携带HuIFN－β cDNA的重组逆转录病毒载体的构建及在人肝癌细胞中的特异表达

目的：研究逆转录病毒介导干扰素基因转移及在肝癌细胞中特异表达作用。方法：将人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬ位点，分别构建了转录受ＳＶ４０启动子驱动的载体ＭＮＳＩＦＮＢ和转录受人甲胎蛋白增强子（ＡＦＰｅ）调控的载体ＭＮＡＩＦＮＢ。用脂质体转染法将载体分别转导ＰＡ３１７包装细胞，质粒转染率为每１０５ＰＡ３１７细胞（４～２５）×１０３ＣＦＵ／μｇ，病毒感染率（４．５～５００）×１０４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌、肾癌及黑色素瘤细胞。结果：ＮｅｏＲ克隆ＲＮＡ斑点杂交及ＩＦＮ活性分析证明，人ＡＦＰｅ可促进异源启动子启动ＨｕＩＦＮ－β基因在合成ＡＦＰ的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。结论：ＡＦＰ＂持家基因＂顺式调控序列在合成ＡＦＰ的肝癌细胞中特异驱动ＩＦＮ－β基因表达，该研究为肝癌特异性免疫基因治疗提供了资料。     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

甲胎蛋白特异启动元件介导的肝癌靶向性基因治疗的体外实验研究

目的采用体外培养的肿瘤细胞系探讨甲胎蛋白特异启动元件介导的靶向性肝癌基因治疗.方法将2.2 kb的重组人甲胎蛋白(AFP)基因顺式调控元件克隆于胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的上游,构建逆转录病毒载体LX2.2CD.再以此载体和另一不含AFP基因调控元件的逆转录病毒载体pCD2分别转染3种肝癌细胞系和1种肺腺癌细胞系,筛选出整合CD基因的抗G418克隆,并进行细胞生长抑制实验.结果5氟胞嘧啶(5FC)对用LX2.2CD转染的AFP阳性肝癌细胞具有特异杀伤作用,而对AFP阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无杀伤作用.结论在细胞水平实现了对AFP阳性肝癌细胞的靶向性基因治疗.     

甲胎蛋白基因转录调控元件驱动白细胞介素—2基因在肝癌 …

利用小鼠甲胎蛋白基因转录调控元件驱动白细胞介素－２基因在肝癌细胞中特异性表达。方法 构建转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｍＡＦＰ－ＩＬ－２，采用经包装后的病毒分别感染ＡＦＰ阳笥的小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａ１－６和ＡＦＰ阴性的小鼠ψ２细胞，检测ＩＬ－２表达。结果 该载体能使ＩＬ－２基因在Ｈｅｐａ１－６细胞中特异性表达而不能在ψ２细胞中表达。     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

人甲胎蛋白基因转录调控元件的改造

目的 为构建高效利用甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因转录调控元件（ＴＲＥｓ）,驱动治疗基因在肝癌细胞中特异性表达的基因治疗载体,对天然人ＡＦＰＴＲＥｓ进行改建和鉴定。方法 采用亚克隆技术,删除了天然人ＡＦＰＴＲＥｓ中含有沉默子活性的－０．８７－－３．０６ｋｂ区域,将具有增强子活性的－３．０６－－５．１ｋｂ片段和调控ＡＦＰ基因表达的启动子“核心”区域＋２９－８７０ｂｐ片段连接,获得经人工改造后的基因转录调控元     

人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

携带HSV—tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体。切除逆转录病毒病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ＰＭＮＭ；从真核表达载体ＰＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ＰＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮＰ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ＰＧＥＭ，７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ＰＭＮＰ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建     

CD基因对大肠癌杀伤作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ基因对大肠癌靶向治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动ＣＤ基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡＣＤＮa,脂质体裹 法将重组组织特异性载体pＣＤ２在逆转录病毒包装细胞ＰＡ３１７细胞中进行包装,收获病毒上清后分别转染入高分泌ＣＥＡ的大肠癌细胞ＬoＶo中,经Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后进行体外前药敏感实验及观察旁观者交应,然后再将转基因ＬoＶo细胞接种对裸鼠皮下成     

甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗？…

目的 利用含有人甲胎蛋白启动子的腺相关病毒载体,构建能在人肝癌细胞株中特异表达目的的基因的质粒。方法 通过设计含有特定酶切点位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋启动子（ＡＦＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）主列并克琶含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ报基因的质粒,ｐＲＴ－ＵＦ５上,构建成含报告基因的重组腺相关病毒质粒ｒＡＡＶ－ＡＦＰ－ＧＦＰ转染表达ＡＦＰ的Ｈｅｐ Ｇ２细胞株和不表达ＡＦＰ的２９３因的质粒ｒＡＡ     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

Combined effect of alpha-fetoprotein antisense oligodeoxy-nucleotides and 5-fluorouracil on human hepatoma cell growth

Ｗｅｈａｖｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｃｏｕｌｄｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ１,２ＥｖｉｄｅｎｃｅｉｍｐｌｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｓｂｙＡＦＰｈａｓａｌｓｏｂｅｅｎｐｒｏｖｉｄｅｄｂｙｏｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ３,４　Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｒｕｇｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｈｅｐａｔｏｍａｔ…     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

腺病毒载体介导的CD基因转移联合5-FC对大鼠卵巢癌细胞株的作用研究

目的：研究胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转移及其与5－氟胞嘧啶（5－FC）联合应用对卵巢癌细胞株生长的影响。方法：用复制缺陷型重组腺病毒为载体，将CD基因转染大鼠卵巢癌细胞株NUTU－19细胞，加入含5－FC的培养液培养，MTT法检测培养孔吸光度值，计算细胞存活率。结果：5－FC对转染了CD基因的NUTU－19细胞的生长抑制作用显著增强，并随着腺病毒滴度和5－FC浓度的增加，该作用不断增强。此外，5－FC可通过旁观者效应杀伤CD基因转染细胞周围未转入该基因的NUTU－19细胞。结论：CD基因转移联合5－FC作用对NUTU－19细胞具有显著的杀伤作用。     

放射线对肝癌细胞中端粒酶启动子活性的影响

目的:研究放射线对不同的肝癌细胞株中人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子活性的影响。方法:报告质粒phTERTp-Luc经脂质体METAFECTENE介导瞬时转染4种不同的肝癌细胞株后,给予2 Gyγ射线照射,观察照射组与非照射组中荧光素酶的表达。结果:瞬时转染4种不同的肝癌细胞株后,检测到照射可经hTERT启动子而诱导荧光素酶的表达增强,即hTERT启动子在2 Gy照射组中比在非照射组中具有更高的活性。结论:2Gyγ射线可以诱导肝癌细胞中hTERT启动子活性增强,有望用于增强肝癌细胞中hTERT启动子介导的靶向基因治疗,并为进一步深入研究奠定了基础。     

胞嘧啶脱氨酸基因治疗人胰腺癌的实验研究

探讨腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因用于人胰腺癌基因疗法的可行性。方法将含癌胚抗原启动子的重组腺病毒感染人胰腺癌ＳＷ１９９０细胞和Ｃａｐａｎ－２细胞以及人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞,用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＣＤ基因在细胞中的表达,以ＭＴＴ法比较细胞对５－氟胞嘧（５－ＦＣ）的敏感性差异。建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察ＣＤ基因的原位治疗效应及安全性。结果腺病毒介     

胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统对人胰腺癌细胞恶性增殖的抑制作用

目的　探讨大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶 (CD) / 5 -氟胞嘧啶 (5 - FC)系统对人胰腺癌细胞的体内外生长抑制作用。方法　将含 CD基因的重组逆转录病毒载体导入人胰腺癌细胞形成转化细胞系 ,对转化细胞进行体内外药物敏感实验 ,包括 :(1)计算转化细胞在前体药物 5 - FC作用下的细胞生长抑制率和克隆形成抑制率 ;(2 )MTT法检测旁观者效应 ;(3)观察 5 - FC对转化细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。结果　转化细胞在 5 - FC作用下其生长抑制率为 80 .0 % ,克隆形成抑制率为 79.0 % ,均明显高于未转化细胞生长抑制率 4.8%和克隆形成抑制率5 .0 % (P<0 .0 1) ;混合细胞中含 10 %的转化细胞时 ,生长抑制率已达 5 0 .7% ;转化细胞的裸鼠移植瘤在 5 - FC作用下体积缩小。结论　 CD/ 5 - FC系统对人胰腺癌细胞系细胞具有实验性基因治疗作用