济南市售小米和玉米中赭曲霉素A污染状况研究

目的 了解济南市售小米和玉米中赭曲霉毒素A的污染情况。方法 采用竞争抑制酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测小米和玉米中赭曲霉毒素A的提取溶剂、检测条件、回收率等,并对其进行优化研究,并利用优化出的条件对济南市5个区市售小米和玉米中赭曲霉毒素A含量进行检测并评价。结果 含有5%氯化钠的60%甲醇水溶液对谷物中赭曲霉毒素A的提取效果较为理想,检测的所有样品中,小米、玉米赭曲霉毒素A检出率分别为41%和38%,其中,超市小米赭曲霉毒素A检出率（56%）明显高于集市小米（26%）(P＜0.05)。赭曲霉毒素A污染水平在0.40～4.45μg/kg之间,中位数为1.67μg/kg, 集市和超市出售的小米、玉米中赭曲霉毒素A污染水平均无统计学意义(P＞0.05)。本次检测所有样品中的赭曲霉毒素A含量均未超过国家规定的粮食中赭曲霉毒素A的限量标准。结论 济南市售的小米和玉米中均不同程度地存在赭曲霉毒素A污染,但污染水平均未超过国家标准。     

免疫亲合柱-高效液相色谱检测中药中赭曲霉毒素

目的 建立免疫亲合柱（IAC）-高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）检测常用中药中赭曲霉毒素（OTA）的方法。方法 样品经甲醇-水（85∶15）振荡提取后,通过IAC净化洗脱,HPLC分离定量。结果 OTA在2～200 ng/mL,呈良好的线性关系,r为0.998 9;OTA的最低检出限为0.5 ng/g;回收率为89.8%～94.6%,RSD为3.1%～6.9%。结论 建立的IAC-HPLC方法检测常用中药中OTA无干扰性杂峰,结果准确可靠。     

青霉菌固体发酵对三七药材活性成分的影响

目的：对三七药材经青霉菌发酵之后的主要活性成分变化进行研究。方法利用青霉菌对三七药材进行固体发酵,根据 HPLC-Q-TOF-MS 的检测结果,对三七发酵产物的主要活性成分进行分析和指认,同时考察黄曲霉素和赭曲霉素等微生物毒素的含量。结果三七药材经青霉菌发酵之后稀有皂苷含量显著提高,未见黄曲霉素和赭曲霉素产生。结论青霉菌可以对三七药材中皂苷类成分进行转化,提高稀有皂苷含量,改变药性,且未见明显的微生物毒素产生,具有一定的使用安全性。     

ELISA法测定发酵茶和植物香料真菌毒素的污染

目的探讨以ELISA法检测发酵茶、植物香料中玉米赤霉烯酮、伏马菌素、黄曲霉毒素（AFB1）、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、T-2毒素的可行性及污染状况。方法采用竞争酶联免疫吸附法,检测发酵茶、植物香料中玉米赤霉烯酮、伏马菌素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素。结果玉米赤霉烯酮浓度为40.0～1 000.0μg/kg之间的变异系数为1.5%～6.5%,回收率为87.5%～111.1%,r=0.998;伏马菌素浓度为0.25～5.0mg/kg之间的变异系数为2.0%～6.5%,回收率为90.0%～107.2%,r=0.992;黄曲霉毒素浓度为1.0～20.0μg/kg之间的变异系数为2.2%～7.8%,回收率为85.0%～115.0%,r=0.997;赭曲霉毒素浓度为2.0～40.0μg/kg之间的变异系数为1.8%～7.0%,回收率为87.5%～120.0%,r=0.998;脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为0.25～5.0 mg/kg之间的变异系数为1.5%～8.0%,回收率为90.0%～110.0%,r=0.996;T-2毒素含量浓度为75.0～500.0μg/kg之间的变异系数为2.8%～7.5%,回收率为86.6%～106.6%,r=0.996。结论ELISA法检测发酵茶、植物香料中玉米赤霉烯酮、伏马菌素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素简便快速。建议日常工作中先以ELISA法筛选,阳性样品再以液相色谱—质谱联用仪分析法、薄层法进行确证实验。     

ELISA法测定混合饲料多种霉菌毒素污染的研究

目的研究ELISA法检测饲料中伏马菌素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素的可行性,并对深圳市售玉米混合饲料污染状况调查。方法采用竞争ELISA法,检测玉米混合饲料中伏马菌素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素污染状况。结果伏马菌素浓度为0．25～5．0mg/kg之间的变异系数（CV,％）为1．0-7．0;黄由霉毒素浓度为1．0～20．0μg／kg之间的变异系数（CV,％）为1．0-7．5;赭曲霉毒素浓度为2．0～40．0μg／kg之间的变异系数（CV,％）为2．0-7．5;脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为0．25～5．0mg／kg之间的变异系数（CV,％）为1．0～8．0;T-2毒素含量浓度为75．0～500．0μg／kg之间的变异系数（CV,％）为2．0-7。结论ELISA法检测玉米混合饲料中几种毒菌素的污染,显示方法灵敏度高、干扰少、测定步骤简便、快速、操作安全、测定结果准确可靠。建议日常工作中先用ELISA法快速筛选检测,阳性样品再用液相色谱-质谱联用仪分析法、薄层法进行确证实验。     

基于CRISPR-Cas12a系统反式切割活性的凝血酶检测技术研究

目的：通过构建快速、灵敏的凝血酶检测技术,为多种血管栓塞性疾病,如脑静脉窦血栓形成（cerebral venous sinus thrombosis,CVST）的早期诊断和治疗提供新的策略。方法：利用所筛选的高特异性凝血酶适配体设计发夹结构变构探针,用于高特异性识别凝血酶并将凝血酶信号转化为核酸信号。在变构探针识别凝血酶后,适配体结合凝血酶引发变构探针变构,暴露Cas12a活性部分。CRISPR-Cas12a系统识别活性部分后,其反式切割特性被触发,开始无序切割周围存在的单链DNA荧光探针,导致标记在荧光探针两端的荧光基团（Cy3）和淬灭基团（BHQ）分离,使处于被淬灭状态的Cy3荧光重新出现。所产生的荧光信号的强度与体系中存在的凝血酶浓度呈正相关。结果：通过荧光实验证实所设计的变构探针对凝血酶表现出极高的识别特异性和稳定性;在所优化的实验条件下,该方法表现出良好的检测性能,检测限为0.23 pmol/L。结论：该方法结合了高灵敏度、低成本和良好的便携性等优点,为凝血酶相关疾病的检测与精准诊断提供了强有力的技术支持。     

核酸适配体对岩沙海葵毒素细胞毒性保护作用

目的 核酸适配体（Aptamer）是利用指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地与靶标分子结合。岩沙海葵毒素（Palytoxin,PLTX）是目前已知的最具毒性的非蛋白质类天然海洋毒素之一。基于核酸适配体对PLTX的特异性靶向功能,探究核酸适配体对细胞毒性的保护作用。方法 采用细胞毒性实验分别检测比较了PLTX对NIH-3T3、CHO-K1、HACAT三种不同细胞的毒性作用,以及适配体拮抗PLTX的细胞毒作用。采用红细胞溶血实验检测PLTX对人红细胞的溶血作用,以及适配体抑制PLTX的溶血活性作用。结果 三种细胞毒性曲线结果显示,HACAT细胞的ID50约为3.42ng/ml,CHO-K1细胞的ID50约为1.06×10-2ng/ml,NIH-3T3细胞的ID50约为1.39×10-2ng/ml。在不同浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对HACAT细胞的毒性作用（P<0.05）。在50nM PLTX浓度下,PLTX组与PLTX:aptamer=1:1组进行比较,结果显示适配体抑制PLTX对人红细胞溶血活性作用（P<0.05）。结论 实验结果表明HACAT细胞对2.5×10-3~2.5×102ng/ml浓度范围的PLTX毒性作用较敏感;核酸适配体对HACAT细胞具有细胞毒性保护作用。在50nM PLTX浓度下,相应浓度适配体能够有效抑制PLTX对人红细胞的溶血活性,起到显著细胞保护作用。     

金属纳米团簇荧光探针联合新型纳米材料在核酸检测领域中的应用现状

核酸检测技术在临床诊断、基因治疗和生物医学发展中发挥着重要的作用。金属纳米团簇(MNCs)荧光探针是一种具有极大应用潜力的荧光探针，最常用的有银纳米团簇(Ag NCs)荧光探针和铜纳米团簇(Cu NCs)荧光探针，可用于检测DNA和miRNA。新型纳米材料，如氧化石墨烯、纳米碳氧化物、金纳米颗粒、二硫化钨纳米片能够猝灭多种荧光团的荧光信号。利用新型纳米材料对单链DNA和双链DNA的吸附能力具有巨大差异的特性，可设计出“turn on”型检测平台。此外，将新型纳米材料如二氧化硅纳米颗粒、磁性微球等，与MNCs荧光探针联用时，可获得荧光放大效应。本文总结了近年来在核酸检测方面MNCs荧光探针与纳米材料联用的各种检测平台，分析这些MNCs荧光探针检测平台的设计原理、荧光行为及检测能力等，为疾病诊断和病理研究的分子工具提供参考。     

非标记型适配体传感器对石房蛤毒素的高灵敏度检测

目的 建立了一种基于荧光染料噻唑橙(thiazole orange,TO)和核酸适配体的非标记型适配体传感器,可快速、灵敏地检测石房蛤毒素(saxitoxin,STX)。方法 本研究中使用经过变形处理的直链适配体 45e-1能够特异性识别并结合STX,形成了稳定的G-四链体复合物。TO自身以游离态存在于水溶液中时几乎没有荧光发射,但通过与G-四链体的小凹槽结合产生荧光。因此,TO可作为荧光探针,用于指示45e-1与STX结合后产生的构象变化从而达到定量检测STX的目的。 结果 在最佳实验条件下,荧光信号强度变化与STX浓度呈正相关关系,拟合线性方程为Y = 3639.8lgCon_STX + 2341.5(R₂ = 0.9725),检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略。在海水中,该方法的加标回收率为90.7%–108.7%,RSD为7.1%–10.9%。结论 本研究建立的非标记型适配体传感器可以实现对STX的定量检测,并且具有良好的特异性和重现性,为准确、快速检测其他海洋毒素提供思路。     

糖皮质激素诱导A549细胞11β-羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用

目的 探讨糖皮质激素诱导11β-羟基类固醇脱氢酶1型表达,其选择性启动子的使用情况,为进一步研究糖皮质激素诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础.方法 糖皮质激素皮质醇（100 nM）和地塞米松（100 nM）预先处理A549细胞,通过半定量-RT-PCR和荧光报告基因检测方法,检测A549细胞中HSD11B1 mRNA表达水平和报告基因蛋白表达水平.结果 半定量-RT-PCR结果显示A549细胞中HSD11B1mRNA表达显著增加经由P1和P2两个启动子,但HSD11B1 mRNA表达主要来自于P2;荧光报告基因表达结果显示A549细胞中糖皮质激素诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加,然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化.结论 糖皮质激素诱导A549细胞HSD11B1表达经由选择性启动子P2.     

壳聚糖-碳纳米粒的制备及其体外性质的研究

目的 制备壳聚糖-碳纳米颗粒并研究其理化性质和体外活性。方法 首先，用溶胶法制备出分散性良好的碳纳米粉末，再通过正负电荷相互吸引制备出壳聚糖-碳纳米颗粒；其次，用绿色荧光蛋白（PEGFP-C1）质粒DNA作报告基因，以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA与壳聚糖-碳纳米颗粒结合形成载基因纳米粒；再次，用扫描电镜观察其形态特征，激光粒度分析仪测定其粒度分布及表面电位（Zeta电位），MTT试验检测壳聚糖-碳纳米载体对HepG2细胞和COS7细胞的毒性作用，凝胶阻滞实验确定该基因载体的DNA携带率，DNase Ⅰ保护实验研究其对所携带基因的保护作用，体外纳米粒导入实验定性评价纳米粒进入在体外进入细胞的活性，并用荧光显微镜观察导入效果。结果 壳聚糖-碳纳米粒表面携带正电荷，聚合指数〈0．3；与DNA结合后效率较高，且可保护DNA免受DNase Ⅰ的降解；经FITC标记后能够成功地进入到COS7细胞和HepG2细胞。结论 壳聚糖-碳纳米颗粒能进入到细胞内部，且导入效率较高，可以用作基因递送的非病毒载体系统，值得进一步研究。     

FAM134B介导的内质网自噬对脓毒症的影响

目的 初步探讨FAM134B介导的内质网自噬在脓毒症中作用。方法 采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症大鼠模型,取脑组织后,qRT-PCR检测mRNA水平、Western blotting检测FAM134B蛋白表达量;在脂多糖（LPS）诱导的N2a脓毒症细胞模型中,免疫荧光检测FAM134B在细胞中的分布,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3,Beclin1及凋亡相关蛋白活化Caspase-3的表达;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析检测细胞在不同处理后凋亡率;过表达FAM134B细胞中,LPS处理后分别检测自噬及凋亡相关蛋白的表达及细胞凋亡情况。结果 与正常对照组比较,脓毒症大鼠脑组织中内质网蛋白FAM134B表达下降（P?<0.05）;LPS诱导脓毒症细胞模型中内质网自噬及细胞凋亡,且过表达FAM134B能减少LPS对细胞的损害（P?<0.05）。结论 FAM134B介导的内质网自噬影响脓毒症的发生。     

适配体AS1411修饰的管状DNA瓦在卵巢癌靶向治疗中的应用

目的：研究AS1411适配体修饰的DNA瓦HA-6AS对卵巢癌细胞的靶向性以及载阿霉素（DOX）后对卵巢癌细胞的靶向治疗作用。方法：先用FAM荧光标记AS1411适配体或AS-like，与卵巢癌A2780细胞孵育3 h后离心去除游离的HA-6(FAM-AS)或HA-6(FAM-AS-like)，用流式细胞术测定细胞的荧光强度；HA-6AS与DOX孵育过夜并高速离心去除游离的DOX,A2780细胞种于96孔板后培养过夜，将系列浓度的HA-6AS-DOX、AS1411+DOX和游离DOX加入96孔板，3 h后加入CCK-8试剂孵育，于酶标仪下测定吸光度并计算细胞的活力值。结果：用HA-6(FAM-AS)孵育的A2780细胞平均荧光强度比HA-6(FAM-AS-like)高（P<0.000 1），且具有浓度依赖性；HA-6AS-DOX能在3 h内比AS1411+DOX和游离DOX更快速地对A2780细胞产生杀伤作用（P<0.01）。结论：AS1411能提高HA的靶向性，使HA-6AS-DOX可以对卵巢癌产生靶向治疗作用。     

用高效液相色谱法测定粮食样品中的赭曲霉毒素A

目的：建立用高效液相色谱仪测定赭曲霉毒素A（ochratoxinA,OA)的方法，对沈阳地区小麦，水稻中OA的污染情况进行检测。为评价我国粮食中OA的污染现状提供科学依据。方法：用高效液相色谱法，荧光检测器检测，激发波长为338nm，发射波长为455nm。流动相为乙腈-0.008mol/L磷酸（56：44，V/V）。结果：在35份小麦样品和27份水稻样品中有一份小麦样品OA阳性，方法回收率在80%以上，最低检测限为0.5μg/kg。结论：建立的方法简便，经济、可靠，检测结果提示沈阳地区小麦和水稻的OA污染率较低。     

鼻咽癌癌变前后ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC4甲基化研究

目的：研究鼻咽癌变前后ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC4甲基化特征。方法：12例鼻咽癌10例鼻咽炎作为研究对象,抽提鼻咽组织DNA,以特异识别5-甲基胞嘧啶的抗体免疫沉淀DNA,实时荧光定量PCR分别检测5个基因含量,并设置不用5-甲基胞嘧啶抗体（非MeDIP-qPCR实验）及使用非特异性抗体IgG进行免疫沉淀作为双重对照。结果：无论鼻咽癌还是鼻咽炎患者,5个基因在使用非特异性抗体IgG实验时均未检验到甲基化,非MeDIP-qPCR实验显示5个基因在鼻咽癌及鼻咽炎荧光定量值无明显差异（P >0.05）;MeDIP-qPCR实验显示,鼻咽癌5个基因均呈现明显的甲基化,ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC45在鼻咽癌校正值分别为：3.39±2.28、6.03±3.93、3.68±1.81、7.12±3.17、3.10±1.94,在鼻咽炎分别为0.00±0.00、0.01±0.01、0.25±0.49、0.20±0.20、0.00±0.00（均P<0.01）。结论：ADAM23、MIMT1、FAM150B、GRIN2A、LRRC4 5个基因甲基化为鼻咽癌变的重要特征。     

实时PCR和cycling probe技术检测母血浆游离胎儿DNA筛选重型β1地中海贫血胎儿

目的通过检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA来筛选重型β-地中海贫血胎儿。方法选择行产前基因诊断的夫妇6对．孕妇孕周23-26周。血液学检查：胎儿的父亲均为β-地中海贫血17M／N型，孕妇本人为携带除17M／N型之外的另一β-地中海贫血突变类型。针对CD17（A—T）无义突变，设计β-珠蛋白肽链上该等位基因的一对特异性引物和通过cyclingprobe法分别设计检测正常基因序列和基因突变位点的两条荧光探针，分别用FAM和HEX荧光标记。结合RT-PCR技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA，诊断胎儿是否遗传了其父亲的β地中海贫血17M／N碱基突变位点。同时与脐血血液学检查所诊断的胎儿地贫基因型对照。结果提取的6例孕妇血浆DNA模板中有3例同时显示FAM和HEX荧光信号值阳性结果，即这3例孕妇的胎儿遗传了父亲β-珠蛋白肽链上CD17位点的突变碱基（A—T）。另外3例孕妇血浆DNA模板的FAM信号值阳性，HEX信号值阴性，即所孕胎儿没有遗传父亲的CD17位点的突变碱基。结论利用RT-PCR和cyclingprobe技术检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA可用来筛选患重型地中海贫血的胎儿。     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的 利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法.方法 利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测.考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光...     

核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术体外筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地结合氨基酸、糖类、蛋白质、细胞、细菌和病毒等多种目标物质,具有操作简单、灵敏度高和检测成本低等优点.在海洋生物毒素的检测和预防中,核酸适配体技术已显示出巨大的潜力.本文概述了核酸适配体技术的基本原理、目前的应用现状及优势,分析了海洋生物毒素分子的特点及现有检测手段的局限,并对核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用前景进行了展望.     

缺氧诱导因子-1α对人卵巢颗粒细胞KGN能量代谢的影响及作用机制研究

目的：探究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人卵巢颗粒细胞KGN能量代谢的影响及作用机制。方法：将KGN细胞随机分为KGN组（细胞不做任何处理），si-NC组（转染阴性对照si-NC）和si-HIF-1a组（转染siRNA si-HIF-1a）。利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测HIF-1a、线粒体DNA(mtDNA)及己糖激酶（HK2）的mRNA表达；蛋白质免疫印迹法（western blotting）检测HIF-1α蛋白表达；细胞计数试剂盒（CCK-8）检测各组细胞的增殖活力；流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率；线粒体超氧化物（MitSOX）荧光染色检测各组细胞内的线粒体活性氧（ROS）含量；5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基碳氰碘化物（JC-1）荧光染色检测各组细胞膜电位；三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒检测各组细胞内ATP含量。结果：低表达HIF-1a可以降低KGN的细胞增殖活力（P<0.01），增加细胞的凋亡率（P<0.01）；同时细胞外酸化率显著增加（P<0.01），而糖酵解关键酶...     

外泌体双膜蛋白共表达检测平台:基于磁性分离和催化发夹组装

目的 构建基于磁性分离和催化发夹组装（CHA）信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。方法 细胞培养与细胞上清液中外泌体的分离纯化和表征。超分辨成像技术与免疫印迹实验表征CD63在外泌体膜上的表达。外泌体与AptEpCAM-T催发链反应电泳图验证EpCAM适配体与外泌体结合。荧光检测法验证CHA核酸序列的可行性、优化反应条件以及验证该方法特异性。结果 超分辨成像技术与免疫印迹实验显示乳腺癌MDA-MB-231细胞来源外泌体富含CD63膜蛋白。外泌体与AptEpCAM-T催发链反应电泳结果显示EpCAM适配体能够识别并结合外泌体。检测平台特异性试验：人正常乳腺上皮细胞外泌体（MCF-10a exo）荧光检测信噪比：1.10±0.01,乳腺癌细胞外泌体（MDA-MB-231 exo）荧光检测信噪比：2.09±0.08。结论 构建基于磁性分离和CHA信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。可同时检测外泌体膜上表达的两种蛋白：CD63和EpCAM。乳腺癌细胞外泌体与人正常乳腺上皮细胞外泌体膜蛋白CD63和蛋白EpCAM表达有区分度。