α-突触核蛋白与帕金森病

α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。近来研究发现,α-突触核蛋白基因突变及其结构和功能障碍与包括帕金森病在内的多种神经变性疾病的病理机制密切相关。环境或基因因素均可引发α-突触核蛋白的错误折叠,从而启动一系列级联反应,最终导致多巴胺能系统损伤。深入了解α-突触核蛋白的生物特性及其毒性机制是揭示帕金森病发病并制定相应防治策略的关键。     

帕金森病α突触核蛋白的研究现状及展望

<正>帕金森病是人类中枢神经系统退行性疾病中第二常见疾病,累及特定中枢、周围和肠道神经系统,病程迁延进展且不可逆,通常发生于中老年人群,可长达数十年。临床医师识别运动症状相对容易,如非对称性运动减少、齿轮样肌强直、静止性震颤和姿势不稳等,而对其早期非运动性前驱症状进行准确解释和鉴别诊断仍很困难。帕金森病发病机制至今未明,少部分为基因突变所致,90%为散发性,但α突触核蛋白在家族性和散发性帕金森病中均有发     

重组人α-突触核蛋白原核表达系统的建立及纯化方法

目的 构建α-突触核蛋白的原核表达系统,通过蛋白纯化的定量测定,确定表达这一蛋白的最合适载体和纯化方法,为进一步研究岶金森病病理机制奠定基础.方法 将含有α-突触核蛋白DNA序列的质粒pET3a-Syn和pCEX-4T-1-Syn分别转入BL21(DE3),IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)诱导表达,分别采用HPLC和亲和层析的方法进行纯化.纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测纯度,BCA法进行定量比较.结果 构建了α-突触核蛋白两种载体的原核表达系统.pET3a-Syn表达的蛋白,每升菌液可获得20.5 mg目的蛋白;pGEX-Syn表达的蛋白,每升菌液可获得4.8 mg目的蛋白.结论 比较了两种α-突触核蛋白载体表达情况,确定了能够得到大量、高纯度α-突触核蛋白的纯化方法.     

红细胞α-突触核蛋白寡聚体作为帕金森病生物学标记物研究

目的研究帕金森病(PD)患者红细胞α-突触核蛋白寡聚体以及其与总蛋白的比值能否作为帕金森病的外周生物学标记物。方法选择PD患者77例(PD组),多系统萎缩(MSA)患者22例(MSA组),健康体检者89例(对照组)。红细胞内总蛋白通过蛋白定量的方法检测,α-突触核蛋白寡聚体通过ELISA检测。结果与对照组比较,PD组和MSA组红细胞α-突触核蛋白寡聚体含量[(3887±2160)μg/L,(3844±1887)μg/L vs(2718±887)μg/L],及红细胞α-突触核蛋白寡聚体/总蛋白[(28.5±18.1)ng/mg,(22.3±13.8)ng/mg vs(14.3±7.4)ng/mg)]明显升高(P<0.01)。在红细胞α-突触核蛋白寡聚体作为PD标记物的诊断中,ROC曲线下面积为0.68(P=0.037),最佳临界值为3801.8g/L,敏感性为42%,特异性为36%。而其与红细胞总蛋白的比值作为诊断指标,ROC曲线下面积为0.75(P=0.031),最佳临界值为14.90ng/mg,敏感性为76%,特异性为52%。结论红细胞α-突触核蛋白寡聚体以及红细胞α-突触核蛋白寡聚体/总蛋白的比值可作为鉴别突触核蛋白病与非突触核蛋白病的指标,后者有望成为诊断PD的外周生物学指标。     

热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白毒性的作用

目的 探讨HSP70在因α-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病(PD)细胞模型中的作用及其机制.方法 构建过表达野生型和PD相关突变型(A53T)α-突触核蛋白质粒,转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞后得PD细胞模型;然后在细胞模型中转染表达HSP70的质粒.采用免疫印迹检测转染HSP70细胞模型中α-突触核蛋白表达量的改变;采用MTT法检测转染HSP70后细胞模型活力的变化.结果 转染HSP70后,细胞模型α-突触核蛋白表达减少,细胞活性增加.结论 HSP70通过降低α-突触核蛋白表达水平对PD细胞模型发挥保护作用.     

α突触核蛋白基因多态性与帕金森病及其认知障碍的相关性研究

目的研究α突触核蛋白基因启动子区rs2736990、rs356219和rs1372525位点多态性的分析,旨在探讨α突触核蛋白多态位点与中国汉族人群帕金森病及其轻度认知功能障碍发生的关系。方法选择帕金森病患者189例(帕金森病组),同期选择健康体检者189例(对照组)。帕金森病组又根据轻度认知功能障碍诊断标准评估结果分为轻度认知功能障碍组97例和认知正常组92例。比较各组基因型和等位基因的分布。结果帕金森病组rs356219的等位基因"G"频率分布明显高于对照组,差异有统计学意义(60.1%vs 52.9%,P<0.05)。帕金森病组与对照组rs2736990和rs1372525位点的基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。轻度认知功能障碍组与认知正常组rs2736990、rs35621 9和rs1372525位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论α突触核蛋白基因的rs356219多态性与帕金森病的发病相关,等位基因"G"可能是帕金森病的易感因素。α突触核蛋白基因rs2736990、rs356219和rs1372525位点多态性可能与帕金森病的轻度认知功能障碍无关。     

α-突触核蛋白聚集作为帕金森病生物学标记物的研究进展

<正>帕金森病是一种常见的神经退行性疾病,临床表现为运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势平衡障碍,这些运动症状主要是由于多巴胺能神经元退变导致。此外,脑内其他区域神经元丢失引起非运动症状。帕金森病目前诊断主要依据英国帕金森病协会脑库帕金森病诊断标准,主要基于临床症状、体征和多巴胺能反应性,而运动障碍门诊的专家误诊率高达10%⁵0%,提示我们亟需寻找一种可将帕金森病从运动障碍疾病中区分出来的敏感性和特异性高的生物学标     

帕金森病血浆神经退行性蛋白与非运动症状的关系

目的探讨血浆神经退行性蛋白与帕金森病(PD)非运动症状的关系。方法连续收集就诊于江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)神经内科门诊的PD患者84例为PD组,同期招募年龄相匹配的健康体检者54例为HC组。PD组患者用系列临床量表评估非运动症状严重程度,采用ELISA法测定血浆tau、磷酸化tau181(p-tau181)、β淀粉样蛋白42(Aβ-42)和α-突触核蛋白(α-syn)水平,采用Spearman's相关性分析和二元logistic回归分析。结果PD组疲劳严重程度量表(fatigue severity scale,FSS)评分较HC组明显升高[(3.22±1.68)分vs(1.89±1.16)分,P=0.000]。PD组血浆α-syn水平较HC组明显升高[(320.00±64.91)ng/L vs (277.78±52.75)ng/L,P=0.000],Aβ-42水平较HC组明显降低[(267.61±77.75)ng/L vs (321.80±49.41)ng/L,P=0.001]。2组tau和p-tau181水平比较,无显著差异(P0.05)。PD组血浆α-syn水平与FSS评分呈正相关(r=0.237,P=0.030),且血浆α-syn水平是FSS评分的影响因素(OR=1.019,95%CI:1.006～1.032,P=0.004)。结论血浆神经退行性蛋白与PD非运动症状相关。血浆α-syn可能是PD疲劳的一种外周生物标志物。     

家族型帕金森病α-突触核蛋白突变体寡聚化对神经元毒性的影响

目的观察家族型帕金森病(PD)α-突触核蛋白(α-Syn)突变体A53T和A30P聚集体对大鼠原代神经元的神经毒性。方法取大鼠前脑皮质神经元进行原代培养,在培养基中加入体外孵育的α-Syn聚集体。培养14 d后,MTT法和神经元流式细胞术观察神经元的细胞活力。免疫荧光染色后以激光共聚焦显微镜观察细胞内聚集体的分布。硫磺素S染色观察细胞内包涵体的形成。结果加入α-Syn聚集体各组的原代神经元细胞活力较对照组降低(P0.05),而加入突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力比对照组明显降低(P0.01);突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力下降较野生型α-Syn聚集体显著(P0.05)。突变体A53T和A30P聚集体对神经元的毒性作用,在1~14 d内随培养时间而增加(P0.05);在1~10μmol/L浓度范围内,随浓度的增加而毒性增加(P0.05)。突变体A53T和A30P聚集体可以进入原代神经元内,并可在细胞内聚集而形成硫磺素S染色阳性的斑块。结论家族型α-Syn突变体A53T和A30P聚集体对原代神经元具有神经毒性,此作用具有时间和剂量依赖关系。这一现象对阐明家族型PD的发病机制具有重要意义。     

左旋多巴对帕金森病大鼠海马区酪氨酸羟化酶及α-突触核蛋白表达的影响

目的探讨左旋多巴(L-dopa)对帕金森病(PD)大鼠海马区酪氨酸羟化酶(TH)及α-突触核蛋白(α-Syn)表达的影响。方法选取96只健康雄性Wistar大鼠,按随机数字表法分为对照组、PD模型组和L-dopa干预组各32只;各组再随机分为4 d和8 d两个亚组,各16只。对PD模型组和L-dopa干预组大鼠皮下注射鱼藤酮乳液(2 mg/kg)建立大鼠PD模型,对照组皮下注射等剂量的葵花油。造模成功后对L-dopa干预组大鼠灌胃给予L-dopa干预治疗,对照组及PD模型组大鼠灌胃给予生理盐水,各组中两个亚组均分别持续4 d和8 d。采用Y型电迷宫试验检测各组大鼠的学习与记忆能力,海马区TH和α-Syn的阳性细胞计数及表达水平的检测分别采用免疫组化法及Western蛋白印迹法。结果 PD模型组大鼠的学习与记忆能力显著低于对照组,而L-dopa干预组较PD模型组明显提升(P0.05);PD模型组及L-dopa干预组大鼠的TH阳性细胞数及表达水平均显著低于对照组,L-dopa干预组高于PD模型组,且L-dopa干预组的8 d亚组高于4 d亚组(P0.05);PD模型组及L-dopa干预组的α-Syn表达水平均显著高于对照组,L-dopa干预组低于PD模型组,且L-dopa干预组的8 d亚组低于4 d亚组(P0.05)。结论鱼藤酮可诱导大鼠发生PD,使其学习与记忆能力显著下降,L-dopa可通过增强海马区的TH表达水平,抑制α-Syn的表达,从而治疗PD。     

帕金森病患者血浆α-synuclein、LC3、CacyBP/SIP水平与临床症状的相关性

目的 研究帕金森病(PD)患者外周血浆人α-突触核蛋白(synuclein)、微管相关蛋白1轻链(LC)3、钙周期蛋白结合蛋白(CacyBP/SIP)与PD临床症状的相关性.方法 选取47例PD患者(PD组)及25例健康体检者(对照组)血浆,采用CacyBP/SIP-酶联免疫吸附试验(ELISA)分析检测试剂盒、LC3...     

帕金森病非运动症状相关性的研究

目的 探讨帕金森病(PD)患者非运动症状(NMS)中抑郁、自主神经功能、认知功能、嗅觉、快速动眼睡眠障碍评分之间及其与运动症状的相关性.方法 采用PD综合评分量表(UPDRSⅢ)对44例原发性PD患者的运动症状进行评估;同时采用简易智力状况检查量表(MMSE)、17项汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)、PD自主神经功能量表(SCOPA-AUT)、睡眠障碍(RBD)量表和史尼芬16项嗅觉筛查量表(SS-16)对患者的NMS进行评分,与12例对照组比较,统计NMS之间及其与UPDRSⅢ之间的相关性.结果 PD组患者嗅觉障碍、抑郁程度、自主神经功能、快速动眼睡眠障碍均较对照组严重(P＜0.01),而MMSE的评分比较差异则无统计学意义(P=0.804).此外,在PD组中,HAMD-17评分(r=0.447,P=0.004)、SCOPA-AUT评分(r=0.360,P =0.023)与UPDRSⅢ呈明显正相关;而在NMS之间SCOPA-AUT与RBD评分呈正相关(r =0.331,P =0.035);HAMD-17与MMSE评分呈明显负相关(r=-0.460,P=0.003,);与SCOPA-AUT呈正相关(r=0.394,P=0.011).结论 NMS已经成为影响PD患者生活质量的重要因素.NMS常伴随发生,其中抑郁、自主神经功能紊乱程度与运动症状的严重程度密切相关;自主神经功能紊乱与睡眠障碍的发生有一定相关性;PD患者抑郁的程度与其认知障碍和自主神经功能紊乱程度一致.     

多巴胺与α-突触核蛋白在神经母细胞瘤细胞中的相互作用

目的 研究多巴胺(DA)与α-突触核蛋白(α-synuclein)在神经母细胞瘤细胞中的相互作用机制,探讨二者在帕金森病(PD)发病中的作用. 方法 3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氨唑溴盐(MTT)法确定外源添加DA的浓度,检测外源多巴胺对SH-SY5Y细胞α-synuclein、caspase-3活性片段表达及丙二醛含量的影响;野生型α-synuclein重组质粒转染SH-SY5Y细胞,观察细胞内多巴胺浓度、丙二醛含量、caspase-3活性片段表达水平的变化及多巴胺转运体抑制剂GBR12935对上述变化的影响. 结果 (1)外源添加300 μmol/L多巴胺作用24 h后SH-SY5Y细胞内多巴胺浓度较空白对照组升高了接近16倍(t=7.32,P＜0.01),α-synuclein、caspase-3活性片段表达水平及丙二醛含量均升高(t=4.92,P＜0.01;t=17.14,P＜0.01; t=6.55,P＜0.01);(2)α-synuclein重组质粒转染SH-SY5Y后细胞内多巴胺浓度(F=32.97,P＜0.01)、丙二醛含量(F=107.80,P＜0.01)、caspase-3活性片段表达水平(F=55.54,P＜0.01)均较空载体转染组升高,但这种上升均被GBR12935部分遏制. 结论 多巴胺促进SH-SY5Y细胞α-synuclein表达,而过表达α-synuclein又导致SH-SY5Y细胞内多巴胺浓度升高,二者形成产生细胞毒性的恶性循环.     

阿尔茨海默病患者脑脊液α-突触核蛋白、Aβ1-42、T-tau、P-tau、NF-L水平变化及意义

目的 观察阿尔茨海默病(AD)患者α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)、总牛磺酸(T-tau)、磷酸化牛磺酸(P-tau)、轻链蛋白(NF-L)水平变化,并探讨其临床意义.方法 AD患者43例(AD组),血管性痴呆(VD)患者51例(VD组),健康体检者30例(对照组),检测各组脑脊液α-突触核蛋白、Aβ1-42、T-tau、P-tau、NF-L,应用多因素分析联合5个指标区分AD和VD的灵敏度、特异度.结果 与对照组比较,AD组脑脊液α-突触核蛋白、T-tau、P-tau、T-tau/P-tau、NF-L水平升高,Aβ1-42水平降低(P均＜0.05);与对照组比较,VD组脑脊液α-突触核蛋白、T-tau、P-tau、T-tau/P-tau、NF-L水平升高(P均＜0.05);与VD组比较,AD组脑脊液Aβ1-42、T-tau、T-tau/P-tau 水平升高(P均＜0.05).联合5个指标区分AD和VD的灵敏度为93％、特异度为88％.结论 α-突触核蛋白、Aβ1-42、T-tau、P-tau、NF-L在AD中表达升高或降低,联合检测五种指标有可能早期诊断AD及鉴别VD.     

帕金森病患者非运动症状的研究

目的 调查帕金森病(PD)非运动症状的发生和分布情况及其与PD严重程度、病程之间的关系.方法 应用统-PD评分量表(UPDRS)的第Ⅲ、V部分、PD非运动症状30问卷量表(the PD NMS questionnaire,NMSQuest)、日常生活能力量表(ADL)和简易智能量表(MMSE)评分,对81例原发性PD患者的运动症状和非运动症状进行了评估,并将结果与国外的相关研究结果进行比较.结果 非运动症状在PD病程各个时期均可出现,平均每个PD患者出现7项左右不同的非运动症状,以记忆力障碍、便秘和夜尿增多的发生率最高.并且非运动症状的发生与PD疾病的进展相关,与Hoehn and yahr(H-Y)分级呈正相关(rs=0.360,P<0.01),与UPDRSⅢ运动评分呈正相关(rs=0.336,P<0.01),且影响患者的生活质量,与ADL评分呈负相关(rs=-0.250,P<0.05);而与年龄、性别、病程、PD发病类型和左旋多巴.每日治疗量无相关性.(分别为rs=0.193、rs=-0.142、rs=-0.053、rs=0.017和rs=0.195,均为P>0.05) 结论非运动症状的发生在PD中很普遍,对生活质量的影响不比运动症状轻,需要全面认识和及时干预.     

鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白聚集和ERK1/2通路活化的研究

目的探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞α-突触核蛋白聚集和细胞外信号调节激酶-1／2（ERK1／2）通路活化的影响。方法用鱼藤酮处理神经元样分化的PCI2细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞活力,免疫荧光法检测α-突触核蛋白聚集,免疫细胞化学法检测ERK1／2通路活化情况。结果鱼藤酮处理后细胞活力呈时间依赖性下降;磷酸化ERK1／2水平逐渐升高（P均〈0．01）;处理16h后细胞内出现α-突触核蛋白聚集体,24h后进一步增多。结论鱼藤酮可诱导α-突触核蛋白聚集和ERK1／2通路活化,参与多巴胺能神经元损伤。     

缺血性卒中患者血浆磷酸化α-突触核蛋白水平及磷酸化形成比例的改变

目的分析缺血性卒中患者血浆磷酸化α-突触核蛋白(α-Syn)水平以及α-Syn磷酸化形成比例的改变。方法回顾性分析2013年5—9月武警后勤学院附属医院神经内科急性缺血性卒中住院患者45的临床资料,另收集同期年龄和性别相匹配的45名健康者为对照组。利用双抗体夹心的酶联免疫吸附(ELISA)法测定血浆中的磷酸化α-Syn水平。另将基因重组α-Syn加入血浆,计算磷酸化α-Syn占总α-Syn的比例。结果缺血性卒中患者血浆磷酸化α-Syn水平明显高于对照组[(0.0472±0.0042)μmol/L比(0.0312±0.0043)μmol/L];缺血性卒中患者血浆α-Syn磷酸化形成比例高于对照组[(0.1170±0.0176)μmol/(100μmol·h)比(0.0364±0.0098)μmol/(100μmol·h)]。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,血浆磷酸化α-Syn水平变化判定缺血卒中的特异度和敏感度分别为0.88和0.81,曲线下面积(AUC)为0.91,cut-off值为0.060 mol/L,AUC 95%CI:0.889~0.961;血浆α-Syn磷酸化形成比例改变判定缺血卒中的特异度和敏感度分别为0.84和0.81,AUC为0.90,cut-off值为0.055mol/L,AUC 95%CI:0.898~0.971。结论缺血性卒中患者血浆磷酸化α-Syn水平和血浆α-Syn磷酸化形成比例较健康者增高。     

急性缺血性脑卒中患者外周血红细胞α−突触核蛋白寡聚体浓度的研究

目的 α?突触核蛋白与帕金森病及其他神经退行性疾病相关。动物模型中,细胞缺氧诱发氧化应激反应可导致α?突触核蛋白聚集。急性缺血性脑卒中（AIS）患者外周血红细胞α?突触核蛋白浓度变化未见相关报道。本研究旨在观察AIS患者外周血红细胞α?突触核蛋白寡聚体浓度变化。方法 招募55名正常对照、55名帕金森病患者（PD）和55名AIS患者,并采血留样本。采用纯化的重组α?突触核蛋白双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）作为进一步检测的测试标准。结果 外周血红细胞α?突触核蛋白寡聚体在正常对照组、PD组及AIS组中分别为（0.41±0.14）、（0.82±0.55）和（1.01±0.56）mmol/L。AIS患者红细胞α?突触核蛋白寡聚体浓度显著高于正常对照组（P＜0.001,95%CI 0.426～0.773）以及PD患者（P＝0.027,95%CI 0.022～0.369）。结论 AIS患者外周血红细胞α?突触核蛋白寡聚体浓度显著升高。这种改变可能参与急性缺血事件的病理生理学改变,但其临床意义有待进一步研究。     

新疆维汉两民族帕金森病患者运动症状及非运动症状的特点

目的探讨新疆维汉两民族帕金森病(PD)患者运动及非运动症状的严重程度。方法入选130例PD患者和80例健康人,通过完成临床症状评定量表评分(UPDRS)及HoehnYahn(H-Y)评分,非运动症状评分量表,比较维汉两民族PD患者运动及非运动症状的差异性。结果维汉两民族PD患者在病程,起病年龄,UPDRSⅠ,Ⅱ,Ⅲ部分及H-Y分级及首发症状方面对比差异无统计学意义。腹胀、睡眠障碍、便秘、疲乏和排尿困难是最常见的非运动症状主诉,其发生率在维汉两民族PD所占比率分别为:38.75%vs 38%;37.5%vs 60%;41.25%vs 38%;32.5%vs 24%;35%vs 62%。维汉两民族PD患者在便秘及疲乏方面比较差异有统计学意义(P0.05)。结论新疆维吾尔族PD患者在便秘及疲乏方面较汉族PD严重,而维汉两民族PD患者在其他运动症状及非运动症状方面比较无明显差异。     

α-突触核蛋白功能片段对大鼠原代培养神经元的促生长作用

目的 研究α-突触核蛋白(α-Syn)对Wistar大鼠原代培养神经元的促生长作用.方法 培养新生24h的Wistar大鼠大脑皮质神经元,以一定密度接种至培养皿中.设计分组,在各组别培养基中加入α-Syn和它的功能片段NAC段、N端和C端.培养至1、2、4h固定观察,计数存活神经元的数目.Western印迹法、免疫荧光法进行特异性鉴定.结果 当原代神经元培养至第1、2小时,α-Syn组和C端组的神经元数目比对照组多(P＜0.05),N端组和NAC段组与对照组无差异(P＞0.05);培养至第4小时,α-Syn组和C端组的存活神经元数目比对照组明显增多(P＜0.01),而N端组和NAC段组与对照组无差异(P＞0.05).增加C端浓度,可以提高神经元的存活率(P＜0.05).Western印迹法和免疫荧光法证实蛋白质片段N端和C端可由培养基进入到原代神经元中,而NAC片段不能进入神经元.结论 α-Syn在原代神经元培养初期对其生长有促进作用,具有这一功能的蛋白片段为C端,其可能的机制是进入到神经元内,促进胞内代谢活动,从而利于神经元的生长.