甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实验研究

目的采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗.方法将2.2 kb的重组人甲胎蛋白(AFP)基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的上游,构建逆转录病毒载体LX2.2CD.再以此载体和另一不含AFP基因调控元件的逆转录病毒载体pCD2分别转染3种肝癌细胞系和1种肺腺癌细胞系,筛选出整合CD基因的抗G418克隆,并进行细胞生长抑制实验.结果5氟胞嘧啶(5FC)对用LX2.2CD转染的AFP阳性肝癌细胞具有特异杀伤作用,而对AFP阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无杀伤作用.结论在细胞水平实现了对AFP阳性肝癌细胞的靶向性基因治疗.     

甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗？…

目的 利用含有人甲胎蛋白启动子的腺相关病毒载体,构建能在人肝癌细胞株中特异表达目的的基因的质粒。方法 通过设计含有特定酶切点位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋启动子（ＡＦＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）主列并克琶含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ报基因的质粒,ｐＲＴ－ＵＦ５上,构建成含报告基因的重组腺相关病毒质粒ｒＡＡＶ－ＡＦＰ－ＧＦＰ转染表达ＡＦＰ的Ｈｅｐ Ｇ２细胞株和不表达ＡＦＰ的２９３因的质粒ｒＡＡ     

肝癌特异性甲胎蛋白及甲胎蛋白-mRNA分析的临床应用

原发性肝细胞癌(HCC)是慢性乙肝和丙肝盛行的亚太地区最重要的医学问题之一[1],其死亡率位于恶性肿瘤第2位。我国每年死于HCC的约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。几乎所有HCC都有肝硬化基础,确诊时已多属中、晚期,缺乏有效治疗,预后差。虽然HCC非手术疗法有进展,但手术切除     

肝细胞性肝癌合并门静脉癌栓与甲胎蛋白的高危因素分析

目的：探讨肝细胞性肝癌（hepatic carcinoma,HCC）,以下简称肝癌,患者发生门静脉癌栓（portal vein tumor thrombus,PVTT）的高危因素。方法：通过回顾性分析随机抽取的本科室2009年4月至2011年4月收治的HCC患者126例。分析 PVTT形成高危因素,包括甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）值（以400 ng/ml为界）、有无 PVTT、HBsAg、肿瘤直径、肿瘤数目、细胞分化程度（Edmondson-Steiner分级法）、有无脉管浸润以及性别。用卡方检验及非条件logistic回归分析。结果：126例为HCC,56例（44.4%）确诊为HCC合并PVTT。脉管浸润、肿瘤直径、高滴度AFP、肿瘤数目、细胞分化程度为 PVTT形成的高危因素（ χ2=20.97、13.67、4.73、5.04,均P＜0.05）。肿瘤大小、脉管浸润、细胞分化程度与AFP有关系（ χ2=8.121、4.038,均P＜0.05）。多因素分析AFP、脉管浸润是PVTT发生的独立危险因素。结论：在 HCC患者中,高滴度血清AFP可成为HCC患者发生 PVTT的一项危险指标,对早期发现肝癌合并 PVTT具有临床指导意义。     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00）,腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04）,优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

甲胎蛋白动态变化在原发性肝癌诊断中的价值(摘要)

甲胎蛋白动态变化在原发性肝癌诊断中的价值（摘要）刘玉诚１张世杰２张建立２甲胎蛋白（ＡＦＰ）是原发性肝癌（ＰＨＣ）的肿瘤标记物，其增高对ＰＨＣ的诊断有重要价值，其动态变化在ＰＨＣ诊断中的作用尚不清楚。为此，我们对５０例ＨＢｓＡｇ阳性的慢性乙型肝炎和肝硬...     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞,G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞）,使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞,MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感,IC50 约为6 500 μmol/L,而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后,U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用;为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

靶向性融合基因对人肝细胞性肝癌治疗作用的体外研究(摘要)

目的观察由人甲胎蛋白(AFP)启动子调控的单纯疱疹病毒II型胸苷激酶基因(HSV-Ⅱ-tk)与血管生成抑制素基因(Angio)的融合基因对人肝细胞性肝癌的体外治疗作用·方法通过PCR技术,从临床肝癌标本中克隆AFP启动子;通过基因重组技术,构建的真核表达载体pcDNA3/AFP/tk/Angio;通过阳离子脂质体Liofectamine介导,体外转染人肝细胞性肝癌细胞株SMMC-772l和Bel7402加入GCV,细胞培养·用RT-PCR、光镜、透射电境、MTT,流式细胞仪等方法检测HSV-Ⅱ-tk和An-giostatin基因在SMMC-7721和Bel 7402细胞中的表达及其对该细胞的杀伤作用·结…     

酪氨酸酶启动子调控的CD基因治疗恶性黑色素瘤

目的：克隆酪氨酸酶（Ｔｙｒ）启动子并探索其调控细菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）在黑色素瘤基因治疗中的应用价值。方法：用ＰＣＲ法从小鼠恶性黑色素瘤细胞Ｂ１６基因组中克隆Ｔｙｒ启动子片段并与正常序列比较，并于逆转录病毒载体ＧｌＮａ中调控ＣＤ基因（ＴｙｒＣＤ）。测体外表达和体内抗肿瘤作用。结果：来源于Ｂ１６基因组的Ｔｙｒ启动子重要反式作用位点未见突变。该Ｔｙｒ启动子可使ＣＤ基因在Ｂ１６中特异表达。转ＴｙｒＣＤ的     

肝癌基因治疗的进展

肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,目前缺乏有效的治疗手段,寻找肝癌新的治疗策略显得尤为迫切。基因治疗途径（依赖遗传物质转染细胞如溶瘤病毒、抑癌基因、自杀基因、编码抗血管生成因子基因、小干扰RNA（siRNA）和免疫调节分子基因）为肝癌治疗提供了富有希望的治疗途径,并且已经在肝癌和转移性肝癌的动物模型中进行了大量的实验评估,治疗的载体和基因的多样性,单独或联合应用基因治疗的途径可能在控制肝癌生长方面产生有利的效果。     

腺病毒介导BCSC-1基因实验性治疗鼻咽癌

目的探讨抑癌基因BCSC-1对肿瘤的治疗作用。方法制备重组腺病毒Ad5-BCSC-1。用CellTiter 96 A-queous细胞增殖单一溶液检测试剂盒检测细胞增殖。肿瘤体内注射Ad5-BCSC-1,以注射Ad5-egfp或PBS作为对照,1周后重复注射,再2周后处死小鼠,称瘤重。结果Ad5-BCSC-1感染的CNE-2L2细胞的生长明显减慢,细胞在培养中聚集成大细胞团块。注射PBS、Ad5-egfp和Ad5-BCSC-1的小鼠CNE-2L2肿瘤的平均瘤重分别为(2·28±0·73)、(2·07±0·40)和(0·58±0·32)g。Ad5-BCSC-1组显著低于PBS和Ad5-egfp组(P<0·05)。结论瘤体内注射Ad5-BCSC-1能抑制CNE-2L2肿瘤的生长,提示BCSC-1基因治疗对BCSC-1基因缺失或表达低下的肿瘤可能有治疗作用。     

Experimental studies on the immune regulation of fibroblast cell mediated interleukin－6 gene therapy

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙＧｕＳｈｅｎ（顾申）；ＣａｏＸｕｅｔａｏ（曹雪涛）；ＺｈａｎｇＷｅｉｐｉｎ...     

SYK基因启动子甲基化对肝细胞癌侵袭力的影响

目的 探讨肝癌细胞中SYK基因启动子甲基化的状态及其对肝细胞癌侵袭力的影响.方法 分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测SYK基因在肝(癌)细胞系L02、HepG2、MHCC97H、MHCC97L中的表达和甲基化状态;对SYK基因甲基化阳性的MHCC97H和HepG2细胞株利用TRANSWELL小室检测去甲基化药物5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后肝癌细胞穿膜的细胞数,作为评价肝癌细胞体外浸润能力的指标.结果 L02、MHCC97L表达SYK mRNA,MHCC97H、HepG2不表达SYK mRNA;L02、MHCC97L细胞SYK基因甲基化阴性,MHCC97H、HepG2细胞SYK基因甲基化阳性.甲基化阳性的MHCC97H、HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,SYK基因异常甲基化状态得到逆转,体外浸润能力显著下降(P＜0.001).结论 肝癌细胞中SYK基因的表达与启动子甲基化有关,SYK基因可抑制肝癌细胞的体外浸润能力.     

纳米载体介导热诱导启动子调控内皮抑素基因治疗肝细胞癌

目的 探讨加热诱导调控下纳米载体介导内皮抑素(Endo)基因治疗对肝癌细胞HepG2的体内外杀伤作用.方法 双酶切法构建热诱导启动子(HSPTOB)调控Endo基因的重组质粒cDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.溶剂挥发法制备载DNA的葡聚糖接枝聚乳酸纳米粒,透射电镜观察载DNA纳米粒的形态,并介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37 ℃、39℃、41℃、43℃、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测不同温度下EGFP表达,ELISA检测转染细胞上清Endo蛋白浓度,MTT法检测热诱导后Endo对HepG2和ECV304细胞牛长的影响,动物实验观察热诱导后Endo对肝癌移植瘤的抑制作用.结果 载DNA纳米粒呈圆形或椭圆形,粒径约90～120 nm.转染效率约30.65%.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃热诱导后转染细胞上清中Endo浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(41 ±10)μg/L.Endo抑制ECV304的生长,72 h时热诱导后细胞抑制率为96.3%,对HepG2细胞的生长却无影响.体内实验显示热诱导后Endo显著抑制肝癌移植瘤的生长,肿瘤抑制率为58.5%,高于不加热组(34.9%).结论 纳米载体可介导Endo基因转染HepG2细胞,低温加热可增强HepG2细胞内Endo基因的表达和分泌,抑制肝痛移植瘤的生长.     

逆转录病毒介导PTEN基因抑制人肝癌细胞系的生长

目的 研究外源性PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC的细胞周期、增殖及裸鼠致瘤能力的影响，探索肝癌基因治疗新途径。方法 将携有PTEN基因的真核表达载体体外转染HHCC细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养，以免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况，应用流式细胞仪、电子显微镜、生长曲线测定等方法研究PTEN基因对肝癌细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响。结果 稳定转染PTEN基因的HHCC肝癌细胞中PTEN蛋白稳定表达，细胞周期明显改变，细胞从G1期到S期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性下降70．6％裸鼠致瘤能力抑制率72．2％。结论 转染外源性PTEN基因可阻止HHCC肝癌细胞由G1期进入S期，并抑制肿瘤细胞增殖。     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

重组腺病毒介导的p53基因对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的探索p53基因在肝癌基因治疗方面的可行性.方法以人肝癌细胞系SMCC-7721为实验对象,将载有人野生型p53 cDNA的重组腺病毒(Ad-p53)感染SMCC-7721细胞及肿瘤组织,体外体内实验观察Ad-p53对SMCC-7721细胞生长的影响.结果Ad-p53对SMMC-7721细胞的抑制作用与感染浓度有关,MOI值越高,抑制作用越强.当Ad-p53在100 MOI效靶比时,SMCC-7721细胞基本达到完全抑制.感染2 d后P53蛋白表达达到高峰,SMCC-7721生长受到明显的抑制.瘤内注射Ad-p53后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小.结论Ad-p53转导野生型p53基因可能是一种有效的肝癌基因治疗途径.     

肝细胞癌组织中调控CDK2基因的靶miRNA的表达

目的通过筛选肝细胞癌及癌旁组织中microRNA差异表达谱探讨肝细胞癌组织中调控CDK2基因的靶miRNA。方法通过芯片分析临床收集的3例肝细胞癌与癌旁组织样本的miRNA差异表达谱,与miRNA生物信息数据库反向预测的miRNA进行比对,通过实时荧光定量PCR初步确定调控肝癌细胞CDK2基因表达的靶miRNA。利用FUNRICH软件对差异表达的miRNA进行GO富集分析和转录因子分析。结果通过比对芯片结果和反向预测结果筛选出9个miRNA与芯片结果一致,经qRT-PCR验证确定miR-18a-5p、miR-222-3p、miR-200a-3p、miR-375与临床样本的miRNA差异表达谱上/下调一致,其中miR-18a-5p、miR-222-3p表达上调,miR-200a-3p、miR-375表达下调。GO富集分析显示转录因子活性、细胞黏附分子活性、细胞核与胞质、转移酶活性富集程度高;筛选到5个与miRNA结合能力强的转录因子EGR1、SP1、POU2F1、SP4、FOXA1。结论初步确定miR-200a-3p、miR-375为肝细胞癌组织中调控CDK2基因的靶miRNA,与CDK...     

原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态检测

目的研究原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态及其与原发性肝细胞癌发生发展的关系。方法用特异性甲基化PCR（MSP）法检测30例原发性肝细胞癌肿瘤组织和5例正常肝脏组织中p16、p15基因启动子区甲基化状态，并进行统计分析。结果30例原发性肝细胞癌肿瘤组织中p16和p15基因启动子区分别有53．3％（16／30，P〈0．05）和46．7％（14／30，P〉0．05）甲基化，5例正常组织中未发现甲基化。两基因甲基化与原发性肝细胞癌临床病理及HBsAg之间无明显相关性（P〉0．05），两者在原发性肝细胞癌发生中有协同性（相关性和一致性）。结论p16、p15基因启动子区异常甲基化在原发性肝细胞癌中发生频率很高，可能对肝细胞癌发生发展起重要作用。     

人端粒酶启动子调控双自杀基因治疗肝癌的实验观察

目的 探讨人端粒酶逆转录酶的核心启动序列(hTERT)启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK真核质粒对肝癌细胞的特异性杀伤作用.方法 利用PCR扩增hTERT启动子、SV40、yCD及TKgly基因片段,单独或共同连至pEGFP-C1质粒载体,分别构建pEGFP-hTERT-CD、pEGFP-hTERT-TK及pEGFP-hTERT-CDglyTK质粒,并转染SMMC7721肝癌细胞和HL7702正常人肝细胞,观察其转染效率并以RT-PCR、QPCR、Western印迹方法检测目的基因的表达,给予不同浓度的5-FC及更昔洛韦(GCV)处理,在用MTT法评估杀伤效应和旁观者效应,TRAP-银染法检测杀伤前后细胞端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较和分析联合基因与单基因疗效的差异.结果 最终质粒的酶切产物所得片段与预期一致,RT-PCR、QPCR及Western印迹结果显示目的基因CD、TK及CDglyTK高表达;pEGFP-hTERT-CD、pEGFP- hTERT-TK及pEGFP- hTERT-CDglyTK转染效率分别为74.5％、76.3％、76.9％.转染pEGFP-hTERT-CDglyTK的细胞较单基因转染对前药具有更高的敏感性(P =0.020,P=0.015)、促细胞凋亡作用(P =0.023,P=0.017)及旁观者效应(P =0.012,P=0.001),可更大程度降低端粒酶活性(P =0.045,P=0.038).HL7702细胞的转染及生长未受自杀基因系统的影响.结论 本研究构建的hTERT启动子驱动的双自杀基因(CDglyTK)系统质粒,在体外实验中对人肝癌细胞具有特异性的高杀伤作用.