抗原冲击致敏的树突状细胞介导的特异性体外抗慢性粒细胞白血病细胞作用

为研究慢性粒细胞白血病 (CML)细胞冻融抗原 (CLA)致敏的树突状细胞 (DC)对特异性抗白血病的作用 ,将CML患者外周血单个核细胞来源的DC在体外用CLA致敏 ,再与CML患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养。应用乳酸脱氢酶释放法观察其对自身CML细胞 ,K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤活性 (CIK +CLA DC组 ) ,与未致敏的DC +CIK(CIK +DC组 ) ,CIK组及CIK +CLA组进行比较。结果表明 ,效靶比为 2 5∶1时细胞杀伤活性最强 ,在该效靶比下 ,4组细胞对自身CML细胞的杀伤活性分别为 (6 8 8± 14 2 ) % ,(5 2 5± 9 4 ) % ,(2 0 7± 7 5 ) %和 (2 4 2± 8 7) %。CIK +CLA DC组杀伤活性最强 ,与其余 3组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;CIK +DC组比CIK组杀伤活性强 (P <0 0 1) ;CIK组与CIK +CLA组比较无显著性差异 (P >0 0 5 )。CIK +CLA DC组在效靶比为 2 5∶1时对自身CML细胞 ,K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤活性分别为 (6 8 8± 14 2 ) % ,(14 6± 6 2 ) %和 (12 7± 10 2 ) % ,与K5 6 2细胞和Raji细胞比较 ,具有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 :CIK对CML患者自身细胞具有一定的杀伤活性 ;CIK与CML DC共培养组对自身CML细胞杀伤活性比CIK组强 ;CIK与CLA抗原致敏CML DC共培养组具有最强的杀伤活性。CLA抗原     

致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究

探讨脐血单个核细胞（MNC）诱导的树突状细胞（DC）通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HL-60、K562的杀伤作用。取脐血12份,分离MNC。在MNC中加入细胞因子GM-CSF（granulocyte monocyte colony-stimulating factor）、IL-3（interleukin 3）、SCF（stemcell factor）和EPO培养4周。使用CD83、CD1a、CD11C和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况。DC通过负载HL-60、K-562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL^3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性。结果表明：新鲜脐血CD1a^＋、CD11c^＋、CD83^＋、CDw123^＋细胞数分别为0．27×10^5／ml、5．87×10^5／ml、1．94×10^5／ml、2．73×10^5／ml。加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC,经培养2—4周,DC数明显增多,分别达11．02×10^5／ml、28．24×10^5／ml、10．57×10^5／ml、18．7×10^5／ml,此后逐渐减少。细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1：40时的刺激活性最佳。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为（42．04±8．46）％和（31．25±11．07）％,与实验组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论：加入细胞因子GM—CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为cD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用。脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用。     

抗原冲击致敏的脐血树突状细胞治疗恶性肿瘤的实验研究

目的研究抗原冲击致敏的脐血树突状细胞体外对肿瘤细胞的杀伤作用。方法采用GM-CSF、IL-4、TNF-α联合诱导脐血树突状细胞、再用肿瘤抗原冲击致敏,测定其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果脐血树突状细胞对NC1446、SMMC7721、K562细胞均有明显的杀伤作用。经抗原冲击致敏后,脐血树突状细胞产生明显的特异性杀伤活性。结论抗原冲击致敏的脐血树突状细胞可特异性杀伤肿瘤细胞。     

VEGF对白血病树突状细胞诱导CTL杀伤活性的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对白血病树突状细胞(DC)激活的CTL体外杀伤活性的影响。方法K562白血病细胞经5μmol/L VEGF反义寡核苷酸作用24 h后诱导生成DC。流式细胞术检测DC特征性表型(CD40、CD86、HLA-DR和CD83)的表达,MTT法检测DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的杀伤活性。ELISA法检测DC上清中IL-12的表达。结果与正常K562诱生的DC(K562-DC)相比,K562经反义寡核苷酸下调VEGF表达后培养出具有典型特征的DC(AS-K562-DC),它不仅高表达DC免疫表型,而且激活的CTL对K562细胞具有更强的杀伤效应,同时具有更强的IL-12分泌能力(P均<0.05)。结论抑制白血病细胞VEGF表达,能够促进白血病源DC的分化和成熟,激活的CTL在体外具有更强的抗白血病效应。     

抗原致敏的脐血树突状细胞诱导抗肿瘤效应的体外实验研究

树突状细胞（Dendritic cell,DC）连接先天和适应性免疫。其特点是捕获抗原和加工,迁移到淋巴器官和表达抗原特异性淋巴细胞活化的各种共刺激分子的能力强。近年来国内外对树突状细胞抗肿瘤作用的研究已进入了Ⅰ 、Ⅱ临床实验阶段。我们选用脐血为原料诱导扩增DCs,使其诱导特异性的T细胞杀伤活性,杀伤肿瘤细胞,为DC疫苗临床应用寻找有效的途径。     

K562细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的探讨人的树突状细胞(dendriticcell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有粘附特性的单核细胞(PBMC),经GMCSF、IL4培养5d后,获得未成熟的DC(imatureDC,imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA。抽提转染前后以及转染24h后的DC内RNA进行RTPCR检测,Westernblot分析p210蛋白表达,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等。PBMC以每组5×106/ml,分别在不同组分的培养液中培养DC,通过细胞计数、流式细胞仪测定CD1a表达、细胞纯度来估计制备效果。结果RTPCR检测表明DC经K562总RNA转染后,细胞内出现BcrAbl的cDNA条带,24h后消失。Westernblot试验表明转染24h后,开始表达p210特征性蛋白;并且明显促进T细胞对K562的杀伤活性。1%自体血浆体积分数RPMI1640培养的DC的CD1a表达量最高,并且细胞获得数量也仅屈居第二,为总体评价较高的一组。结论应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗具有可行性,预示改良的DC疫苗抗肿瘤的广泛应用前景。     

人脐血树突状细胞体外诱导抗白血病细胞毒效应

为了体外观察树突状细胞 (DC)诱导的抗白血病细胞毒效应 ,采用细胞因子组合体外扩增培养脐血单个核细胞 (CBMNC) ,对产生的DC进行形态学观察、免疫表型检测和功能鉴定 ;用DC制备细胞毒T淋巴细胞 (CTL)和51Cr释放法测定CTL的溶靶细胞毒性。结果表明 :CBMNC中T细胞亚群与成人外周血相似 ;CD1a阳性细胞含量极少 ,仅为 (0 .4 1± 0 .0 9) % ;在DC扩增培养过程中 ,DC形态发生明显变化 ,胞体变大 ,形态不规则 ,有的细胞出现毛刺状突起 ,有的细胞出现粗大树根状突起 ;在培养 15天时 ,细胞群中CD1a阳性细胞达 (2 8.4± 3.5 5 ) % ,有 (6 3.6 7± 2 3.33) %的细胞表达CD86 ,(8.7± 1.4 9) %的细胞表达CD83,(32 .5± 1.5 3) %的细胞表达HLA DR ;产生的DC对异基因淋巴细胞具有明显的增殖刺激作用 ;经冻融的HL 6 0全细胞抗原脉冲的DC致敏自体T淋巴细胞产生的CTL对HL 6 0细胞具有特异性细胞毒效应。结论 :本研究中的脐血DC培养体系能产生较高含量的DC ,脐血DC在体外能诱导产生抗白血病细胞毒效应。     

抗原负载的树突细胞介导的特异性抗慢性粒细胞白血病作用

慢性粒细胞白血病 (ＣＧＬ)来源的树突细胞 (ＤＣ)在体外能较强地激发特异性细胞毒Ｔ细胞产生 ,对自身白血病细胞具有较强的杀伤活性[1 ] 。我们探讨ＣＧＬ细胞冻融抗原(ＣＬＡ)负载的ＤＣ与细胞因子诱导的杀伤细胞 (ＣＩＫ)共同培养能否进一步提高特异性细胞毒Ｔ细胞的杀伤活性。材料和方法1　细胞来源　 12例外周血样本采自ＣＧＬ慢性期初诊患者(ＷＢＣ >5 0× 10 9) ,冻存后作为靶细胞及制备ＣＬＡ。采缓解后患者外周血进行ＤＣ及ＣＩＫ细胞培养。2　主要试剂　ｒｈＩＬ 4 (比活性 13Ｕ ｎｇ)、ｒｈＴＮＦα(比活性 36Ｕ ｎｇ)购自Ｐｒｏ…     

HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。     

人树突状细胞的成熟状态体外对Glatiramer acetate 特异的T细胞系的调控作用

为了了解树突状细胞(DC)成熟状态对Glatiramer acetate(GA)特异的T细胞分化的影响。在体外条件下，分析了从多发性硬化症(MS)病人外周血单个核细胞诱导的成熟与未成熟的树突状细胞对来自多发性硬化症病人的GA特异的T细胞系增殖及细胞因子产生的影响。结果显示，体外条件下，从MS病人外周血的单个核细胞易于诱导GA抗原特异的T细胞系(TCL)；5μg／ml的脂多糖(LPS)在24小时内可有效诱导DC的成熟。同未成熟的DC相比，成熟的DC更能有效地刺激GA抗原特异的TCL的增殖；GA抗原特异的TCL产生高水平的IL-2,IL-4，IFN-γ，IL-10及低水平的IL-6；成熟DC能促进GA抗原特异的TCL的IL-6和IL-10的分泌，但下调IL-2，IL-4及IFN-γ的产生。结论：DC的成熟状态调控TCL的增殖及细胞因子的产生．     

树突状细胞对自体自然杀伤细胞体外扩增及功能的影响

本研究探讨树突状细胞（DC）对自体自然杀伤（NK）细胞体外扩增和功能的影响及其机制。用干细胞培养液（SCGM）在37℃、5％CO2、饱和湿度培养条件下以rhIL-2体外扩增NK细胞10天后，将自体DC与NK细胞以5：1（5：1组）和1：1（1：1组）的比例混合继续培养。14、21天时计算5：1组、1：1组和对照组的NK细胞扩增倍数，流式细胞术测定细胞表面CD3、CD56／16的表达，MTT法检测NK细胞的功能，ELISA法检测各培养组上清液中TNF-α和IL-12p70的含量。结果表明：14天时5：1、1：1组和对照组的扩增倍数分别为29．25±4．01、21．23±2．91和16．26±1．58，3组间比较差别有统计学意义（P〈0．05）。同组不同时间比较，14天时扩增倍数最高（P〈0．05）。14天时3组CD3^-、CD56／16^＋表达率分别为（64.6±7.8）％、（50．6±8.7）％和（34．8±5．1）％，5：1组表达率最高（P〈0．05）。14天时3组对K562细胞的杀伤率分别为（87.4±6．8）％、（75.4±6．3）％和（63．7±3.8）％，5：1组杀伤活性明显高于其它2组（P〈0．05）。5：1组上清液中TNF—α和IL-12p70的含量均分别高于其它各组（P均〈0．05）。结论：DC与NK细胞混合培养，能以比例依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数，增强NK细胞的功能。DC增加NK细胞的扩增倍数与DC分泌的IL-12有关，NK细胞功能增强与NK细胞分泌的TNF—α增高有关。     

白介素21对树突状细胞诱导的CTL抗白血病作用的影响

本研究探讨白介素21（IL-21）对树突状细胞（DC）诱导的CTL抗白血病的体外作用。以不同细胞因子诱导培养急性白血病（AL）患者缓解期外周血单个核细胞产生DC，自体AL细胞RNA作为抗原负载DC，与自体T淋巴细胞共培养诱导白血病特异性CTL产生；用LDH释放法检测CTL杀伤自体AL细胞的作用，并检测CTL产生IFN-γ和TNF-α的变化。实验共分2组：实验组，在DC—CTL共培养过程中加用IL-21（200ng／ml）；对照组，不加IL-21。同时对IL-21单独作用培养后成熟DC，检测其表面抗原表达变化以及诱导同种混合淋巴细胞反应能力。结果表明：对照组和实验组的CTL产生率分别为：（56．73±10．21）％，（73．43±18．01）％（P〈0．01）；培养上清中IFN-γ和TNF-α分别为：（154．91±67．20）ng／L，（310．62±141．15）ng／L（p〈0．01）和（8．77±5．09）μg/L，（15．25±6．56）μg／L（p〈0．01）。在效靶比为20：1时，两组对自体AL细胞的杀伤作用分别为（50．22±5．07）％，（75．38±9．47）％（P〈0．01）；IL-21作用后的成熟DC的CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA—DR表达没有明显变化；诱导同种混合淋巴细胞反应能力亦没有明显不同。结论：IL-21可促进DC诱导的CTL增殖、增加IFN--γ和TNF—α产生从而增强其抗白血病作用；IL-21对成熟DC表面抗原表达及其免疫功能无明显影响；提示IL-21在白血病免疫治疗中发挥一定的作用，具有潜在的临床应用价值。     

脐血树突状细胞对同源CIK细胞生物学活性及抗白血病作用影响的研究

本研究旨在探索脐血树突状细胞（DC）对同源细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞体外增殖、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对白血病细胞细胞毒作用的影响。采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1：5的比例混合培养,以脐血CIK细胞或外周血DC—CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤白血病细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ（IFN—γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-12（IL—12）的水平。结果表明,脐血DC—CIK细胞增殖能力显著高于脐血CIK细胞和外周血DC-CIK细胞（P〈0．05、P〈0．05）;脐血DC、CIK细胞共培养后,CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD56^＋细胞比例较相同奈件下CIK细胞明显增多（P〈0．05）;混合培养3天,脐血DC—CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ 、TNF—α含量均比单纯培养CIK细胞分泌含量高（P〈0．01、P〈0．05、P〈0．05）;在2．5：1—20：1的效靶比范围内,脐血DC—CIK细胞对各亚型急性白血病细胞的杀伤率明显高于CIK细胞（p〈0．05）,但对各亚型白血病细胞杀伤活性无显著性差异,与外周血DC—CIK细胞对白血病杀伤效应相类同。结论：脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗白血病效应。脐血DC。CIK细胞增殖能力比外周血DC—CIK细胞强,但两者在细胞毒方面无显著性差异。因脐血较易获得,且输注不易引起严重的排斥反应,因而DC—CIK细胞在免疫治疗方面具有更广泛的临床应用前景。     

胞壁酰二肽对儿童急性白血病骨髓树突状细胞体外扩增的影响

本研究旨在探讨胞壁酰二肽（muramyl dipeptide,MDP）对急性白血病儿童骨髓树突状细胞（DC）体外扩增及成熟的影响。采用Ficoll—Hypaque法分离急性白血病患儿骨髓单个核细胞。实验分为4组：对照组DC以含10％FCS的RPMI 1640培养液培养;实验1组：DC单独应用胞壁酰二肽;培养实验2组：DC用rhGM—CSF＋rhIL-4＋rhTNF—α培养;实验3组：DC用rhGM—CSF＋mIL-4＋rhTNF-α＋MDP培养,分别诱导培养DC。每日光学显微镜下观察细胞生长情况及细胞形态,培养8天后,计数各组细胞数量,并应用流式细胞术检测各组细胞免疫表型。结果表明：①实验各组均得到一定数量典型的DC,对照组DC数（0．85±0．23）×10^5／L,而实验1组、实验2组、实验3组DC数分别为（2．31±0．24）、（3．26±0．37）及（4．16±0．34）×10^5／L,均明显高于对照组（P均〈0．01）;实验1组DC数低于2组及3组（P均〈0．01）;实验3组DC数明显高于2组（P〈0．01）。②对照组、实验1组、实验2组及实验3组的札A—DR细胞比例分别为19．98±3．74、37．24±4．32、58．81±2．08、77．48±5．57,实验1组明显高于对照组（P〈0．01）,而低于实验2组、实验3组（p均〈0．01）;实验3组明显高于2组（P〈0．01）。对照组、实验1组、实验2组及实验3组的CD1a细胞比例分别为11．46±2．43、28．71±6．64、46．92±4．78、57．03±3．07,实验1组明显高于对照组（P〈0．01）,而低于实验2组、实验3组（P均〈0．01）;实验3组明显高于2组（t=3．98,P〈0．01）。对照组、实验1组、实验2组及实验3组的CD83细胞比例分别为（13．05±5．70）％、（36．32±5．61）％、（54．95±7．83）％、（75．70±6．67）％,实验1组明显高于对照组（P〈0．01）,而低于实验2组、实验3组（P均〈0．01）;实验3组明显高于2组（P〈0．01）。结论：MDP不仅对急性白血病患儿骨髓DC有扩增作用,而且能促进其成熟,并能协同细胞因子促进DC增殖和成熟,但MDP促进DC增殖的能力弱于其与细胞因子的联合作用。     

脐血源树突状细胞促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应

本研究探讨人脐血单个核细胞体外诱导分化的树突状细胞（DC）促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。利用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,经贴壁法获得脐血贴壁的单个核细胞,经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）体外诱导分化为脐血DC。用间接免疫荧光法检测DC,MTT法检测DC活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。试验组加DC,DC与肿瘤细胞的比例分别为20∶1、50∶1、100∶1,对照组不加DC。结果表明：脐血单个核细胞经GM-CSF、IL-4诱导后,第15天在倒置显微镜下可见典型形态的DC。荧光显微镜下,CD1a＋细胞率为（43.12±5.83）%。各实验组与对照组比较,实验组DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应均高于对照组,差别均具有显著性（P〈0.01）。100∶1组与50∶1组比较,对肿瘤细胞的杀伤效应差别无统计学意义（P〉0.05）;100∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组,差别有统计学意义（P〈0.05）;50∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组,差别有统计学意义（P〈0.05）。结论：人脐血单个核细胞体外经细胞因子诱导分化培养的DC可促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。     

白血病树突状细胞体外培养影响因素的研究

白血病来源的树突状细胞（dendritic cell,DC）与正常的树突状细胞相比,其表面分子表达相似,但是抗原呈递功能相对较弱。接种于人体后尚不能产生足够的免疫反应,因此如何让DC具有其应有的成熟功能而让其更好的在临床治疗中发挥作用,是临床治疗前首要解决的问题。这也是目前免疫治疗领域研究的热点之一。本文就白血病树突状细胞新近研究的体外培养方法,影响因素以及存在的问题做一综述。     

体外诱导人脐血树突状细胞介导T细胞抗白血病的细胞毒性效应研究

为了研究脐血淋巴细胞能否在体外培养成为特异性杀伤白血病细胞的杀伤性T细胞(CTL),联合细胞因子体外诱导脐血单个核细胞分化为树突状细胞(DC),再吞噬凋亡白血病细胞并将其抗原呈递给相同脐血的T淋巴细胞,得到杀伤性T细胞。用形态学及流式细胞术检测DC。CTL细胞的杀伤功能用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定。结果表明:12份脐血标本均可培养出形态典型的DC,DC的表面标志CD1a 、HLA DR 、CD86 、CD83 表达水平显著升高(P<0.05)。CTL可以杀伤未经培养的白血病细胞(效∶靶=50∶1对AML细胞的平均杀伤率为44.76±17.42%,对ALL细胞的平均杀伤率为8.50±4.25%),对相同患者缓解期的骨髓细胞杀伤率极低。结论: 在外体应用多种细胞因子刺激可诱导脐血单个核细胞分化成典型的DC;负载有白血病抗原的DC可诱导同一脐血的淋巴细胞生成白血病特异的杀伤性T细胞(CTL),所得CTL可特异性杀伤未经培养的白血病细胞而不严重伤害相同患者缓解期的骨髓细胞。     

无血清体外培养树突状细胞的研究

本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞（dendritic cell，DC）的无血清培养方案。以含胎牛血清（FCS）、人AB血清的培养液作为对照。分离健康志愿者外周血单个核细胞（PBMNC），在不同培养液中分别加入GM—CSF（100ng／ml）、IL-4（500U／ml）培养6天，再分别加入钙离子载体A23187（100ng／ml）继续培养24小时，于倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术分析细胞表型，MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。结果表明：无血清培养组培养出典型形态的DC，其表面CD14分子的表达明显减少，CD83、HLA—DR、CDw123分子的表达明显增高，具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。无血清组与两个含血清的对照组比较，组间无显著性差异（P〉0．05）。结论：无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比，无显著性差异。DC无血清培养具有临床应用前景。