正常DC进行比较。结果　联合GM CSF及IL 4可诱导CML细胞分化为CML DC ,CML DC的CD1a、CD80、CD83表达率均低于正常DC ;CML DC混合淋巴细胞反应上清IL 12及IFN γ含量均低于正常DC ;CML DC能诱导出对自身CML细胞有特异性杀伤作用的CTL。结论　CML DC具有抗原提呈细胞的免疫功能 ,能诱导抗白血病CTL反应。     

树突状细胞、甲胎蛋白和肝癌靶向性调控治疗

树突状细胞(dendriticcells，DC)是由抗原递呈细胞家族组成。分布于除脑和睾丸以外身体各部的任何组织。DC能捕获细菌、病毒等抗原，并递呈给次级淋巴器官的T细胞，是天然免疫和适应性免疫连接的一个重要纽带。DC既能诱导初级免疫反应，又能诱导次级免疫反应，是启动、调控、并维持免疫应答的中心环节，是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞。DC通过受体的方式摄取外来抗原，     

以AFP为靶点的肝癌树突状细胞免疫治疗的实验研究

目的探讨AFP作为肝癌基因治疗和免疫治疗靶点的可行性以及AFP基因转染的树突状细胞（AFP-DC）疫苗对表达AFP肝细胞癌的免疫治疗作用.方法构建AFP-cDNA 真核表达载体,体外转染DC,制备AFP-DC瘤苗,诱导针对表达AFP的肝癌细胞株HepG2的特异性免疫反应,MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率.结果 AFP-DC瘤苗能够分泌AFP抗原,培养上清中AFP含量为0.8805 IU/ml,与空载体组和空白对照组相比,差异显著（P〈0.05）.免疫荧光检测可见AFP-DC胞浆及胞膜有AFP抗原分子表达;活化的CTL能够对表达AFP肝癌细胞起特异性杀伤作用,杀伤效率可达84.05%,与空载体组和空白对照组比较,差异显著（P〈0.05）.结论 AFP作为靶点治疗肝癌具有可行性,AFP可作为肝癌靶向治疗的新的突破点;AFP-DC疫苗可以作为表达AFP肝癌的一种免疫治疗手段,为DC瘤苗的临床应用奠定了基础.     

树突状细胞抗肿瘤免疫及其临床应用

总结近年国内外树突状细胞临床研究结果及其树突状细胞瘤苗在消化系统、泌尿系统、血液系统等恶性肿瘤的临床治疗应用。为恶性肿瘤的治疗提供了新思路、新方法。     

人骨髓来源的树突状细胞(DCs)诱导产生杀瘤细胞的作用

树突状细胞(DCs)是体内最强的抗原呈递细胞,国内外研究小组均有报道DCs负载抗原作为肿瘤疫苗或体外诱导CTL产生,用于免疫治疗肿瘤宿主获得良好抗瘤结果.这提示DCs可以提高抗肿瘤免疫,具有临床应用前景.我们以前报道肾癌可溶性抗原激活的杀瘤细胞(称T-AK)过继免疫治疗肾癌患者有良好临床疗效.本文报道在T-AK细胞体外培养系统中加入自体DCs,所诱导的杀瘤细胞称DC-TAK,其细胞增殖率和杀伤肿瘤细胞的作用均优于T-AK.我们从肾癌     

基因腺病毒感染树突状细胞诱导CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用

目的:研究EPHA2基因修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lympho-cyte,CTL)对U251胶质瘤细胞的杀伤效应,为胶质瘤的免疫治疗提供新的方法。方法:将重组EPHA2腺病毒rAd-EPHA2感染HLA-A2阳性的人外周血来源的DC,制备EPHA2基因修饰的DC疫苗,Western blotting和FACS方法检测感染后DC的EPHA表达。以DC疫苗体外刺激HLA-A2阳性的单个核细胞,酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)和标准51Cr释放实验分别检测DC疫苗所诱导的CTL活性和对HLA-A2阳性的U251细胞的杀伤作用(另设rAd-Lac Z感染的DC组和PBS组作为对照)。结果:成功制备了EPHA2基因修饰的DC疫苗,其可有效表达EPHA2蛋白。与感染rAd-LacZ的DC和PBS组相比,感染rAd-EPHA2的DC疫苗能有效激发CTL活性[(187±21)vs(12±4)、(18±5)个,P<0.01];所诱导的CTL对胶质瘤U251细胞有明显的杀伤效应[(45.7±6.8)%vs(7,1±4.5)%,P<0.01],对自身淋巴细胞没有杀伤效应。结论:EPHA2基因修饰的DC疫苗能有效激发CTL活性,并对胶质瘤U251细胞有明显的杀伤活性。     

热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞体外刺激细胞毒T细胞活性比较

目的：比较热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞（dendritic cell,DC）体外刺激细胞毒T细胞（cytotoxic Tlymphocyte,CTL）的活性。方法：分别制备热休克诱导凋亡胃癌细胞株和肿瘤细胞冻融裂解物,同时分离12例胃癌患者外周血单核细胞体外诱导DC进行负载,并以两种不同方式负载的DC进行淋巴细胞增殖反应及CTL杀伤实验,比较其刺激淋巴细胞增殖及激活的淋巴细胞杀伤靶细胞能力的差异。结果：负载热休克胃癌细胞的DC与负载反复冻融肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞CTL活性,但前者的CTL活性显著高于后者（P〈0.05）。结论：用热休克肿瘤细胞负载DC是一个更为有效的负载方式,为临床应用提供了一种可选择的负载方式。     

热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞体外刺激细胞毒T细胞活性比较

目的:比较热休克凋亡和冻融裂解人胃癌细胞株抗原负载树突状细胞(dendritic cell,DC)体外刺激细胞毒T细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)的活性。方法:分别制备热休克诱导凋亡胃癌细胞株和肿瘤细胞冻融裂解物,同时分离12例胃癌患者外周血单核细胞体外诱导DC进行负载,并以两种不同方式负载的DC进行淋巴细胞增殖反应及CTL杀伤实验,比较其刺激淋巴细胞增殖及激活的淋巴细胞杀伤靶细胞能力的差异。结果:负载热休克胃癌细胞的DC与负载反复冻融肿瘤细胞裂解物的DC都显示对靶细胞CTL活性,但前者的CTL活性显著高于后者(P<0.05)。结论:用热休克肿瘤细胞负载DC是一个更为有效的负载方式,为临床应用提供了一种可选择的负载方式。     

AFP在胃癌中的表达意义及其与VEGF的关系

目的：探讨AFPGC生物学特性及其与VEGF的关系。方法：将262例胃癌患者分成AFP阳性和阴性两组。采用免疫组化方法检测胃癌组织中AFP及VEGF的表达,比较两组患者的性别、年龄及胃癌生长部位、大小、大体类型、分化程度、肝脏转移、淋巴结转移、临床分期以及生存率。结果：AFP阳性组肝脏转移、多个淋巴结转移发生率及临床IV期胃癌比例均明显高于AFP阴性组（P〈0．01）;AFP阳性组的胃癌组织中VEGF阳性表达率为90．5％,明显高于AFP阴性者的67．2％（P〈0．05）,AFP阳性组的1、3、5年生存率分别为58．7％、13．1％、5．9％,显著低于AFP阴性组的92．1％、58．3％、32．5％（P〈0．05）。结论：AFPGC是一种恶性程度高、易发生肝脏和淋巴结转移的预后不良的肿瘤,联合检测AFP和VEGF,可作为判定胃癌侵袭转移能力的一项客观指标。     

冻融人树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤免疫效应

目的：观察人外周血和人脐血来源的冻融树突状细胞（dendritic cell,DC）基因疫苗的形态、表型及体外诱导的CTL抗肿瘤活性。方法：细胞因子扩增人外周血和脐血DC,分别将EBV-LMP2、HPV16E6基因转染2种来源的冻融DC制备疫苗。动态形态学观察和流式细胞术检测疫苗表面分子表达,体外诱导并测定CTL活性。结果：人外周血和脐血冻融DC疫苗均高表达CD80、CD86和CD83,低表达CD14,高表达CD1a,体外均能诱导高效的CTL活性（P=0.001）,并与新鲜DC疫苗差异无统计学意义,P=0.138。结论：负载肿瘤相关病毒抗原基因的冻融DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征,且能诱导高效的特异性抗肿瘤免疫应答。     

膀胱肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导 T 淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：研究经膀胱肿瘤抗原致敏后的树突状细胞（Dc）对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对T24膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞，联合应用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及白介素-4（IL-4）从单个核细胞中培养出Dc，以人膀胱癌细胞系T24肿瘤细胞裂解物刺激Dc，检测经膀胱肿瘤抗原致敏后的DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学影响并用M1rr显色法测定致敏Dc诱导的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞体外的抗肿瘤效应。结果：膀胱癌细胞裂解物致敏的Dc可诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应，与对照组比较具有显著性差异（P〈0．01）；增殖后的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：经膀胱肿瘤抗原致敏的Dc能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外有明显的抑癌效应。     

膀胱肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：研究经膀胱肿瘤抗原致敏后的树突状细胞（Dc）对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对T24膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞，联合应用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及白介素-4（IL-4）从单个核细胞中培养出Dc，以人膀胱癌细胞系T24肿瘤细胞裂解物刺激Dc，检测经膀胱肿瘤抗原致敏后的DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学影响并用M1rr显色法测定致敏Dc诱导的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞体外的抗肿瘤效应。结果：膀胱癌细胞裂解物致敏的Dc可诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应，与对照组比较具有显著性差异（P〈0．01）；增殖后的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：经膀胱肿瘤抗原致敏的Dc能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外有明显的抑癌效应。     

WT1致敏树突状细胞激活CTLs对HL60细胞作用的研究

目的研究分别负载WT1多肽抗原及HL60细胞冻融抗原的树突状细胞(DCs)产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对HL60细胞的杀伤效应。方法联合应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rh-sCD40L等细胞因子,诱导扩增自健康人外周血获取的单核细胞,培养出DCs,分别用WT1多肽抗原及冻融抗原冲击致敏,激活淋巴细胞。实验分4组WT1多肽致敏DCs为实验组A,HL60细胞冻融抗原致敏DCs为实验组B,未致敏DCs组为对照组A,单核细胞组为对照组B,LDH释放法检测CTLs对HL60细胞的杀伤作用。结果培养出具有典型特征的DCs,表达CD40达96%,CD80达77%,CD1α达69%,CD86达97%,体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴结胞增殖反应。在效靶比为20∶1时,WT1多肽致敏DCs组时HL60细胞杀伤率为89.1%,冻融抗原负载DCs组为90.6%,未致敏DCs组为32.8%,单核细胞组为26.1%。以下多肽或冻融抗原负载DCs与对照组相比显示更强的杀伤效应,P<0.01。结论WT1多肽抗原及HL60细胞冻融抗原冲击致敏DCs均能有效诱导T细胞抗白血病作用,为临床研制DCs疫苗提供实验依据。     

Combination of sunitinib with anti‐tumor vaccination inhibits T cell priming and requires careful scheduling to achieve productive immunotherapy

Sunitinib, a protein tyrosine kinase inhibitor is the frontline therapy for renal and gastrointestinal cancers. We hypothesized that by virtue of its well documented tumor apoptosis and immune adjuvant properties, combination of Sunitinib with anti‐tumor immunotherapeutics will provide synergistic inhibition of tumor growth. Our study was designed to evaluate the impact of Sunitinib on immunotherapy mediated anti‐tumor immune responses and evaluate its efficacy as a combinatorial therapy with tumor targeted immunotherapeutic vaccination. Mice immunized with recombinant α‐lactalbumin, a lactation protein expressed on majority of breast tumors were treated with 1 mg of Sunitinib for seven consecutive days beginning (1) concurrently, on the day of α‐lactalbumin immunization or (2) sequentially, on day 9 after immunization. Ten‐day lymph nodes or 21 day spleens were tested by ELISPOT assays and flow cytometry to evaluate responsiveness to α‐lactalbumin immunization in presence of Sunitinib and distribution of cells involved in T cell antigen priming and proliferation in different lymphoid compartments. In addition, therapeutic efficacy of the α‐lactalbumin/ Sunitinib combination was evaluated by monitoring tumor growth in the 4T1 transplanted tumor model. Our studies reveal that concurrent administration of Sunitinib with active vaccination against a targeted tumor antigen inhibits priming to the immunogen due to a drastic decrease in CD11b+CD11c+ antigen presenting cells, leading to failure of vaccination. However, sequential delivery of Sunitinib timed to avoid the priming phase of vaccination results in the desired vaccination mediated boost in immune responses.     

DC-CIK细胞的生物学活性及抗淋巴瘤细胞的作用

Objective: To investigate the proliferation capabilities, immunophenotype changes, level of secreted cytokines and activities against lymphoma cells under the condition that cytokine-induced killer (CIK) cells co-cultured with dendritic cells (DC) in vitro. Methods: DC and CIK cells were induced from peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers. They were co-cultured meanwhile CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapan-blue staining, killing activities were detected by MTT assay, immunophenotype changes were analyzed by flow cytometry, the IL-12 and INF-γ levels of the cultured supernatants were detected by ELISA kits. Results: The proliferation capabilities of DC-CIK cells were significantly higher than that of CIK cells (P < 0.05). Under the same condition, the ratio of double positive cells such as CD3 CD8 , CD3 CD56 in CIK cells was significantly enhanced by co-cultured with DC cells (P < 0.05). The level of IL-12 and INF-γ secreted in supernatants was increased noticeably by co-cultured DC-CIK cells on day 3 compared to CIK cells which were cultured alone (P < 0.01 and P < 0.05). Within the effector-target ratio range between 5:1 to 40:1, the activi-ties against lymphoma cells of DC-CIK cells were much higher than that of CIK cells (P < 0.05), and this effect was showed a positive correlation with the effector-target ratio. Conclusion: The proliferation capabilities, the level of secreted cytokines and the activities against lymphoma cells of DC-CIK cells were significantly higher than those of CIK cells. The research might provides theoretical and experimental basis for clinical immunotherapy of DC-CIK cells.     

CEA-rV负荷DC诱导CIK对CEA+肿瘤细胞的杀伤研究

  目的 用CEA-rV负荷脐血来源树突状细胞（DC）后，再诱导CEA抗原特异的细胞因子诱导的杀伤细胞，研究其对CEA阳性肿瘤细胞株杀伤活性的作用。方法 用淋巴细胞分离液分离脐带血单核细胞，分别诱导DC、CIK细胞及CEA-rV负载DC后，再与CIK细胞混合培养诱导CEA特异的细胞毒性T淋巴细胞。分别用以上不同类型细胞杀伤CEA+和CEA-的肿瘤细胞株。结果 CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阳性肿瘤细胞的杀伤活性，Lovo为58.2 %、A549为62.4 %，较之DC-CIK组对CEA阳性肿瘤细胞Lovo为44.8 % 、A549为50.2 %，具有更高的杀伤活性，差异有统计学意义（P＜0.05）。CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阴性肿瘤细胞的杀伤活性K562为79.7 %、Bel7402为70.1 %，DC-CIK组对CEA阴性肿瘤细胞K562为78.7 %、Bel7402为67.8 % ，两组间无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。用CEA-rV诱导的特异性CIK对CEA阳性肿瘤细胞Lovo杀伤提高了89.4 %，A549提高了83.1 %；而对于CEA阴性肿瘤细胞K562杀伤提高了32.5 %，Bel7402提高了21.7 %，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 负载CEA-rV基因重组痘苗的DCs（CEA-rV-DCs）诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CEA-rV-DCs-CIK）对CEA阳性肿瘤细胞有特异性杀伤能力。