HLA基因序列电泳多态性分析及其在骨髓移植中的应用

利用聚合酶链反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术建立了一套人白细胞抗原配型技术，包括ＨＬＡ－ＤＲ单链构象多态性，异二聚体分析和ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ－ＤＮＡ链构象多态性分析技术。对６３例骨髓移植供，受体进行了分析，其中经血清学确定为ＨＬＡ相合的１５对ＰＣＲ－ＳＣＰ分析完全相合；５对因病人血细胞数目和功能异常而供，受体血清不方法无法分型，ＰＣＲ－ＳＣＰ分析确定３对相合，２对不相合，病人临床缓解后重复血清学ＨＬＡ     

创伤后多器官功能不定综合征与HLA—DRB1基因的相关性研究

目的 研究ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因与创伤后多器官功能不全综合征（ＭＯＤＳ）的相关性。方法 采用多聚酶链反应－序列特异性引物分析法（ＰＣＲ－ＳＳＰ）,对３７例创伤后ＭＯＤＳ患者ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因进行分型,用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）进行血浆白细胞介素－１０（ＩＬ－１０）测定,并与相应健康人５２例结果比较。结果 创伤后ＭＯＤＳ患者ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１￣ＤＲＢ１＊１５０２（编码ＨＬＡ－ＤＲ２抗原     

PCR直接扩增与套式扩增用于HLA－DR基因分型的研究

人类ＨＬＡ抗原分型在人类学、法医学、疾病易感性及器官组织移植等研究中有重要的意义。在骨髓移植中，进行供者、受者ＨＬＡ配型，选择相合的供体，减少ＧＶＨＤ发生，是移植成功的关键。目前国内主要采用血清学方法进行ＨＬＡ配型。由于方法上的缺点，常有约２０％左右的误差率，因此，基因分型技术的研究与应用势在必行。该研究通过设计合成ＨＬＡ基因序列特异性引物，建立了ＨＬＡ－ＤＲ基因分型的套式扩增和直接扩增ＰＣＲ－ＳＳＰ技术，并在骨髓移植配型中进行了应用。对两种分型技术进行了对比，两种方法各有特点，套式扩增在高度同源的ＤＮＡ序列扩增中有高度的特异性，并具有高度的灵敏性，很少量的ＤＮＡ即可满足ＰＣＲ扩增，但需两次扩增，非同源因素影响增大；直接扩增操作简便，一次扩增完成分型，但结构同源因素对特异性影响大。两种方法经周密设计均有高度的准确性，可常规用于临床骨髓移植配型     

在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出完整的丙型肝炎病毒核心蛋白基因，将其克隆于表达载体ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子的下游，构建了重组质粒ｐＢＶ－ＨＣＶ；转化大肠杆菌后，以非融合蛋白方式表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，此蛋白的分子量约为２０ｋＤａ，表达量约占菌体蛋白的１１％；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验证明，此蛋白能与慢性丙型肝炎患者血清发生特异反应。序列分析结果表明，克隆于ｐＢＶ     

特异性寡核苷酸探针检测胰岛素依赖型糖尿病病人HLA－DR基因频率

为了探讨ＨＬＡ－ＤＲ基因在胰岛素依赖型糖尿病（ＩＤＤＭ）发病机制中的作用，利用聚合酶链反应技术及３０个特异性寡核苷酸探针检测３２例中国北方汉族ＩＤＤＭ病人及２５５名正常中国北方汉族人的ＨＬＡ－ＤＲ基因频率的分布。结果ＩＤＤＭ组ＤＲ３和ＤＲ４频率分别为２５．０％和４０．６％，明显高于正常组（８．６％和１８．６％），ＤＲ３和ＤＲ４的相对危险率分别为３．５ｌ和３．１０。提示ＤＲ３、ＤＲ，与ＩＤＤＭ易感性呈正相关。     

创面异体移植培养表皮细胞后存活的判定

应用４种方法判定烧伤创面异体移植的培养表皮细胞存活情况：１．聚合酶链反应（ＰＣＲ）查Ｙ染色体特异性ＤＮＡ片段；２．ＰＣＲ扩增ＰＭＣＴ１１８长度多态性基因位点；３．ＰＣＲ／ＳＳＯＨＬＡ－ＤＱａ分型；４．ＤＮＡ指纹。共检测１６例病人的２７个活检标本，均证实有供者的ＤＮＡ，最长时间为移植后９２天。初步实验结果表明：培养表皮异体移植后可存活较长时间。     

HBV－DNA套式一次PCR方法的建立

应用乙型肝炎病毒ＤＮＡＣ基因区的一对外引物（ＨＢＣ＿１和ＨＢＣ＿２，扩增片段长度为５６６ｂｐ）及一对内引物（ＨＢＣ＿３和ＨＢＣ＿４，扩增片段长度为３０１ｂｐ）对不同稀释度的ＨＢＶ－ＤＮＡ（ａｄｒ亚型）进行套式一次ＰＣＲ扩增，结果表明灵敏度可达到１０ａｇ水平。此方法快速、简便、灵敏、材异，与分子杂交的灵敏度相当。     

输血传播病毒-DNA聚合酶链方法的建立及应用

目的：建立输血传播病毒（ＴＴＶ）－ＤＮＡ聚合酶链反应方法并应用于新疆地区不同人群ＴＴＶ感染的检测。方法：根据已报道的ＴＴＶ基因痛列（ＤＤＢＪ序列号：ＡＢ００８３９４）,通过引物设计软件ＳＱＮＣＥ和ＯＬＩＧＯ在其ＯＲＦ１区设计一对ＰＣＲ引物,扩增产生一个３１５ｂｐ的扩增片段,产物经ＢｇⅠⅡ酶切分别产生一个２１９ｂｐ和９６ｂｐ的酶切片段。结果：用建立的ＰＣＲ方法在１５例维存尔族转氨酶升高的非甲－非庚型     

用RT-PCR方法定量检测脑内早老性痴呆有关基因的表达

目的：建立定量检测脑内早老性痴呆有关基因表达的方法。方法;采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法定量检测了小鼠海马和皮层内早老性痴呆有关基因β－淀粉样蛋白的前体蛋白（ＡＰＰ）、早老蛋白１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ－１,ＰＳ－１）、ＰＳ－２、ａｐｏＥ、ｔａｕ等基因的表达水平。结果：ＲＴ－ＰＣＲ具有灵敏度高、性好、快速等特点,尤其适合于定量检测微量样品和表达水平较低的基因。结论：ＲＴ－ＰＣＲ是一种定     

多重PCR同时检测粪便中的志贺菌、侵袭性大肠埃希菌和O－1群霍乱弧菌的致病基因

本研究建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增志贺菌、侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因和Ｏ－１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。对一组经常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻病人粪便标本检测后，ＰＣＲ法有２４例检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２例为非Ｏ－１群；对另一组５６例粪标本亦进行了检测。本方法具有简便、快速、特异、经济和不须培养等特点，宜于临床应用。     

普通PCR与TD-PCR在临床医学科研中应用价值的比较

目的 比较普通聚合酶链反应(PCR)与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR,TD-PCR)在临床医学科研中的价值.方法 以人类外周血基因组DNA为模板,设计VHL基因3个外显子的3对引物,根据普通PCR及TD-PCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序,通过试验选择PCR最佳反应条件,在同一程序中分别对3个片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,纯化后PCR产物测序分析两种试验方法 的差别.结果 电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TD-PCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高.结论 成功建立了TD-PCR方法 ,TD-PCR方法 较普通PCR更为高效实用,为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段.     

烧伤病人巨细胞病毒感染的检测分析

目的：观察严重烧伤病人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染情况及对病情的影响。方法：采用ＰＣＲ技术６０例烧伤病人创面及尿液中ＨＣＭＶ－ＤＮＡ,用ＥＬＩＳ观察血清中ＨＣＮＭＶ－ＩｇＭ、ＩｇＧ,并与５０例正常检测结果进行对照。结果：观察组血清中ＨＣＭＶ－ｇＭ和创面及尿液中ＨＣＭＶ－ＤＮＡ均高于对照组,感染ＨＣＭＶ的烧伤病人创而愈合较慢,外周血中淋巴细胞计数较高。结论：烧伤患感染ＨＣＭＶ的机会较大,且烧伤后早     

病毒性角膜炎的病原学诊断新法--多聚酶链反应

目的：评价多聚酶链反应技术对病毒性角膜炎病原学诊断的价值。方法：应用多聚酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＰＣＲ）技术检测１２例患者眼结膜囊分泌物中有无单纯疱疹病毒（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ,ＨＳＶ）,巨细胞病毒（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｙ Ｖｉｒｕｓ,ＣＭＶ）或ＥＢ病毒（Ｅｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ,ＥＢＶ）的脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）片段。     

聚合酶链反应检测人巨细胞病毒的方法及临床应用

在人巨细胞病毒（HCMV）高度保守区IEA基因内设计一对引物，建立了聚合酶链反应（PCR）检测HCMVDNA的方法，经实验证明有高度的特异性和敏感性，对其它疱疹病毒和正常人DNA无交叉反应，HCMVAD169株DNAEcoRⅠ酶切J片段的最小检出量为0.1fg,相当于6个基因拷贝，对PCR反应体系中的有关实验条件如Mg^2 浓度，引物浓度，TaqDNA多聚酶的浓度，循环程序等及尿标本的处理方法进行优化选择，用PCR检测20例肾移植受尿标本中HCMVDNA，结果11例（55%）阳性，表明PCR是一种快速，特异，敏感的检测方法，适用于肾移植等病人的HCMV感染监测。     

应用原位逆转录PCR 检测石蜡切片中HCV RNA

目的：检测石蜡包埋组织中的HCV RNA。方法：原位PCR是一种能够检测单拷贝、低拷贝（20bp）DNA或RNA序列的新技术，本研究应用原位逆转录PCR检测石蜡包埋人肝外胆管癌组织中的HCV RNA。结论和结论：（1）基因组DNA去除一定要彻底。（2）选择合适的逆转录酶。（3）用原位PCR仪专用的封片装置封好，以防扩增液流出。（4）无水乙醇后固定10min防止扩增产物扩散。（5）对于不同组织来源的DNA或RNA进行原位PCR扩增的次数不同，不是循环次数越多越好，次数增多有可能使扩增产物从细胞内溢出，增加非特异性。     

胰腺癌nm23—H1 mRNA表达及其临床意义

应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对２７例胰腺癌及７例正常胰腺组织标本中ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ表达进行了研究，结果表明，７例正常胰腺组织仅１例表达ｎｍ２３－Ｈ１ｍＲＮＡ，占１４．２８％，２７例胰腺癌标标有１９例表达ｎｍ２３－Ｈ１占７０．２５％，经Ｘ＾２检验，ｎｍ２３－Ｈ１ｍＲＮＡ表达与胰腺病理分级，临床分期及伴随局部淋巴结转移呈显著相关（Ｐ〈０．０５），ｎｍ２３－Ｈ１ｍＲＮＡ表达可作为胰腺癌     

用三甲基甘氨酸克服G+C丰富靶基因的PCR扩增困难

为探讨三甲基甘氨酸等有机溶剂对G＋C碱基丰富基因PCR扩增困难的影响，分别用标准PCR和添加有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺及三甲基甘氨酸的改进剂PCR对G＋C含量为70％的周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因（ARF）和G＋C含量为90％的胰岛素样生长因子受体Ⅱ（IGFRⅡ）进行扩增。结果显示，应用标准PCR及添加有甘油或甲酰胺的PCR均不能特异性扩出上述两基因；加入10％DMSO虽可扩出ARF基因但同时有非特异性产物；而加入三甲基甘氨酸可特异地扩增出642bp的ARF和540bp的IGFR Ⅱ基因。表明三甲基甘氨酸可消除G＋C丰富DNA区域二级结构对PCR扩增的干扰，明显促进这类基因的PCR扩增。     

一种新型核酸快速回收方法

目的：建立一种简便快速的核酸浓缩回收新方法，方法：采用不同浓度的线性聚丙烯酰胺作为共沉淀载体，加入醋酸钠和无水乙醇后混匀离心，利用紫外检测和电泳方法确定对不同种类，大小和体积的核酸的回收率。结果：该方法可在１５ｍｉｎ内完成全部操作，适用于２０ｎｔ以上的单链和双链ＤＮＡ，ＲＮＡ的浓缩，对于０．１μｇ以上，大于４００ｂｐ的ＤＮＡ片段，回收率几乎达１００％，回收浓缩产物不影响后续的逆转录，ＰＣＲ，酶切和     

聚合酶链反应快速诊断白色念珠菌菌血症

目的：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术诊断白色念珠菌菌血症。方法：设计的引物特异性扩增编码白色念珠菌细胞色素Ｐ４５０Ｌ１Ａ１的基因，其长度为２４３ｂｐ。ＥＤＴＡ抗凝血用去污剂溶解，用ＤＮａｓｅＩ去除人体白细胞和污染的细菌ＤＮＡ；念珠菌的细胞壁用溶胞酶消化并用ＳＤＳ和蛋白酶Ｋ裂解。用酚／氯仿／异戊醇提取模板ＤＮＡ。用ＰＣＲ技术扩增。结果：与细菌、病毒及人体细胞ＤＮＡ无非特异扩增。检出血中白色葡萄的阈值