RNA干扰抑制CD133 表达对CD133+肝癌干细胞增殖和化疗敏感性的影响

目的利用慢病毒介导的RNA干扰技术下调CD133+
HepG2肝癌干细胞中CD133的表达,探讨其对肝癌干细胞增殖及化疗敏感性的影响。方法利用流式分选技术筛选CD133+
HepG2细胞并检测分选前后CD133表达量,体外成球及体内成瘤实验
鉴定其“干性”;随后以CD133mRNA编码序列为干扰靶点,采用慢病毒介导的shRNA转染CD133+细胞。应用RT-PCR和
Western Blot检测CD133mRNA及蛋白表达,克隆形成实验检测转染前后细胞增殖情况,CCK-8法和流式细胞仪检测在化疗药
物顺铂作用下转染前后细胞的生长抑制率及凋亡情况。结果分选前后CD133表达率分别为（3.36±1.80）%,（ 88.74±3.19）%;
CD133+细胞相对于CD133-细胞有更强的体外成球和体内成瘤能力;转染CD133shRNA后的细胞CD133mRNA表达明显受到
抑制（P<0.05）,蛋白表达水平降低,增殖能力显著下降（P<0.01）。顺铂对转染CD133shRNA后细胞生长抑制作用明显提高（P<
0.01）,且其在顺铂作用下的凋亡率也显著增加（P<0.05）。结论慢病毒介导的shRNA能显著下调CD133+肝癌干细胞CD133基
因的表达,抑制其增殖并提高其对顺铂的敏感性。
     

HepG2、Hep3B细胞中肿瘤干细胞相关标志分子的表达

目的富集培养肝癌干细胞,研究肝癌干细胞相关标志物CD90、CD133、八聚体4(Oct4)和ATP结合盒转运蛋白ABCG2在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达,并初步分析其意义。方法使用流式细胞仪从肝癌细胞(检测HepG2、Hep3B两种细胞系)中分选肝癌干细胞并行无血清成球培养。设肝癌细胞组为对照组。单细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力。分别给予肝癌细胞及肝癌干细胞阿霉素处理,MTT法测阿霉素处理后各组细胞的存活率,Real-time PCR及Western blot分别检测各组细胞CD90、CD133、Oct4和ABCG2 mRNA及蛋白水平的表达。结果肝癌干细胞单个细胞增殖能力强于肝癌细胞,克隆形成分析显示培养第14天克隆形成率Hep3B细胞组低于Hep3B CSCs组[8/27(30%)vs 12/23(52%),P<0.05];HepG2细胞组克隆形成率也低于HepG2 CSCs组[7/38(18%)vs 9/26(35%),P<0.05]。用阿霉素处理肝癌细胞及肝癌干细胞48 h后,MTT法测定结果显示肝癌干细胞组细胞活性显著高于对照组(P<0.05):HepG2细胞组细胞活性为(38.17±6.92)%、HepG2 CSCs组为(69.88±5.43)%;Hep3B细胞组(50.16±4.89)%,Hep3B CSCs组为(78.53±7.86)%。Real-time PCR结果显示肝癌干细胞组中CD90、CD133、Oct4及ABCG2基因mRNA表达较亲代细胞组显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示肝癌干细胞组Oct4及ABCG2蛋白水平显著上调,与亲代细胞组间表达差异有显著性(P<0.05)。结论肝癌干细胞相关标志CD90、CD133、Oct4及ABCG2均高表达于肝癌干细胞,并且Oct4及ABCG2基因的高表达有可能与肝癌干细胞耐药性相关。     

8-溴-7-甲氧基白杨素对Huh-7细胞系肝癌干细胞样细胞自我更新的影响

目的:研究8-溴-7-甲氧基白杨素(BrMC)抑制源自人肝细胞癌Huh-7细胞系细胞肿瘤球形成细胞即肝癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养人肝癌Huh-7细胞系细胞,干细胞条件培养基悬浮培养法富集和扩增LCSLCs。MTT比色法测定细胞活性;肿瘤球形成法检测自我更新能力;FITC-CD133标记FCM分析CD133表达。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6天,Huh-7细胞形成非粘附、三维生长的肝癌球体细胞即LCSLCs。与Huh-7细胞相比,BrMC抑制LCSLCs细胞活性作用更强(P<0.05),并以浓度依赖性方式减少肿瘤球数目(P<0.05),降低CD133蛋白表达(P<0.05)。结论:干细胞条件培养基悬浮培养能分离和富集LC-SLCs;BrMC具有抑制LCSLCs细胞自我更新能力作用,其作用机制与降低干细胞标记物CD133蛋白的表达相关。     

Expression of cancer stem cell-associated markers in liver cancer cell lines HepG2 and Hep3B

目的 富集培养肝癌干细胞,研究肝癌干细胞相关标志物CD90、CD133、八聚体4(Oct4)和ATP结合盒转运蛋白ABCG2在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达,并初步分析其意义.方法 使用流式细胞仪从肝癌细胞(检测HepG2、Hep3B两种细胞系)中分选肝癌干细胞并行无血清成球培养.设肝癌细胞组为对照组.单细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力.分别给予肝癌细胞及肝癌下细胞阿霉素处理,MTT法测阿霉素处理后各组细胞的存活率,Real-time PCR及Western blot分别检测各组细胞CD90、CD133、Oct4和ABCG2 mRNA及蛋白水平的表达.结果 肝癌干细胞单个细胞增殖能力强于肝癌细胞,克隆形成分析显示培养第14天克隆形成率Hep3B细胞组低于Hep3B CSCs组[8/27(30％)vs 12/23(52％),P＜0.05 ];HepG2细胞组克隆形成率也低于HepG2CSCs组[7/38(18％)vs 9/26(35％),P＜0.05].用阿霉素处理肝癌细胞及肝癌干细胞48 h后,MTT法测定结果显示肝癌干细胞组细胞活性显著高于对照组(P ＜0.05):HepG2细胞组细胞活性为(38.17 ±6.92)％、HepG2CSCs组为(69.88±5.43)％;Hep3B细胞组(50.16±4.89)％,Hep3B CSCs组为(78.53±7.86)％.Real-time PCR结果显示肝癌干细胞组中CD90、CD133、Oct4及ABCG2基因mRNA表达较亲代细胞组显著上调(P＜0.05).Western blot结果显示肝癌干细胞组Oct4及ABCG2蛋白水平显著上调,与亲代细胞组间表达差异有显著性(P＜0.05).结论 肝癌干细胞相关标志CD90、CD133、Oct4及ABCG2均高表达于肝癌干细胞,并且Oct4及ABCG2基因的高表达有可能与肝癌干细胞耐药性相关.     

Notch 1信号通路对人肝癌SMMC 7721细胞中CD133+细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究人肝癌SMMC 7721细胞中CD133+细胞的干细胞特性,初步探讨调控Notch 1信号通路对CD133+细胞亚群增殖和凋亡的影响.方法 流式分选和检测SMMC 7721细胞中的CD133+细胞.利用软琼脂集落实验及裸鼠成瘤实验验证CD133+细胞的干细胞特性.RT-PCR法检测CD133+细胞中Notch信号系统的表达;将分选出来的CD133+细胞分为激活组(加入Notch 1激活剂Jagged 1)、抑制组(加入Notch 1抑制剂DAPT)和空白对照组(加入PBS缓冲液),RT-PCR法检测3组细胞Hes-1基因的表达,MTT法和流式细胞仪检测各组细胞增殖能力和凋亡能力.结果 成功分选出CD133+亚群细胞;软琼脂集落实验和裸鼠成瘤实验表明CD133+细胞较CD133-细胞具有较强集落形成能力和体内成瘤能力;RT-PCR检测CD133+细胞中仅表达Notch 1/Jagged 1信号通路;激活组Hes-1表达强度增强,抑制组表达强度减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).MTT检测激活组、抑制组和空白对照组吸光度值差异均有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测激活组总凋亡率大于空白对照组,反之,抑制组总凋亡率小于空白对照组,各组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133+细胞是人肝癌SMMC 7721细胞中干细胞标志物之一,Notch 1信号通路对CD133+细胞的增殖和凋亡发挥着重要作用.     

人参炔醇联合吉西他滨对胰腺癌干细胞分化及活性的影响

目的: 探讨人参炔醇和吉西他滨联合作用对胰腺癌干细胞(pancreatic cancer stem cell, PCSC)干性及活性的影响。方法: 体外悬浮培养法培养和富集人胰腺癌PANC-1细胞系干细胞,采用荧光激活细胞分选法（fluorescence activated cell sorting,FACS）分选出CD133⁺的细胞亚群;将分选的CD133+细胞分为PBS（对照）组、人参炔醇组、吉西他滨组和人参炔醇与吉西他滨联合组,人参炔醇与吉西他滨最终浓度分别为164 μmol/L,2 μmol/L。流式细胞术检测各组细胞CD133+比例;CCK-8实验检测细胞增殖率;Annexin-V/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测增殖相关蛋白Ki-67及凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。结果： 各组细胞处理48 h后,与对照组相比,人参炔醇组、吉西他滨组和联合组CD133⁺细胞比例明显减少, 而两药联合作用CD133⁺细胞比例减少更显著(P<0.01);人参炔醇和吉西他滨均可抑制胰腺癌PANC-1干细胞增殖并促进细胞凋亡(P<0.05),而联合作用对干细胞增殖能力的抑制作用更显著(P<0.01),促进细胞凋亡更明显(P<0.01);与人参炔醇组和吉西他滨组相比,联合组的Ki-67和Bcl-2表达明显下降。结论： 人参炔醇联合吉西他滨可促进胰腺癌干细胞体外分化,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而抑制细胞活性。     

肝癌干细胞CD90+和ESA+亚群生物学特性研究

目的　研究肝癌干细胞不同亚群CD90+和ESA+细胞的生物学特性,为肝癌的治疗及预后判定提供新的思路。方法　采用活细胞流式细胞术检测肝癌细胞系MHCC97L中肝癌干细胞标志物CD90、ESA的表达情况,并分选ESA+,CD90+细胞,通过甲基纤维素成球实验、Transwell、CCK8法进行体外生物学特征研究。结果　肝癌细胞系MHCC97L中CD90+和ESA+细胞表达比例分别为2.37%和3.70%。ESA+细胞成球率明显高于ESA-细胞［成球率（35.6±2.1）% vs.（9.6±1.4）%, P<0.01］,CD90+细胞成球率明显高于CD90-细胞［成球率（29.2±1.3）% vs.（7.4±0.6）%］（P<0.01）,ESA+细胞成球率明显高于CD90+细胞且ESA+细胞sphere球体积明显大于CD90+细胞体积;ESA+细胞较ESA-细胞侵袭能力提高2.12倍［（282±15.1 vs. 133±12.4）,P<0.01］,CD90+细胞较CD90-细胞侵袭能力提高2.04倍［（231±18.1 vs. 113±10.2）,P<0.01］。CD90+细胞耐药性明显强于ESA+细胞［IC50（0.98 μg/mL vs. 0.36 μg/mL）］,ESA+细胞增殖能力明显强于CD90+细胞。结论　肝癌组织中存在不同的干细胞亚群ESA+细胞及CD90+细胞,这些亚群具有不同的生物学特性,影响肝癌的耐药、侵袭,了解肝癌中不同干细胞亚群的表达情况可用于指导临床个体化治疗。     

沉默CD133基因对CD133+肝癌干细胞放射敏感性的影响

目的 研究沉默CD133基因对人肝癌CD133+-HepG2干细胞放射敏感性的影响.方法 免疫磁珠分选HepG2细胞;流式细胞术检测分选前后CD133表达率;NOD/SCID小鼠成瘤实验验证其干性;靶向沉默CD133基因并分组(空白组、阴性感染组、阳性感染组);RT-PCR和Western blot检测各组CD133基因mRNA和蛋白表达;克隆形成实验检测各组细胞经不同剂量照射后的克隆形成率及存活率,绘制存活曲线并计算各组细胞放射生物学参数Do、Dq、N及放射增敏比(SER);流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况.结果 流式细胞术检测结果显示,分选前后CD133表达率分别为(1.36±0.20)％和(87.62±1.92)％.CD133+细胞在细胞数为1×103/ml时即可形成皮下移植瘤.RT-PCR和Western blot检测结果显示,阳性感染组CD133 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.流式细胞术检测结果显示:阳性感染组G1、S 期减少G2期增加,细胞凋亡率明显增加.克隆形成实验显示阳性感染组D0、Dq、N值与SF2均减小,放射敏感性明显增强,其SER为(1.37±0.02),差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133作为肝癌干细胞的表面标志物之一,可能成为肝癌干细胞放射治疗增敏的靶点.     

姜黄素抑制肝癌细胞HepG2增殖及干细胞标志物表达

目的:探讨姜黄素能否抑制肝癌细胞HepG2的增殖及干细胞标志物的表达。方法:不同剂量梯度的姜黄素(0、20、40和60μmol/L)作用肝癌细胞系HepG2 48 h后,MTT实验和克隆形成实验检测HepG2的增殖情况,划痕实验检测其迁移情况,成球实验检测姜黄素对HepG2干细胞的抑制情况,Real-time PCR检测姜黄素处理HepG2干细胞标志物CD133的表达情况,Western blot检测干细胞转录因子OCT4的表达情况。结果:姜黄素可抑制肝癌细胞HepG2的增殖[60μmol/L剂量时抑制率达(68.12±3.09)%],并抑制其克隆形成和迁移能力;姜黄素还可抑制HepG2的成球能力;同时可导致HepG2干细胞标志物CD133的表达降低[60μmol/L剂量时下降率达(48.36±2.04)%],并导致干细胞相关转录因子OCT4的表达降低。结论:姜黄素通过抑制肿瘤干细胞从而降低肝癌复发和转移,有望成为肝癌治疗的辅助性药物。     

人肝癌细胞系Huh-7中CD133+细胞的分离及鉴定

目的 通过表面标志分选法富集人肝癌Huh-7细胞中CD133+细胞,并初步鉴定其特性.方法 采用流式细胞分选技术从人肝癌细胞系Huh-7中分选出CD133+细胞,并进行干细胞比例分析;通过对CD133+细胞体外成球能力及增殖能力检测,考察CD133+细胞的自我更新能力;观察CD133+细胞在非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内的成瘤情况.结果 分选获得的CD133+细胞经无血清培养后阳性比例达90％以上;CD133+细胞体外无血清培养3d即可成球且生长速度较CD133-细胞快;CD133+细胞在NOD/SCID小鼠体内21 d左右即可形成异种移植瘤.结论 CD133+表面标志物分选方法可以高纯度富集CD133+细胞,利用CD133抗体分选获得的CD133+细胞具有肿瘤干细胞样特性.     

MicroRNA-544在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 明确微RNA-544(microRNA-544,miR-544)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡、克隆形成及成球能力的影响,探讨其在肝癌发生、发展中的作用.方法 利用qPCR法检测二乙基亚硝胺(DEN)造模的大鼠肝组织和人肝癌组织与癌旁组织以及成球培养后肝癌干细胞球中miR-544的表达;肝癌细胞株Hep3B转染miR-544mimic或miR-544 inhibitor后,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力,碘化丙啶(PI)染色后流式细胞仪检测细胞凋亡情况.肝癌细胞转染miR-544mimic后成球培养观察细胞形成肿瘤干细胞球能力的变化.结果 MiR544在DEN造模大鼠肝组织及人肝癌组织中的表达分别较未造模大鼠肝组织(P＜0.05)和癌旁组织(P＜0.01)下调.过表达miR-544可抑制肝癌细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01)和平板克隆形成能力(P＜0.05),并促进细胞凋亡(48 h和72 h,P＜0.01);而在肝癌细胞中抑制miR-544的作用可促进肝癌细胞的增殖(P＜0.01)和克隆形成能力(P＜0.05).在富集肝癌干细胞的成球培养中,miR-544的表达下调(P＜0.05);而过表达miR-544可抑制肝癌细胞形成干细胞球(P＜0.05).结论 MiR-544在肝癌组织中表达下调,且可抑制肝癌细胞的多种恶性生物学行为,提示其可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌作用.     

CD133+细胞的干性鉴定及131I-CD133抗体对其体内外抑制作用

目的：研究CD133+细胞的干性鉴定和131I-CD133抗体在体内外对人肝癌CD133+-HepG2干细胞的抑制作用。方法：氯胺T法制备并鉴定131I-CD133抗体;免疫磁珠（magnetic-activated cell sorting,MACS）分选CD133+-HepG2细胞;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测分选前后CD133表达率;体外克隆形成实验、成球实验和体内成瘤实验验证其干细胞特性;将分选出的CD133+细胞分组为CD133抗体、131I、131I-CD133抗体和131I+CD133抗体 4个组,MTT法检测不同处理后不同组中CD133+细胞生长抑制率;成功构建人肝癌CD133+-HepG2移植瘤模型;随机分4组,1次/2 d给予尾静脉用药,共14次。4周后,处死小鼠,比较肿瘤的体积、质量、计算抑瘤率;HE染色观察肿瘤组织病理学改变。结果：131I-CD133抗体标记率为89.34%,放化纯度为98.21%。流式显示分选前后CD133表达率分别为（1.78±0.54）%和（98.46±0.97）%。成球实验、克隆形成实验和裸鼠成瘤实验显现CD133+细胞相对于CD133-细胞更具有干细胞特性。131I-CD133抗体治疗组体外对细胞抑制率及体内抑瘤率明显高于其余各实验组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：131I-CD133抗体在体内外均能有效抑制人肝癌CD133+-HepG2细胞的生长。     

人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.     

miR-125b对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用

目的 观察miR-125b对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)成球、克隆形成、增殖、凋亡、迁移的作用,探讨miR-125b对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用.方法 获取肝癌干细胞;包装表达miR-125b的慢病毒并感染肝癌干细胞;光镜计数法检测miR-125b对肝癌干细胞成球率及克隆形成率的影响;CCK-8法检测miR-125b对肝癌干细胞增殖能力的影响;DAPI染色观察miR-125b对肝癌干细胞凋亡的影响;Transwell实验检测miR-125b对肝癌干细胞迁移能力的影响.结果 与对照组比较,miR-125b显著降低LCSCs的成球率(对照组27.7％,实验组0.0％,P＜0.01)以及抑制其克隆形成能力(对照组29％,实验组6％,P＜0.01);同时miR-125b可促进LCSCs的凋亡,抑制LCSCs的迁移能力(P＜0.01).结论 miR-125b对LCSCs的成球能力、克隆形成能力具有明显的抑制作用,表明miR-125b对LCSCs的自我更新能力具有负向调控作用.miR-125b也能抑制LCSCs的迁移,对LCSCs的凋亡具有促进作用.     

CD90+肝癌干细胞的鉴定及靶向治疗研究

目的:对人肝癌组织和细胞株BEL-7404中的CD90+细胞进行干细胞特性鉴定;制备载17-AAG的抗CD90磁性热敏脂质体(CD90@17-AAG/TMs)靶向杀伤CD90+ 肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)?方法:利用免疫组化染色检测人肝癌组织中CD90的表达,并研究其与肝癌临床病理特征的关系;利用免疫磁珠分选法从人肝癌细胞株BEL-7404中分离出CD90+ LCSCs并验证其干细胞特性;“旋转蒸发-水化法”制备CD90@17-AAG/TMs,通过体内杀伤实验验证其杀伤CD90+ LCSCs的能力?结果:CD90的表达与患者性别?年龄?肿瘤大小?甲胎蛋白(AFP)无关(P > 0.05),与病理分级有关(P < 0.05);肝癌细胞中CD90+细胞具有明显的干细胞特性;CD90@17-AAG/TMs在体内可以有效杀伤CD90+ LCSCs,抑制肝癌的生长?结论:CD90+ 细胞具有明显的干细胞特性,采用CD90@17-AAG/TMs可有效清除CD90+ LCSCs,抑制肝癌的形成及生长,为肝癌及其他恶性肿瘤的治疗提供了新的手段.     

骨髓间充质干细胞对HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞对HepG2肝癌细胞增殖的影响,并初步探讨其机制?方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其分子表面标志,体外扩增培养并收集培养上清?MTT法?平板克隆实验及软琼脂克隆实验检测大鼠间充质干细胞对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响,流式细胞术检测肝癌细胞周期的改变,Western blot法检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达情况?结果:骨髓间充质干细胞CD105和CD90表达阳性,CD34和CD45表达阴性?在骨髓间充质干细胞培养上清作用下,MTT法显示实验组肝癌细胞光密度值增加(P < 0.05),平板克隆法显示实验组肝癌细胞克隆形成率比对照组明显升高(P < 0.05),软琼脂克隆法显示实验组肝癌细胞空间克隆形成率比对照组明显升高(P < 0.05),流式细胞术显示实验组细胞周期G1期比例降低,S期?G2期比例增加?Western blot显示实验组细胞Cyclin D1表达量增加(P < 0.05)?结论:骨髓间充质干细胞可促进HepG2肝癌细胞的增殖及空间克隆形成能力,其促进肝癌细胞体外增殖可能与Cyclin D1表达上调有关?     

siRNA介导核干因子基因沉默抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 核干因子(nucleostemin, NS)是最近发现的一个GTP结合蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均有表达。NS在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用,然而其在肝癌中的作用尚未清楚。本研究通过检测其在不同肝癌细胞系和组织中的表达,并利用siRNA干扰技术,以探究NS在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。 【方法】 以肝癌组织和多种肝癌细胞系为研究对象,首先通过定量PCR及蛋白质印迹法分析细胞及肝癌组织中NS的表达。接着通过siRNA瞬时转染的方法降低NS的表达,并通过定量PCR和蛋白质印迹法检测干涉效果,利用MTT试验和细胞增长实时监控技术检测细胞增殖情况,流式细胞术探究紫外线(ultraviolet, UV)或血清饥饿诱导下细胞凋亡情况。 【结果】 蛋白质印迹及定量PCR结果显示NS在多种肝癌细胞系及肝癌组织中都有较高的表达,且在MHCC97H和Bel7402细胞中,MTT试验和细胞增长实时监控显示降低NS的表达能够抑制细胞增殖,流式细胞术和蛋白质印迹结果显示NS基因沉默能够促进UV和血清饥饿诱导的细胞凋亡。即NS可能具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 【结论】 NS在肝癌组织和细胞中都有较高的表达,在MHCC79H和Bel7402细胞中,降低NS表达可抑制细胞增殖,促进UV及血清饥饿诱导的细胞凋亡。     

苦参碱通过调控β-catenin信号通路抑制肝癌细胞干性

目的探讨苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性、细胞干性、β-catenin转录活性以及AKT/GSK3β/β-catenin信号 通路的影响。方法应用MTT法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验检测0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对 人肝癌HepG2 和Huh7 细胞的克隆形成能力,荧光定量PCR分析0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌 HepG2 和Huh7 细胞干性基因CD90、EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CD133 mRNA的表达水平,双荧光素酶报告基因检测 0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌HepG2 和Huh7 细胞内β-catenin 转录活性,Western blotting 检测 0 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞内AKT（蛋白激酶B）、GSK-3β和β-catenin及其相应磷酸化 蛋白的表达水平。结果MTT实验结果显示,苦参碱呈时间-浓度依赖性地抑制肝癌HepG2 和Huh7 细胞的增殖,处理24、 48、72 h 对HepG2 细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565、909.1 μg/mL,对Huh7 细胞的半数抑制浓度依次为1355、781.8、 612.8 μg/mL。苦参碱浓度依赖性地抑制肝癌细胞的克隆形成能力,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞的 克隆形成能力（P<0.01,P<0.001）,200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞的克隆形成能力（P<0.05,P<0.01, P<0.001）。苦参碱能够显著肝癌细胞内CD90、EpCAM和CD133 等干细胞标志物mRNA的表达,其中400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱能够显著抑制HepG2细胞中CD90（P<0.01,P<0.001）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01,P<0.01）mRNA的表 达,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞中CD90（P<0.01,P<0.01）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01, P<0.01）mRNA的表达。同时400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱显著抑制HepG2细胞（P<0.001,P<0.001）和Huh7细胞（P<0.01,P<0.001） 内β-catenin的转录活性。研究结果显示400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著降低HepG2和Huh7细胞内β-catenin和磷酸化 的AKT和GSK-3β蛋白水平,增加β-catenin的磷酸化水平。结论苦参碱可抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、克隆形成以及 肝癌干性基因CD90、EpCAM和CD133的表达,其机制可能与抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路,从而降低β-catenin的转录 活性有关。     

二甲双胍通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对胃癌干细胞增殖和凋亡的研究

目的:探讨二甲双胍通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对胃癌干细胞增殖和凋亡的影响.方法:常规培养胃癌MKN-45细胞,并分选其干细胞,采用免疫荧光法观察分选前后MKN-45细胞中CD44+表达情况,通过流式细胞术检测分选前、后MKN-45细胞中CD44+比例,并通过免疫印迹法检测悬浮MKN-45肿瘤细胞球和贴壁细胞中性别决定区Y框蛋白2(SOX2)、八聚体结合转录因子4(OCT4)、同源域蛋白(Nanog)的蛋白表达.采用不同剂量二甲双胍(0,1,5,10 mmol/L)处理MKN-45干细胞24～72 h,RT-qPCR检测MKN-45干细胞Wnt/β-catenin信号通路基因表达情况,CCK-8法检测各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况.结果:与胃癌干细胞分选前相比,分选后CD44+比例在MKN-45细胞中由5.70％富集至89.32％;悬浮MKN-45肿瘤细胞球中肿瘤干细胞标志物SOX2、OCT4、Nanog蛋白高于贴壁细胞(P<0.05),提示胃癌干细胞分离成功.随着二甲双胍剂量的增加及处理时间的延长,MKN-45干细胞增殖活性、β-连环蛋白(β-catenin)呈下调趋势,其细胞凋亡率、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)呈上调趋势(P<0.05).结论:随着二甲双胍浓度增加及作用时间延长,胃癌干细胞增殖活性增强,凋亡率降低,其作用原因可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关.     

肾癌干细胞的培养鉴定及其凋亡的实验研究

目的探讨肾癌干细胞在肾癌的发生发展中的作用。方法收集肾癌细胞检测其CD133表达情况,并研究其凋亡特性;然后将其悬浮于含有表皮生长因子(EGF)和成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养基中培养7d,收集干细胞球,同时收集利用含10%胎牛血清培养基培养的肾癌细胞作阴性对照,分别检测其CD133表达情况,并研究其凋亡特性。结果悬浮培养2d后出现肾癌干细胞球,培养7d后干细胞球明显增多,收集干细胞球,用流式细胞仪检测发现表达CD133+细胞约占(8.25±1.43)%,阴性对照中CD133+细胞只占(1.22±0.34)%,并且较前者具有较高的凋亡率。结论利用无血清体外培养并收集悬浮生长的肾癌细胞的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞;肾癌干细胞较一般瘤组织有较低的凋亡率,维持着肿瘤的无限增殖。