FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响研究

目的研究FOXO3a蛋白对脑缺血损伤大鼠细胞自噬的影响。方法选取20只Wistar大鼠,经过1周饲养时间后,随机分为正常组和脑缺血组,其中正常组10只,脑缺血组10只,采用四动脉结扎法构建脑缺血模型。采用免疫组化法检测FOXO3a蛋白、Bax蛋白及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平,采用双盲法测定神经功能评分,采用Western Blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3细胞自噬功能的改变,用倒置荧光显微镜观察细胞自噬现象的产生。结果脑缺血组大鼠FOXO3a蛋白表达高于正常组(P0.05);脑缺血组大鼠Bax蛋白表达高于正常组,Bcl-2蛋白表达低于正常组(P0.05);脑缺血组大鼠神经功能评分高于正常组(P0.05);脑缺血组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3及细胞自噬率高于正常组,均具有统计学意义(P0.05)。结论 FOXO3a蛋白在大鼠脑缺血损伤中高表达,Bax蛋白在大鼠脑缺血损伤中高表达,Bcl-2蛋白在大鼠脑缺血损伤中低表达,对细胞自噬具有诱导作用。     

Wnt/β-catenin信号通路通过下调自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤

目的观察Wnt/β-catenin信号通路通过调控大鼠皮层神经元细胞自噬水平对脑缺血再灌注(CIR)损伤的影响。方法将56只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、CIR组、Wnt/β-catenin激动剂氯化锂(Li Cl)处理组(Li Cl+CIR组)、生理盐水(NS)处理组(NS+CIR组),每组14只。采用大脑中动脉线栓阻塞法建立大鼠CIR损伤模型,缺血2 h后再灌注24 h。采用Garcia神经功能缺陷评分评估各组大鼠神经行为学改变;氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积;Western blot测定大鼠皮层β-catenin、LC3-Ⅱ及P62蛋白表达。结果再灌注24 h后,与Sham组相比,CIR组神经行为学评分升高,脑梗死体积增加,皮层β-catenin表达降低,LC3-Ⅱ表达升高,P62蛋白表达水平下降(P0.05);与CIR组相比,Li Cl+CIR组神经行为学评分降低,脑梗死体积减少,皮层β-catenin表达增加,LC3-Ⅱ表达降低,P62蛋白表达水平增加(P0.05)。结论 Wnt/β-catenin信号通路通过调控自噬改善大鼠CIR的神经损伤。     

p38抑制剂对蛛网膜下腔出血大鼠神经元的保护作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶p38抑制剂对蛛网膜下腔出血(SAH)后神经功能的保护作用及其机制。方法取SPF级成年雄性SD大鼠27只,选用视交叉前池注血法制作SAH模型,剔除3只死亡大鼠,采用随机数字表法将24只大鼠分为假手术组、SAH组、二甲基亚砜(DMSO)组、DMSO+p38抑制剂组,每组6只。采用Western blot分别检测p38、磷酸化p38、帕金森病蛋白7(DJ-1)、自噬相关基因5(Atg5)、自噬接头蛋白p62、微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达,并用Garcia神经功能评分标准判断神经损伤。PC12细胞加氧合血红蛋白建立体外SAH模型,完全随机分为假手术组、SAH组、DMSO组及DMSO+p38抑制剂组,利用荧光探针JC-1观察线粒体膜电位的变化。结果 (1)4组大鼠p38、磷酸化p38和DJ-1蛋白表达的差异均有统计学意义(F值分别为94.959、150.293和698.476,均P0.01)。4组PC12细胞线粒体膜电位的差异均有统计学意义(F值为24.989,P0.01)。4组大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Atg5和p62表达的差异均有统计学意义(F值分别为235.319、110.490和36.311,均P0.01)。4组大鼠神经功能评分的差异有统计学意义(F值25.550,P0.01)。(2)与假手术组比较,SAH后p38、磷酸化p38和DJ-1蛋白表达均显著上调(分别为0.43±0.06、0.41±0.02和0.07±0.01上升至0.61±0.08、0.79±0.07和0.17±0.03,均P0.01),线粒体膜电位去极化(8.29±0.28上升至9.23±0.42,P0.01);Atg5蛋白表达上调及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高(分别为0.23±0.04和0.25±0.04上升至0.47±0.04和0.46±0.04,均P0.01),p62蛋白表达下调(1.09±0.14下降至0.54±0.10,P0.01);神经功能评分降低[(17.5±0.6)分降至(11.3±2.7)分,P0.01]。p38抑制剂显著下调SAH后磷酸化p38蛋白表达(0.79±0.07降至0.47±0.04,P0.01),上调DJ-1蛋白表达(0.17±0.03上升至1.02±0.06,P0.01),线粒体膜电位恢复(9.23±0.42降低至8.47±0.36,P0.01),细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Atg5表达上调(分别为0.46±0.04、0.47±0.04上调为0.77±0.06、0.95±0.12,均P0.01),P62表达变为SAH水平(0.57±0.09变为0.54±0.10,P=0.650),神经功能评分得到显著升高[(11.3±2.7)分上升至(15.5±1.0)分,P0.01)]。结论 SAH后,p38抑制剂下调磷酸化p38活性后可能通过上调DJ-1蛋白表达,抑制异常自噬,维持线粒体功能,进而发挥神经保护功能。     

氧化型低密度脂蛋白通过Akt/mTOR/p70S6K通路诱导血管内皮细胞自噬

目的 探讨氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)自噬和Akt/mTOR/p70S6K信号通路的影响.方法 将培养的HUVECs分为oxLDL组和对照组,分别用100 μg/ml oxLDL和等体积磷酸盐缓冲液处理.在培养6 h和12 h后收集细胞.应用透射电子显微镜观察自噬小体,实时荧光定量聚合酶链反应检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)和p62 mRNA表达,应用蛋白质印迹法检测LC3、p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K蛋白表达.结果 与对照组相比,oxLDL处理组细胞内的自噬小体数量明显增多(P<0.05),LC3 mRNA及蛋白表达水平均显著增高(P均<0.05),而p62 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P均<0.05).此外,oxLDL处理组Akt、mTOR、p70S6K磷酸化蛋白表达水平均较对照组显著降低(P均<0.01),但Akt、mTOR和p70S6K总蛋白表达水平与对照组无显著差异.结论 oxLDL可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导HUVECs自噬.     

P62通过调控自噬与抗氧化通路保护大鼠脑缺血再灌注损伤

目的探讨大鼠脑缺血再灌注后P62介导的微管结合蛋白轻链3(LC3)和Kelch样ECH相关蛋白1(kelchlike ECH-associated protein 1,Keap1)表达的变化。方法将80只SD大鼠随机分为假手术组和模型组(采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型),每组40只,分别于12h,1、2和3d取材,每个时间点10只。采用化学荧光法测定脑组织活性氧水平,透射电子显微镜观察神经细胞中自噬及凋亡形态结构变化,分别采用qRT-PCR和Western blot法观察P62和LC3和Keap1 mRNA和蛋白在缺血半暗带表达变化。结果与假手术组比较,模型组大鼠各时间点脑组织中活性氧水平显著升高,1d时达峰值[(238.23±25.51)%vs (134.60±12.48)%,P0.01];透射电子显微镜下,模型组大鼠神经细胞线粒体肿胀,可见不同程度自噬小体形成,细胞发生迟发性神经元死亡。与假手术组比较,模型组各时间点P62mRNA和蛋白表达明显下调,1d达最低值(1.915±0.711 vs 1.253±0.679;0.10±0.02 vs 0.16±0.04,P0.01);各时间点LC3、Keap1mRNA和蛋白表达显著升高,1d达到最高值(0.862±0.501 vs 1.450±0.245,1.125±0.421 vs 2.037±0.730;1.25±0.17 vs 0.36±0.07,1.35±0.14 vs 0.24±0.05,P0.05,P0.01)。结论大鼠脑缺血再灌注损伤后LC3和Keap1表达水平增加,而P62表达减少,诱导了细胞自噬和氧化应激的发生。     

自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌组织中的表达及临床意义.方法:应用免疫组织化学法检测64例胰腺癌组织及相应癌旁正常组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达情况;分析自噬蛋白表达水平与胰腺癌临床病理特征的关系.结果:免疫组织化学法检测提示Beclin1蛋白在胰腺癌组织及癌旁正常组织中阳性表达率分别为28.1%(18/64)、90.6%(58/64),LC3蛋白阳性表达率分别为34.4%(22/64)、75%(48/64)P 6 2蛋白表达阳性率分别为7 5%(4 8/6 4)、4 6.9%(3 0/6 4),均P0.0 5;胰腺癌组织中Beclin1与LC3的表达水平呈正相关(r=0.572P0.05),Beclin1、LC3的表达与肿瘤分化、TNM分期相关(P0.05),Beclin1、LC3和P62的表达均与性别、年龄、有无门脉浸润、淋巴结转移无明显相关(P0.05).结论:自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在胰腺癌组织中的异常表达及Beclin 1与LC3两者表达呈正相关提示自噬活动下降可能参与了进展期胰腺癌的发展.     

线粒体自噬在糖尿病肾病肾组织巨噬细胞表型转化中的作用

目的:探讨糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织线粒体自噬特征与巨噬细胞M1/M2表型的相关性及在其分化中的作用。方法:建立DN大鼠模型分别于8周、12周、18周、24周末处死,病理染色观察肾脏病理改变,电镜观察肾组织线粒体形态数量和线粒体自噬。Western Blot检测肾组织巨噬细胞及线粒体自噬相关蛋白标志物表达。体外培养RAW264.7细胞,Western Blot和免疫荧光共聚焦比较自噬体生成抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬体生成激活剂雷帕霉素干预前后,巨噬细胞表型标志物和线粒体自噬相关指标的变化。结果:体内实验(1)从12周起,随着时间延长DN大鼠肾组织巨噬细胞浸润M1型增多,并且存在线粒体自噬障碍,表现为iNOS升高,LC3蛋白逐渐降低,p62升高;(2)相关性分析显示,iNOS与LC3成负相关(r=-0.617,P0.05),而与p62成正相关(r=0.894,P0.05);(3)电镜结果显示DN大鼠肾组织线粒体肿胀、线粒体嵴消失或降低,且存在线粒体自噬障碍。(4)免疫荧光共聚焦结果显示,DN大鼠肾组织线粒体标记蛋白VDAC和LC3较对照组均降低,共定位表达减少。体外实验(1)高糖干预后,Western Blot结果显示RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α、iNOS随着时间延长逐渐升高,同时LC3、Beclin-1表达显著降低,p62明显升高,VDAC逐渐降低。(2)3-MA抑制自噬体生成能促进高糖诱导的巨噬细胞进一步向M1型巨噬细胞转化;(3)雷帕霉素激活自噬体生成能降低高糖诱导的M1型巨噬细胞活化。结论:线粒体自噬可能参与DN大鼠肾组织巨噬细胞M1/M2表型转化。     

外源性睾酮通过诱导自噬致大鼠肾脏损伤

目的 探索外源性睾酮(TP)致大鼠肾脏损伤的作用及可能机制.方法 SD雄性大鼠48只,随机分为6组(每组8只):control组、TP组、TP+氯喹(CQ)组、TP+甘草甜素(Gly)组、CQ(自噬抑制剂)组、Gly〔高迁移率族蛋白(HMG)B1抑制剂〕组.各组大鼠处理21 d后,测量其体重、肾脏湿重、计算肾脏指数;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法和Western印迹印迹法分析大鼠肾脏组织自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1、P62、HMGB1的定位和表达情况.结果 与control组比较,TP组大鼠肾脏湿重、肾脏指数无明显变化(P>0.05);肾小球毛细血管襻多呈分叶状改变,肾小囊间隙变窄,肾小管上皮细胞水肿,管腔变窄;肾脏组织LC3B-Ⅱ、Beclin1和HMGB1蛋白表达水平上调(P<0.05),联合给予TP与CQ后,仅见少数肾小体血管球呈分叶状改变,肾小管水肿明显减轻;Beclin1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达水平均下调(P<0.05);TP+Gly组大鼠肾脏组织病理学改变及自噬相关蛋白表达水平结果 与TP+CQ组类似.结论 外源性TP可能通过上调细胞自噬致大鼠肾脏组织损伤的发生,HMGB1可能参与此过程自噬水平的调节.     

姜黄素激活自噬对非酒精性脂肪性肝病大鼠线粒体途径凋亡的影响

目的探讨姜黄素对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠的治疗作用及机制。方法油红O染色观察各组大鼠肝内细胞脂滴分布,透射电镜观察肝组织中自噬泡形成情况。蛋白印迹检测P62、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬相关蛋白(Beclin-1)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、相关x蛋白(Bax)、线粒体内细胞色素C(mCytc)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3、Caspase-9)标记蛋白的表达水平。结果与正常对照组比较,肝组织脂质沉积在模型组中明显增加;姜黄素明显抑制模型组大鼠肝组织脂质沉积,自噬抑制剂削弱姜黄素的治疗作用;透射电镜观察发现正常对照组可见散在自噬泡,模型组自噬泡数量显著减少,姜黄素可明显增加自噬体数量。蛋白印迹结果提示,模型组大鼠肝组织中Bax、Caspase-3、Caspase-9、P62蛋白表达均升高,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低;经姜黄素治疗后肝组织中Bax、P62、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达均降低,而mCytc、Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高;自噬抑制剂可以部分抑制姜黄素对自噬和凋亡相关蛋白的影响。结论姜黄素对NAFLD大鼠模型的抗凋亡作用与诱导自噬有关。     

糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用

目的观察糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用,探讨雷帕霉素是否通过调节自噬、内质网应激和细胞凋亡对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。方法雄性SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组和雷帕霉素干预组。采用链脲佐菌素制备1型糖尿病大鼠模型。雷帕霉素干预组给予雷帕霉素2mg/(kg·d)灌胃。于实验第8周留取血标本,用于血生物化学指标和脂联素水平检测,然后处死动物并迅速取出胸主动脉和腹主动脉,测定主动脉Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血清脂联素水平显著降低(P0.05),主动脉壁增厚,内皮严重受损,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2mRNA表达水平显著降低(P 0. 05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著升高(P0.05)。与糖尿病组比较,雷帕霉素干预组大鼠血清脂联素水平显著升高(P0.05),主动脉组织病理改变显著减轻,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著降低(P0.05)。结论糖尿病大鼠主动脉组织自噬水平降低,雷帕霉素可能通过激活自噬和减轻内质网应激和细胞凋亡水平对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。     

Apelin-13对高血压性肾纤维化的影响及机制研究

目的探讨血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(APJ)激动剂Apelin-13对高血压性肾纤维化的影响及其机制。方法 12周龄雄性自发性高血压大鼠随机分为对照组、1μg/(kg·d)Apelin-13组、10μg/(kg·d)Apelin-13组、100μg/(kg·d)Apelin-13组;Apelin-13通过尾静脉给药。测量大鼠24 h尿蛋白量、血清肌酐和尿素氮浓度。采用套尾法测量尾动脉收缩压,HE染色和Masson染色观察大鼠肾脏组织学改变,Western blot检测肾脏组织中自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1和p62的表达。结果与对照组比较,10μg/(kg·d)Apelin-13组、100μg/(kg·d)Apelin-13组以剂量依赖方式降低大鼠收缩压、24 h尿蛋白量、血清肌酐和尿素氮水平、肾脏损伤评分和胶原容积分数(均P0.05),减轻肾小管上皮细胞水肿,减少间质胶原沉积,降低肾间质纤维化程度。10μg/(kg·d)Apelin-13组、100μg/(kg·d)Apelin-13组也以剂量依赖方式增加大鼠肾脏组织中LC3-Ⅱ表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达,降低p62表达(均P0.05)。结论 Apelin-13抑制高血压性肾纤维化的进展,其机制可能与Apelin-13抑制细胞自噬有关。     

小檗碱抑制内质网应激炎症通路对2型糖尿病大鼠局部脑缺血再灌注损伤的探讨

目的观察小檗碱(BBR)对2型糖尿病大鼠局部脑缺血再灌注损伤半影区内质网应激相关炎症通路的影响。方法72只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,采用高脂饮食和链尿佐菌素注射建立2型糖尿病大鼠模型,数字抽签随机将糖尿病大鼠分为假手术组(Sham组)、糖尿病大鼠+BBR治疗组(BBR组)、糖尿病大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型组(MCAO组)、糖尿病大鼠MCAO+BBR治疗组(MCAO+BBR组),纳入研究每组6只。治疗组在术前48 h、24 h和术后6 h经胃灌注给予相应剂量药物。采用线拴法制备大鼠MCAO模型,进行神经缺损评分,酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β的表达;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测内质网应激标志蛋白葡萄糖调控蛋白78(GRP78)的mRNA表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测内质网应激相关炎症通路蛋白GRP78、胰腺内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、核因子(NF)-κB p65表达情况。结果在脑缺血半影区,缺血2 h再灌注24 h后,MCAO组大鼠神经功能缺损评分(2.83±0.41)分,高于MCAO+BBR组大鼠(1.67±0.52)分(P<0.05),促炎因子TNF-α和IL-1β和内质网应激相关炎症通路蛋白GRP78、PERK和NF-κB p65的表达水平亦增高(P<0.05)。BBR治疗亦可降低脑缺血再灌注半影区促炎因子(TNF-α和IL-1β)和内质网应激相关炎症通路蛋白(GRP78、PERK和NF-κB p65)的表达水平。结论BBR可通过抑制内质网应激相关炎症通路降低2型糖尿病大鼠局部脑缺血再灌注损伤的炎症反应,发挥神经保护作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后GDNF mRNA及其蛋白表达的变化

目的 观察大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带皮质脑源性神经营养因子(GDNF) mRNA和蛋白的表达变化.方法 采用线栓法制作局灶性脑缺血大鼠(MCAO)模型,用原位杂交法和免疫组化法观察脑缺血后3、6、12 h及l、3、7d共6个时间点GDNFmRNA及其蛋白的表达变化.结果 缺血半暗带GDNFmRNA及其蛋白的表达均于缺血灌注后3h开始明显上升,6h达高峰,12 h表达开始减弱(P＜0.05或P＜0.01),3-d后降至正常水平.结论 脑缺血再灌注后缺血半暗带GDNFmRNA及蛋白表达均明显增加可能参与了脑缺血后神经保护.     

羟基红花黄素A对缺血性心力衰竭大鼠心肌自噬及ERK1/2通路的影响

目的:探讨羟基红花黄素A(HSYA)对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠心肌自噬及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路的影响。方法:将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(卡托普利组)、低剂量HSYA组(L-HSYA)、中剂量HSYA组(M-HSYA)、高剂量HSYA组(H-HSYA),每组12只。采用冠脉结扎法建立缺血性心力衰竭大鼠模型。超声仪检测大鼠左心室心功能水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清N-末端脑钠肽前体(NTpro BNP)和超敏肌钙蛋白(hs-TnT)水平,透射电镜观察心肌细胞自噬,Western blot法检测心肌组织自噬相关因子微管相关蛋白1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、泛素和LC3结合蛋白p62(p62)、ERK1/2蛋白表达。结果:与模型组比较,阳性对照组、M-HSYA和H-HSYA组大鼠左室收缩末期室间隔厚度(LVSs)、左室舒张末期室间隔厚度(LVSd)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)、左心室射血分数(LVEF)及LHSYA组LVSd显著升高(均P 0. 05);心电图T波幅度和ST段抬高幅度显著降低,QT间期显著缩短(均P 0. 05);大鼠血清NT-proBNP和hs-TnT水平显著降低(均P 0. 05),心肌细胞自噬小体数量减少,自噬率显著降低(P 0. 05);心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达显著降低(均P 0. 05),p62和p-ERK1/2蛋白表达显著升高(均P 0. 05)。结论:IHF大鼠心肌损伤与自噬关系密切,HSYA可能通过激活ERK1/2信号通路抑制IHF大鼠心肌细胞自噬。     

外源性雄激素通过诱导自噬促大鼠睾丸萎缩

目的探讨外源性雄激素对大鼠睾丸萎缩的影响及其可能机制。方法 48只SD雄性大鼠随机分成6组,每组8只:对照组(control)、雄激素(丙酸睾丸酮,TP)组、雄激素+氯喹(TP+CQ)组、雄激素+甘草甜素(TP+Gly)组、氯喹(CQ,自噬抑制剂)组、甘草甜素〔Gly,高迁移率族蛋白(HMGB) 1抑制剂〕组。各组分别处理21 d后,测量体重、睾丸湿重、睾丸指数;采用HE染色法观察睾丸组织病理学改变; Western印迹法大鼠睾丸组织Beclin-1、LC3B-Ⅱ、p62、HMGB1蛋白表达情况。结果给予大鼠TP干预21 d后,大鼠睾丸湿重、睾丸指数均显著降低(P<0. 01);睾丸生精小管发生萎缩,各级生精细胞排列紊乱、层数减少,未见成熟的精子;睾丸组织Beclin-1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达均显著上调(P<0. 05),p62蛋白表达无明显变化(P>0. 05)。联合给予TP和CQ后,大鼠睾丸指数显著增加(P<0. 05);生精小管和各级生精细胞损伤明显改善,可见到成熟的精子;睾丸组织Beclin-1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达水平均显著下调(P<0. 05),p62蛋白表达仍无明显变化(P>0. 05)。联合给予TP和Gly后,各观测指标变化与联合给予TP和CQ后结果类似,且两组各指标均无明显差异(P>0. 05)。结论外源性雄激素可能通过上调自噬水平引发大鼠睾丸萎缩病理过程发生,此过程中HMGB1可能调节自噬水平改变。     

缺血预处理对大鼠缺血脑组织p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表达的影响

目的研究p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白在大鼠脑缺血再灌注脑梗死组织中表达的变化。方法取SPF级SD健康雄性大鼠随机分为模型组、缺血预处理组和假手术组;按照观察时间点各组又分为6 h、12 h、24 h、48 h、72 h亚组。缺血预处理组大鼠,预先给予右侧颈内动脉阻断血流10 min 1次。3 d后,采用大脑中动脉线栓法,建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型;模型组用大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注模型;假手术组大鼠仅需分离右侧颈总动脉。在术后各个观察时间点评估各组大鼠的神经功能缺损评分,TTC法检测脑梗死体积,免疫组化法测定梗死脑组织p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白水平的表达,TUNEL法检测神经元的凋亡。结果假手术组大鼠无神经功能缺损及脑梗死;缺血预处理组大鼠神经功能行为评分及脑梗死体积显著小于模型组(P0.05);同一时间点的各组间比较:p-p38MAPK、Fas、FasL的表达及神经元凋亡细胞数,模型组显著高于预处理组且两者均显著高于假手术组(P0.05)。结论脑缺血再灌注损伤可以促进p38MAPK的磷酸化,上调Fas、FasL蛋白水平的表达,激活它们所在的信号通路引起神经元的凋亡。脑缺血预处理可抑制p38MAPK的磷酸化,下调p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白的表达水平,抑制神经元的凋亡;抑制p38MAPK的磷酸化及Fas、FasL凋亡通路的激活可能是脑缺血预处理产生脑缺血耐受的机制之一。     

局灶性脑缺血预处理大鼠星形胶质细胞GFAP表达的变化

目的观察GFAP在大鼠局灶脑缺血和局灶脑缺血预处理(IPC)中的表达水平。方法线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,将大鼠分为正常组、MCAO组、IPC+MCAO组,按缺血时间不同各组又分为3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d组,观察1 d时间点大鼠神经功能、梗死体积,观察不同时间星形胶质细胞变化及其标志物GFAP表达水平。结果 101 min IPC可使大鼠神经功能增加并减少梗死体积,MCAO和IPC+MCAO后星形胶质细胞标志物GFAP表达随缺血时间延长阳性表达增多,10 min IPC随缺血时间延长,星形胶质细胞阳性细胞数增多,在缺血1 d、3 d、7 d明显增加,与MCAO相比差异显著。结论 IPC可能通过激活星形胶质细胞产生缺血耐受作用。     

动力相关蛋白1通过诱导线粒体自噬对高糖导致心肌细胞损伤的影响

目的明确动力相关蛋白(Drp)1通过诱导线粒体自噬对高糖条件下心肌细胞起保护作用。方法以Lac Z空病毒(LV-Lac Z)或Drp1过表达腺病毒(LV-Drp1)转染大鼠原代心肌细胞24 h,再用含葡萄糖(5.5 mmol/L)的正常培养基(NG)或含葡萄糖(33 mmol/L)的高糖培养基(HG)处理大鼠心肌细胞72 h。实验分组:1:(1)阴性对照(NG+Lac Z)组;(2)正常Drp1过表达(NG+Drp1)组;(3)高糖阴性对照(HG+Lac Z)组;(4)高糖Drp1过表达(HG+Drp1)组。采用免疫荧光法检测自噬体数量,用JC-1染色法检测线粒体膜电位水平,采用Western blot法检测Drp1、Parkin(一种E3泛素化连接酶),微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62蛋白表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果与对照组相比,高糖处理组自噬体数量明显减少(P0.05),线粒体膜电位显著下降(P0.05),线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Parkin水平下调(P0.05),Drp1,P62表达水平显著增高(P0.05),心肌细胞凋亡率升高(P0.05);与高糖组比较,Drp1过表达组可显著增加自噬体数量(P0.05),线粒体膜电位上升(P0.05),Drp1,Parkin,LC3-Ⅱ表达水平显著上升(P0.05),P62水平显著下降(P0.05),心肌细胞凋亡率下降(P0.05)。结论高糖可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬水平降低和线粒体功能障碍,是糖尿病心肌病发病机制之一。Drp1通过提高线粒体自噬水平改善线粒体功能,降低高糖条件下心肌细胞凋亡率。     

苯并(a)芘通过降低突触融合蛋白17和溶酶体关联膜蛋白2表达阻抑人脐静脉内皮细胞自噬流

目的 研究苯并(a)芘(BaP)影响人脐静脉内皮细胞(HUVEC)自噬的机制。方法 HUVEC经BaP(2.5、5、10 μmol/L)处理24 h后,分别采用间接免疫荧光法、Western blot、吖啶橙染色和单丹磺酰尸胺染色等技术方法,检测自噬体及其内容物降解、目标蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、选择性自噬接头蛋白p62、Beclin-1、自噬相关蛋白5(Atg5)、Atg7、Atg12、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶D(CTSD)、突触融合蛋白17(STX17)、溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)表达、溶酶体数量与功能,及相关上游关键调控蛋白丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、转录因子EB(TFEB)磷酸化水平。结果 BaP暴露组HUVEC内,检测结果显示:(1)LC3 puncta水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率增加,自噬起始关键蛋白(Beclin-1、Atg5、Atg7、Atg12)表达升高,Akt蛋白磷酸化则明显降低;(2)p62 puncta和p62蛋白水平明显升高;(3)溶酶体数量增加,并伴随着溶酶体特征性水解酶(CTSB、CTSD)表达升高,相应地ERK、TFEB磷酸化水平增加;(4)调控自噬体与溶酶体融合的关键蛋白STX17与LAMP2降低。结论 BaP通过降低STX17与LAMP2表达水平,阻抑了HUVEC正常的自噬流。     

miR-145-5p对肾缺血/再灌注损伤大鼠的肾脏保护作用及其机制

目的 观察miR-145-5p对肾缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠肾损伤的影响,并探讨其肾脏保护作用是否与通过蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)信号通路而调控自噬水平有关。方法 将40只SD大鼠随机分成Sham组、I/R组、I/R+agomir组、I/R+agomir+LY组,每组10只;除Sham组外均建立肾I/R模型,I/R+agomir组和I/R+agomir+LY组在建模操作前3 d经尾静脉注射miR-145-5p agomir 10 nmol/L,I/R+agomir+LY组同时腹腔注射AKT特异性抑制剂TLY294002 50 mg/kg,Sham组和I/R组经尾静脉注射等量PBS溶液。各组分组处理2 d,比较血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平及肾组织损伤评分,肾组织miR-145-5p表达,肾组织细胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2表达,肾组织自噬相关蛋白LC3B荧光表达强度、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、肌球蛋白样Bcl-2结合蛋白(Beclin1)、自噬相关蛋白5(Atg5)表达,肾组织AKT/mTOR通路相关蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/...