NGX6基因联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响

目的:探讨候选抑瘤基因NGX6联用5-Fu对结肠癌细胞凋亡的影响.方法:以稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞与5-Fu联用作为实验组.以PDTC与5-Fu联用的HT-29细胞作为对照组.通过EMSA检测各组结肠癌HT-29细胞核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况,利用MTT比色法检测各组细胞增殖的情况.吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法显微镜观测以及PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况.结果:稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞以及应用了PDTC的HT-29细胞NF-κB的激活均明显受到抑制;与5-Fu作用的HT-29细胞组比较,5-Fu联合PDTC作用于HT-29细胞后,HT-29细胞增殖受到明显抑制,5-Fu诱导HT-29细胞凋亡作用增强;与5-Fu联合PDTC作用于HT-29细胞的对照组比较,在诱导细胞凋亡以及抑制细胞增殖方面,稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞与5-Fu联用组和对照组所取得一致的效果,NGX6基因增强5-Fu对HT-29细胞增殖抑制的能力及诱导HT-29细胞凋亡的能力.结论:NGX6基因抑制了肿瘤细胞NF-κB的激活,具有增强5-Fu诱导结肠癌细胞凋亡的能力,其机制可能是抑制肿瘤细胞NF-κB的激活,NGX6基因对肿瘤的治疗及预后起积极作用.     

青蒿不同溶剂萃取粗提物对结肠癌HT-29、LoVo细胞NF-κB活性的影响

目的:通过比较不同溶剂萃取青蒿的粗提物对结肠癌HT-29和LoVo细胞的核因子κB(NF-κB)活性的影响,寻找青蒿中对结肠癌细胞NF-κB活性有作用的萃取相.方法:分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇对青蒿水煎液进行萃取,并将萃取得到的粗提物分别处理结肠癌HT-29细胞和LoVo细胞,提取核蛋白后采用凝胶阻滞分析(EMSA)方法对NF-κB活性进行测定.结果:青蒿水煎液氯仿萃取相对HT-29细胞和LoVo细胞的NF-κB活性表达均有明显的抑制作用(P＜0.05),其它各萃取相对两种细胞NF-κB活性的影响与对照组比较无明显差异.结论:在不同溶剂萃取青蒿水煎液中,氯仿萃取相粗提物对结肠癌HT-29细胞和LoVo细胞的NF-κB活性具有抑制作用.     

蛋白激酶C在结肠癌多细胞耐药中的实验研究

目的：探讨蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）在结肠癌细胞多细胞耐药中的作用。方法：采用体外三维细胞培养的方法,通过应用不同剂量PKC抑制剂Staurosporine（SP）对三维（3D）培养结肠癌HT-29细胞药物敏感性、核因子-κB（NF-κB）活性及PKC活性的影响的研究,探讨PKC在结肠癌细胞群集耐药中的作用。结果：3D培养结肠癌细胞中PKC、NF-κB活性较二维（2D）培养细胞明显增高,氟尿嘧啶（5-FU）的药物敏感性降低;SP不同浓度处理HT-29球形细胞可抑制其PKC及NF-κB活性,对5-FU的药物敏感性增加,在一定浓度范围内,随着SP浓度的增加,抑制作用逐渐增强,存在量效关系。结论：PKC在结肠癌细胞群集耐药中有一定作用,抑制PKC活性,可增加结肠癌球形细胞对5-FU的敏感性。     

POKemon和NF-κB p65在肝癌细胞中的信号调控

目的:旨在探讨原癌基因POKemon和核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) p65在肝癌细胞中的信号调控作用.方法:采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法分别检测POKemon、NF-κB p65 mRNA和蛋白在肝癌细胞株HepG2和SMMC7721及人胚胎肝细胞LO2中的表达情况;随后应用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)法依次分别抑制POKemon和NF-κB p65在肝癌细胞中的表达,观察二者在肝癌细胞中的变化,并应用FCM法检测对肝癌细胞凋亡的影响.结果:POKemon和NF-κB p65在肝癌细胞HepG2和SMMC7721中的表达量明显高于人胚胎肝细胞LO2;特异性针对POKemon基因的siRNA抑制POKemon的表达后,NF-κB p65在HepG2和SMMC7721细胞中的表达量也明显下降,转染前后分别为2.12±0.14vs 1.37±0.11和2.08±0.16vs 1.35±0.13,差异有统计学意义(P＜0.05),且肝癌细胞凋亡明显增加分别为(5.07±0.46)％vs (39.65±3.75)％和(5.71±0.83)％vs (33.21±3.66)％,差异有统计学意义(P＜0.05);特异性针对NF-κB基因的siRNA抑制NF-κB p65的表达后,POKemon在HepG2和SMMC7721细胞中的表达则无明显变化,其表达量转染前后分别为1.86±0.12vs 1.90±0.13和1.91±0.11 vs 1.85±0.11,差异无统计学意义(P＞0.05),但明显提高HepG2和SMMC7721细胞的凋亡率,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:原癌基因POKemon可通过调控NF-κB p65的表达而阻遏肿瘤细胞凋亡,促进肝癌的发生、发展.     

HMGB1对结肠癌细胞VEGF-C表达的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白(high mobility group protein box1,HMGB1)对结肠癌细胞血管内皮生长因子C(vascular endothelia growth factor C, VEGF-C)的表达影响及核转录因子(nuclear factor κB, NF-κB )在其中的作用.方法:以HMGB1作为干预因素,通过RT-PCR方法检测在HMGB1作用不同时间后,结肠癌细胞HCT116中VEGF-C表达的变化.构建NF-κB干扰质粒,检测比较干扰前后HMGB1对结肠癌细胞VEGF-C表达影响的变化.结果:HMGB1可诱导HCT116细胞中VEGF-C的表达,随着对结肠癌细胞作用时间的延长,VEGF-C的表达逐渐增强,在2、4、8、12和24 h几个时间点中,以12 h时HMGB1对VEGF-C的表达影响最明显.抑制NF-κB可削弱HMGB1对VEGF-C的诱导作用.结论:结肠癌细胞中HMGB1可通过刺激NF-κB活化的途径,诱导VEGF-C.     

RNAi沉默CD133基因表达对结肠癌细胞株HT-29影响的研究

目的:探讨通过RNA干扰沉默CD133基因对结肠癌细胞株HT-29的增殖和侵袭力的影响。方法:将CD133siRNA用脂质体转染入HT-29细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD133mRNA的变化,蛋白质印迹法检测转染前后蛋白的表达水平,用MTT比色法和Transwell小孔实验分别检测癌细胞的增殖及侵袭力变化。结果:CD133siRNA转染成功,与正常对照组相比,转染组CD133mRNA及蛋白的表达水平均有明显的抑制,并呈现浓度时间依赖性。MTT实验证明转染组细胞随时间延长,增殖逐渐受到抑制,P<0.05。Tran-swell小孔实验中经转染处理的穿膜细胞数明显减少(P<0.05),RNA干扰降低了细胞的侵袭性。结论:CD133在HT-29癌细胞增殖及侵袭过程中起重要作用,RNA干扰可以有效抑制其CD133的表达,并能有效降低癌细胞的增殖及侵袭力。     

siRNA沉默livin的表达对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默人结肠癌HT-29细胞livin表达对HT-29细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:合成靶向livin的双链siRNA(livin-siRNA),转染HT-29细胞,RT-PCR及Western blotting检测HT-29细胞中livin mRNA及蛋白的表达,MTT实验检测HT-29细胞的增殖,流式细胞术检测HT-29细胞周期分布及凋亡,细胞侵袭实验检测HT-29细胞侵袭性的变化,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性的变化。结果:Livin-siRNA转染后48 h,与空白组、阴性对照组及脂质体组相比,livin-siRNA转染组HT-29细胞中livin mRNA水平明显下降(0.073±0.007 vs 0.395±0.082、0.423±0.025、0.418±0.032,P<0.05),其蛋白表达也明显下调(0.106±0.003 vs 0.456±0.065、0.473±0.078、0.491±0.045,P<0.05)。转染96 h后,livin-siRNA组HT-29细胞增殖能力明显低于对照组及脂质体组(0.564±0.102 vs0.833±0.127、0.860±0.153,P<0.05),且细胞凋亡率升高[(16.5±2.8)%vs(2.4±0.5)%、(3.7±1.0)%,P<0.05]。侵袭实验显示,livin-siRNA转染后,穿过Matrigel膜的HT-29细胞数量明显少于对照组及脂质体组[(31.3±4.5)vs(101.3±8.6)、(97.4±7.8)个,P<0.05)]。livin-siRNA组HT-29细胞的caspase-3活性低于对照组(0.160±0.023 vs 0.347±0.058,P<0.05)。结论:siRNA沉默livin的表达可抑制HT-29细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞的侵袭。     

siRNA干扰NF-кB家族成员表达抑制人肝癌HepG2细胞表达NKG2DLs

目的：探讨舒尼替尼诱导人肝癌HepG2细胞表达的自然杀伤细胞2族成员D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）与核因子kappa B（nuclear factor B kappa, NF-κB）信号通路之间的相互作用。方法：常规体外培养HepG2细胞,利用实时荧光定量PCR检测1 μmol/L舒尼替尼处理HepG2细胞24 h前后NF-κB基因家族成员 mRNA的表达情况,利用计算机辅助设计并合成NF-κB1、NF-κB2和RelB siRNA引物,通过脂质体法将目的基因siRNA转染于HepG2细胞,荧光显微镜观察转染情况,实时荧光定量PCR检测干扰效率,Western blotting检测siRNA转染前后HeG2细胞内NF-κB1、NF-κB2和RelB蛋白表达,流式细胞术检测siRNA前后HepG2细胞NKG2DLs表达率。结果： 实时荧光定量PCR结果显示,舒尼替尼处理HepG2细胞后,NF-κB1、NF-κB2和RelB mRNA表达水平升高,主要以NF-κB2 mRNA和RelB mRNA升高为主。荧光显微镜观测siRNA转染后HepG2细胞红色荧光表达率约为60%,干扰效率达95%以上。siRNA转染后HepG2细胞内NF-κB1、NF-κB2和RelB蛋白表达水平明显下降,siRNA转染+药物组NKG2DLs表达率明显低于药物处理组（P<0.05）。结论： 首次揭示了舒尼替尼通过NF-κB旁路途径诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs。     

CDX2基因通过NF-κB信号通路抑制结肠癌细胞增殖

目的 观察过表达CDX2基因对人结肠癌细胞株增殖影响,并初步探讨其作用机制。方法 通过基因转染技术将CDX2基因转染入结肠癌HT-29细胞株,经G418筛选后获得稳定转染细胞株,RT-PCR和Western blot检测CDX2基因表达。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪分析转染细胞的生物学行为。Western blot检测CDX2过表达对HT-29细胞内Cyclin D1和NF-κB磷酸化水平的影响。结果 经脂质体转染和筛选,建立了稳定过表达CDX2人结肠癌HT-29细胞株。转染CDX2组与未转染组和空白质粒组相比,细胞的生长速度减慢(P＜0.05),细胞周期中G₁/G₀期比例增加(P＜0.05),而S期比例则减少(P＜0.05);与未转染组和空白质粒组比较,转染CDX2基因组HT-29细胞的Cyclin D1和p-NF-κB活性明显降低。结论 CDX2基因可能通过抑制NF-κB通路抑制Cyclin D1活性,从而抑制人结肠癌HT-29细胞增殖。     

RNAi沉默整合素连接激酶基因表达对结肠癌细胞HT-29增殖的影响

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,阻断结肠癌细胞系HT-29中整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因的表达,研究ILK基因沉默后对HT-29细胞系增殖产生的影响。方法:构建针对ILK基因的真核表达质粒pSUPER-neo-EGFP-ILK(pSNE-ILK),在脂质体介导下稳定转染人结肠癌细胞系HT-29细胞(HT-29/pSNE-ILK组),同时以无关质粒pSUPER-neo-EGFP-C(pSNE-C)转染HT-29细胞(HT-29/pSNE-C组)和未转染细胞(HT-29组)作为对照,分别应用RT-PCR技术及蛋白印迹法检测ILK mRNA及蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖状况。结果:稳定转染后,HT-29/pSNE-ILK组ILK mRNA及蛋白表达水平分别为0.16±0.11和0.24±0.07,HT-29/pSNE-C组分别为0.53±0.10和0.56±0.08,HT-29组分别为0.64±0.11和0.77±0.02,前组ILK mRNA及蛋白表达水平分别与后两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);稳定转染pSNE-ILK质粒后HT-29细胞中ILK mRNA及蛋白表达抑制率分别为69.8%和57.1%。MTT比色法检测显示,HT-29/pSNE-ILK组细胞增殖率明显下降(P<0.05)。结论:RNA干扰技术能有效抑制靶基因ILK的表达,进而可抑制结肠癌细胞系HT-29的增殖。