脱钙骨基质的制备及与软骨细胞体外复合的实验研究

目的：探寻良好的软骨组织工程支架材料。方法：制备兔脱钙骨基质（decalcified bone matrix,DBM）,采用液体置换法检测经脱钙2、3、4 d支架材料的孔隙率。扫描电镜观察DBM的超微结构,以及软骨细胞与DBM体外复合培养3 d的黏附情况。结果：脱钙3 d的DBM多孔结构及空隙适合软骨细胞的黏附和增殖。软骨细胞和DBM体外培养3 d黏附良好。结论：DBM是良好的软骨组织工程支架材料。     

CPPf/PLLA支架负载人半月板纤维软骨细胞的体外实验研究

目的探讨聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPPf／PLLA）支架负载人半月板纤维软骨细胞的有效性和可行性。方法将人半月板纤维软骨细胞接种CPPf／PLIA支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察纤维软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）及Ⅰ型胶原免疫组化染色观察纤维软骨组织形成情况。结果纤维软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的纤维软骨组织。结论CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为负载人纤维软骨细胞的载体。     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.     

菌丝负载软骨细胞的体外培养

目的　研究丝状真菌菌丝作为软骨细胞体外培养载体的可行性。方法　菌丝经特殊培养和处理后 ,与软骨细胞进行复合培养 ,相差倒置显微镜和扫描电镜观察软骨细胞在菌丝载体中生长情况。结果　菌丝体表面滴加软骨细胞悬液后 ,软骨细胞缓慢下沉并进入松散的菌丝体网眼内。生长在菌丝体网眼内的软骨细胞分裂、增殖良好 ,呈圆球状黏附在一起 ,并有大量蜘蛛网样基质分布在菌网丝眼内。培养时间越长 ,菌丝体网眼内软骨细胞数就越多 ,菌丝渐渐被大量软骨细胞包埋。结论　菌丝是软骨细胞体外培养的良好载体     

软骨细胞培养支架的研究进展

软骨细胞培养支架的选择是组织工程技术研究的焦点之一，软骨细胞支架在软骨细胞的 附，聚集，生长，分化和增殖中起着重要的作用，选择良好的软骨细胞２支架有利于软骨缺损的修复。     

猪耳廓软骨细胞体外培养

目的 为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法 用消化组织块培养法体外培养猪耳廓软骨细胞。结果 软骨细胞在ＰＨ值为７．２０,含１０％胎牛血清的Ｆ１２培养基中生长良好,可传代４～５代,细胞数目扩增为原来的１０～２０倍。结论 消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以扩增软骨细胞数目的确实可行的方法。     

骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究

目的 观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点，初步评价这一凝胶基质作为软骨组织构建材料的生物学性能。方法 将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养，行大体，倒置显微镜以及组织学，Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察。结果 骺板软骨细胞－生物凝胶复合的，在体外培养过程中不能春初始外形，培养1周直径可收缩为初始的45％，但能保持种子细胞的稳定均发布。经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织，表面为由1－3层梭形细胞组成的膜样结构，内部细胞主要为圆形细胞，有细胞外基质相隔，形成软骨细胞陷窝。基质中富含软骨特异性基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，而Ⅰ型胶原免疫组化逐渐转为弱阳性，位于表面膜结构。结论 这一生物凝胶具有良好的细胞相容性，适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨，但难以维持其初始外形。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的：研究软骨组织工程中传软软骨细胞与原代的差异，方法：用5个月人胎关节软骨分离培养细胞，观察细胞存活率，贴壁率，生长曲线和组织形态学的改变。结果：（1）软骨块在4℃下，3天内细胞存活率可达93．4％－97．6％。（2）原代细胞为圆形或三角形；第4代有一半转变成梭形，到第6代全部变为长梭形。（3）传代细胞贴壁时间（2－3h)短于原代（4－7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78．7％－85．5％，原代8．8％。（4）生长曲线表明，从原代到第4代都有高增殖力；到第8代时增殖降低；到第12代几乎丧失细胞增殖。结论：软骨块4度冷藏，3天内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞壁壁快，增殖 ，适于作为组织工程用细胞，第8代以后不适合。     

永生化软骨细胞体内软骨形成的实验研究

目的　探讨以永生化软骨细胞作为种子细胞构建和形成软骨的可能性。方法　把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)导入兔髁状突软骨细胞 ,G418筛选 ,挑选阳性克隆扩增培养 ;实验组将扩增培养的转染细胞与细胞支架材料 β 磷酸三钙 ( β TCP)复合 ,对照组将正常软骨细胞与 β TCP复合或单纯 β TCP在体外培育后种植于裸鼠皮下 ,3和 6个月取材进行组织学和免疫化学检测 ,并与对照 1组和对照 2组进行比较。结果　实验组和对照 1组可见复合体包裹软骨样组织 ,对照 2组有少量纤维样组织形成。免疫组化染色显示 ,实验组番红“O”、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色呈强阳性 ,有明显软骨组织形成 ,与对照组有显著性差异 (P <0 0 1) ,对照 1组染色呈弱阳性 ,对照 2组则为阴性。结论　永生化软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞 ,具有较好的软骨形成能力     

Biocompatibility studies on fibrin glue cultured with bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Summary By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin gluein vitro, the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4–6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchymal stem cells in bone tissue engineering. FANG Huang, male, born in 1962, Associate Professor     

兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养

目的：研究关节软骨细胞在纤维蛋白胶中三维培养时的表现。方法：（１）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（２）在纤维蛋白胶凝成的纤维蛋白中立体培养关节软骨细胞,观察其表现并测定生长曲线、倍增时间;（３）通过透射电镜、ＡＢ－ＰＡＳ染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等,了解细胞生长及软骨基质的分泌情况。结果：（１）关节软骨细胞在纤维蛋白中大部分保持卵圆形、小部分如贴壁细胞状;（２）细胞倍增     

医用生物蛋白胶在颌骨囊肿手术中的应用

目的:现察医用生物蛋白胶在颌骨囊肿手术中止血、促进伤口愈合的作用.方法:将已配制的生物蛋白胶涂在骨创腔表面,以达到止血封闭缺损组织和促进创口愈合等.信呆:29例颌骨囊肿患者术后伤口均愈合良好,无明显肿胀、无溃烂等.结论:生物蛋白胶可通过封闭创口、促进愈合,在颌骨囊肿手术中应用可靠、安全,疗效佳.     

软骨细胞纤维蛋白胶混合物修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的：研究关节软骨细胞与纤维蛋白胶的混合物修复关节软骨全层缺损的效果。方法：（１）用自制消化瓶消化分离原代兔关节软骨细胞并培养;（２）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（３）分别用自体或异体关节软骨细胞和纤维蛋白胶的混合物修复兔股骨滑车关节软骨全层缺损。术后１、２、３个月从大体观察,组织学等方面了解关节软骨缺损的修复情况。结果：自体软骨细胞组在术后３个月时修复组织已非常类似     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

复合PRP的可注射型组织工程骨修复兔桡骨缺损的实验研究

目的以自体富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）、骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和纤维蛋白胶构建可注射型组织工程骨并探讨其修复骨缺损的效果。方法36只新西兰兔分为A、B、C3组,每组12只。A、B组动物术前4h抽取耳背中央动脉血提取PRP。A组于术前1-2个月抽取双髂骨处骨髓并培养出BMSCs,在体外与纤维蛋白胶（FG）及自体PRP构建成可注型组织工程骨,植入自体桡骨1.5cm节段性骨缺损,为实验组。B、C两组分别植入PRP＋FG、FG于同样骨缺损处为对照组。另取4只桡骨同样部位和大小骨缺损旷置作为空白组。术后观察其一般情况并于4、8、12周取材做组织学切片,术后12周取尺桡骨做生物力学测试。分别从组织学观察、生物力学方面评估比较骨缺损的修复情况。结果组织学观察见A、B组各时间点新骨形成均优于C组。生物力学比较：12周时A组桡骨生物力学强度与正常桡骨比较无明显差异（P〉0.05）,但其明显优于B组（P〈0.05）。结论PRP对骨缺损愈合有明显促进作用,复合PRP的可注射型骨修复材料及构建的含种子细胞的组织工程骨均可修复节段性骨缺损,但种子细胞的添加可明显促进新骨成熟度和增强其生物力学性能。     

两种构建方法对组织工程骨种子细胞粘附和增殖的影响

目的比较普通的静置接种法和双相接种法在组织工程构建中的差异,探索更佳的体外构建策略.方法采用静置接种法和双相接种法将不同浓度的羊间充质干细胞分别与同种异体冻干脱钙骨基质复合,体外构建组织工程骨,通过相差显微镜、光镜、扫描电镜观察及MTT检测等,了解细胞在材料中的粘附、生长情况.结果两种方法均能使细胞在支架上较好的粘附、铺展、增殖,但单纯静置接种的接种细胞密度超过2×l06/ml时上架细胞数不再增加、上架率低(＜76%);双相接种法用于更高的接种密度,可明显提高细胞的上架率((80%).结论生物蛋白胶辅助的双相接种法可突破普通方法上架率低、即时上架细胞有限的瓶颈,不影响细胞的生长,是一种更佳的组织工程骨体外构建策略.     

生物蛋白胶宫颈封堵术在未足月胎膜早破中的临床应用

目的：探讨生物蛋白胶宫颈封堵术治疗未足月胎膜早破的有效性。方法将在我院治疗的28例未足月胎膜早破孕产妇随机分为三组,A组10例采用B超监测下经宫颈插管生物蛋白胶封堵法治疗,B组8例行腔镜介导下宫颈插管推注生物蛋白胶封堵术,C组10例行羊膜镜介导下宫颈插管推注生物蛋白胶封堵胎膜破口术,三组再给予相同的抑制宫缩治疗和护理,比较三组孕产妇的手术效果和分娩差异。结果 A组孕产妇治愈0例（0.0%）,有效2例（20.0%）,无效8例（80.0%）,其中自然分娩2例,人工助产3例,剖宫产5例,胎儿存活率为60.0%;B组孕产妇治愈2例（25.0%）,有效4例（50.0%）,无效2例（25.0%）,其中自然分娩4例,人工助产1例,剖宫产3例,胎儿存活率为83.3%;C组孕产妇治愈8例（80.0%）,有效1例（10.0%）,无效1例（10.0%）,其中自然分娩8例,人工助产1例,剖宫产1例,胎儿存活率为100.0%,治疗效果和术后分娩情况显著优于其他两组,其差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论羊膜镜介导下生物蛋白胶封堵胎膜破口法结合了传统方法的优点,封堵成功率高,操作相对简单,而且不需要注水,不影响生物蛋白胶的凝固,值得推广。     

浓缩骨髓复合纤维蛋白胶对骨不连的修复

目的使用浓缩自体骨髓复合纤维蛋白胶修复骨缺损及骨不连,观察成骨效果并探讨其促进成骨的机制。方法应用浓缩细胞技术取得骨髓有核细胞混合物,与纤维蛋白胶混合后植入16例骨不连及骨缺损患者体内。植入前取复合物行电镜观察、长期培养及细菌学培养。术后定期拍片观察修复效果。结果浓缩后,骨髓中有核细胞数量由（3．2±1．3）×10^6／ml提高至（31．0±3．9）×10^6／ml,细胞集落形成单位由（152±89）／ml浓缩至（531±168）／ml。电镜下见纤维蛋白胶与骨髓有核细胞生物相容性良好,长期培养无致瘤性,细菌学培养阴性。所有患者术后无脂肪栓塞、发热、感染等不良反应发生,无骨髓供区并发症。失访1例,其余患者均得到6～24个月的随访,平均11．6个月。15例中的13例患者骨折治愈,骨折愈合时间3～6个月,平均4．6个月。2例患者骨折不愈合。结论通过浓缩技术可及时、有效的获得足量的骨髓基质干细胞,注射自体浓缩骨髓与纤维蛋白胶}昆合物可修复骨不连及骨缺损。     

浓缩自体骨髓复合纤维蛋白胶修复兔桡骨陈旧性骨缺损

目的 采用浓缩自体骨髓复合纤维蛋白胶修复陈旧性骨缺损,初步探讨其促进成骨的机制.方法 将36只新西兰大白兔随机平均分为3组:单纯纤维蛋白胶组(A组),纤维蛋白胶复合自体骨髓组(B组),纤维蛋白胶复合浓缩自体骨髓组(C组).每只动物均在左侧桡骨中段制造长1.5cm的段缺性骨与骨膜缺损,1个月后在骨缺损处分别植入3种方法制备的组织工程复合材料.取浓缩骨髓、纤维蛋白胶复合物行电镜观察、长期培养及细菌学培养.术后4、8、12周行X线检查、硬组织切片观察成骨效果,并行半定量分析.结果 电镜下可见骨髓有核细胞与纤维蛋白胶相容性良好,无细菌污染,长期培养无致瘤性.X线观察显示B组和C组的修复效果明显高于A组.术后8、12周,C组的Yang氏评分分别为(9.348±0.364)和(12.664±0.388)分,明显高于B组的(7.984±0.229)(F＝40.167,P＝0.001)和(10.584±0.836)分(F＝ 20.3647,P＝0.004).B组(F＝ 36.004,P＝0.001)和C组(F＝155.141,P＝0.000)术后12周的Yang氏评分均明显高于术后8周.随着时间的延长,组织学切片见B组和C组均有不同程度的骨缺损修复.结论 自体骨髓或浓缩自体骨髓复合纤维蛋白胶可修复兔桡骨陈旧性骨缺损,单纯纤维蛋白胶无此作用.