乳糖化羧甲基壳聚糖的合成及转运质粒DNA的作用

目的 探讨乳糖化羧甲基壳聚糖（Lac-CMCS）的合成及其对DNA的转运作用。方法 还原胺化法共价连接乳糖和羧甲基壳聚糖（CMCS），并使其与含HBV反义x基因的质粒DNA进行复合，转染细胞进行培养，用酶联免疫吸附试验（ELISA）观察对细胞内病毒复制的抑制作用。结果 制备出的Lac-CMCS共价结合物中乳糖与CMCS的摩尔比为15：1。DNA与Lac-CMCS形成复合物的最佳质量比是1：10。此复合物能有效携带药物进入细胞发挥作用，最大抑制率达83．6％。结论 乳糖化羧甲基壳聚糖在体外能有效转运DNA进入细胞。     

半乳糖修饰的反义RNA真核表达质粒在乙型肝炎病毒转基因小鼠体内抗病毒疗效研究

目的：探讨半乳糖修饰的反义RNA真核表达质粒在乙型肝炎病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。方法：以半乳糖多聚赖氨酸（Gal-PLL)作肝靶向载体，将乙型肝炎病毒基因C区的反义RNA真核表达重组质粒（pCEP4-aC)制备为Gal-PLL-pCEP4-aC。将24只血清HBVDNA，HBsAg阳性的小鼠，随机等分为Gal-PLL-pCEP4-aC治疗组，Gal-PLL-pCEP4对照组和生理盐水性对照组，于实验第1天尾静脉分别注射Gal-PLL-pCEP4-aC,Gal-PLL-pCEP4(100ug/只）和等体积的生理盐水。观察实验治疗前后血清HBsAg变化和21天时血清HBV DNA，肝组织HBsAg,HBcAg改变，结果：Gal-PLL-pCEP4-aC治疗组7，14，21天时血清HBsAg较治疗前明显降低；21天时血清HBV，DNA转阴率62．5％（5／8），肝组织免疫组织化学HBsAg,HBcAg表达较Gal-PLL-pCEP4组和阴性对照组显降低，而Gal-PLL-pCEP4对照组和生理盐水组用药后血清中HBsAg与用药前比较差异性不明显（P＞0．05），Gal-PLL-pCEP4 组血清HBV DNA转阴1只（1／8）生理盐水组8只均未转阴，结论：肝靶向反义RNA能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV的复制和抗原表达。     

乳糖-聚赖氨酸复合物对肝细胞导向能力的研究

目的 :利用肝细胞膜存在的去唾液酸糖蛋白受体 ,合成一种能够携带目的DNA分子特异性富集到肝组织中的载体。方法 :在弱碱性溶液中 ,在氰基硼氢化钠作用下 ,通过还原氨化法进行乳糖 (Lac)与聚赖氨酸 (PLL)的共价连接 ,SephadexG 10分离纯化产物 ;采用真核细胞表达基因 β 半乳糖苷酶报道基因 ,在细胞培养中和小鼠体内观察乳糖 聚赖氨酸复合物 (Lac PLL)对肝细胞的导向能力。结果 :Lac在氰基硼氢化钠作用下能有效地结合到PLL分子上 ,Lac与PLL的摩尔比为 16∶1;Lac PLL复合物在体外能够与DNA分子形成稳定偶联物 ,使其所偶联的DNA分子有效地进入到肝癌细胞 ,并使相应基因在细胞中表达。小鼠尾静脉注射DNA/Lac PLL偶联物10 μg后 ,DNA能有效地在肝组织中富集并在肝细胞中表达。结论 :Lac PLL是一种有效的对目的DNA分子具有肝细胞特异性导向能力的载体。     

抗乙型肝炎反义核酸药物的筛选及细胞毒性研究

为了筛选抗乙型肝炎（HBV）反义寡核苷酸药物，根据HBV基因组序列择S基因起始区、SPⅡ帽子区、前核心基因起始区、核心起始区、包装信号起始区等5个基因靶位点，设计并合成硫代反义寡核苷酸（S－asODN），以HePG22215细胞为研究对象，利用ELIAS法、MTT比色法、电子显微镜观察等手段，观察上述s－asODN对HePG22215细胞HBsAg和HBeAg表达以及对细胞的杀伤作用和细胞形态、超微结构的影响，结果显示s－asODN能显著抑制HBsAg和HBeAg的表达，s－asODN抗HBV具有序列特异性、剂量相关性、抗核酸酶性、联合用药协同性。     

HMGN2重组表达质粒的构建及其抗乙型病毒性肝炎的病毒活性

目的：构建HMGN2重组表达载体并观察高迁移率蛋白HMGN2分子的抗乙型病毒性肝炎的病毒作用。方法用基因克隆的方法,构建pET -32 a-c （＋）-HMGN2重组表达质粒;用亲和层析的方法,纯化His-HMGN2融合蛋白, Tricine-SDS-PAGE电泳、Western blotting对纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。以HBV DNA转染的细胞株HepG2.2.15细胞为模型,用ELISA检测HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA的含量。结果成功构建了pET-32a-c（＋）-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,降低HBV DNA拷贝数。结论 HMGN2在体外细胞培养中有直接抗HBV的活性。     

HBsAg和HBcAg在大肠杆菌中合成

用DNA重组方法,可以提供一种无限的乙型肝炎疫苗来源。HBV DNA已在细菌中被克隆化,HBsAg和HBcAg已在大肠杆菌中有小量合成。作者把ptrpE2-1质粒改造成一种含适当的色氨酸操纵子调节区域的质粒ptrpL1。用这种质粒作为HBsAg和HBcAg基因片段的载体能够指导合成高水平的HBcAg、β-内酰胺酶和HBsAg融合多肽。     

抗肿瘤药物靶向载体系统的研究与开发

综述肿瘤靶向给药的基础和抗肿瘤药物靶向载体系统的发展。分类介绍普通被动靶向载药系统（如微乳、传统脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒、纳米脂质载体、药-脂结合物纳米粒等）、表面修饰的被动靶向载药系统及主动靶向载药系统（如免疫脂质体、免疫聚合物纳米粒及受体-配体介导靶向纳米载体）的研究与开发。在传统药物制剂的基础上，发展抗肿瘤药物的新型靶向载体系统，改善药物在体内的代谢动力学特性，增加药物定向富集到肿瘤部位甚至肿瘤细胞内，提高疗效，降低毒副作用，是近年来备受关注的课题。     

亚硒酸钠对乙型肝炎病毒的体外抑制作用

目的探讨亚硒酸钠在体外对乙型肝炎病毒(HBV)蛋白合成、DNA复制的影响及机制。方法将不同浓度的亚硒酸钠作用于HepG2.2.15细胞系,通过检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)水平、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和HBV DNA水平来评价HBV复制情况;免疫组织化学检测HepG2.2.15细胞p53蛋白的表达情况。结果亚硒酸钠对HBV复制具有抑制作用,随着亚硒酸钠浓度的升高,对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升,但对HBsAg的抑制作用要小于HBeAg。细胞内HBV DNA复制水平也逐渐下降(P<0.01)。p53蛋白的分布也发生了改变。结论亚硒酸钠对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg和HBcAg表达、HBV DNA复制均有抑制作用,作用机制与其干扰p53蛋白的表达有关。     

脂质纳米微粒载体在核酸药物递送中的应用

脂质微粒作为基因药物载体,用于全身药物递送,目前已进行了大量深入的研究。其中,脂质纳米微粒(lipid-based nanoparticles,NP)药物载体,在进行基因药物递送时,为克服体内的各种生理屏障,粒径需在100 nm以下,本文将重点介绍这类NP的配方和组装。NP作为一种核酸药物的脂质微粒递送载体,与阳离子脂质体/DNA复合物区别主要在于粒径大小,NP的粒径通常在100nm以下。影响NP粒径的主要因素包括脂质的构成、脂质与核酸的比例,以及制备方法等。NP所递送的核酸主要包括质粒DNA,siRNA,反义寡核苷酸。     

反义药物

反义药物一般指特定基因(如mRNA)为靶点，合成与之特异性互补结合的一段约由20个核苷酸组成的人工合成寡核苷酸即反义核苷酸(antisense oligonucleotide，ASON)。ASON可进行人工大规模合成和化学修饰，具有特异、高效的药理作用，便于进行药物合理设计等特性。根据核酸互补杂交原理特异性抑制特定基因表达的反义技术，可用于研究和开发以疾病相关基因为靶标的反义药物。以基因为靶向的反义药物是抗肿瘤新药研究和开发的重要方向之一j     

siRNA pool targeting different sites of human hepatitis B surface antigen efficiently inhibits HBV infection

The main objective was to determine whether a pool of small interfering RNAs (siRNAs) targeting different regions of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) efficiently inhibits hepatitis B virus (HBV) infection. siRNAs targeting different regions of HBsAg were transfected into HBV-producing HepG2.2.15 cells and at 72 h post-transfection, the culture medium was collected for ELISA to determine HBsAg, while total RNA was isolated from the cells for real-time PCR. Three siRNA sequences that efficiently inhibited HBV infection were converted into small hairpin RNAs (shRNAs) and then cloned into a single plasmid psiSTRIKE driven by a single U6 promoter. These shRNA expressing plasmids were tested for HBsAg gene silencing in HepG2.2.15 cells. A pool of siRNAs targeting HBsAg efficiently inhibited HBV replication and antigen expression when transfected into HepG2.2.15 cells, compared with the use of single siRNA. Similarly, the plasmid encoding three different shRNAs driven by a single U6 promoter was more effective in silencing HBsAg at DNA, mRNA and protein levels compared with the plasmid encoding single shRNA. No apoptotic change was observed in the cells when the plasmid was transfected at a dose of 0.5-2 microg/1 x 10(6) cells after complex formation with Lipofectamine LTX. Furthermore, transfection with siRNA or shRNA did not increase interferon-gamma (IFNs-gamma) release, suggesting no induction of IFN response. In conclusion, a pool of chemically synthesised siRNAs as well as the shRNA expression plasmid encoding multiple shRNAs targeting different regions of HBsAg showed high gene silencing in HepG2.2.15 cells.     

HepG2.2.15细胞中siRNA与拉米夫定抗乙型肝炎病毒复制作用的比较

目的：对HepG2.2.15细胞中siRNA与拉米夫定的抗乙型肝炎病毒（HBV）作用进行比较。方法：构建HBV siRNA的表达载体并转染入HepG2.2.15细胞。分别于48、72、96h收获细胞,与拉米夫定治疗组比较抗HBV作用。用ELISA方法检测HBsAg浓度;HBV DNA水平用实时定量PCR测定;用逆转录PCR检测HBV mRNA水平。结果：拉米夫定能明显降低HBV DNA水平,对HBsAg和mRNA抑制率较低;siRNA能全面降低HBsAg、HBV DNA和mRNA水平（P〈0.05）。结论：HepG2.2.15细胞中,siRNA与拉米夫定的抗病毒作用完全不同,siRNA抗HBV作用明显优于拉米夫定。     

针对HBV S基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探

目的 探讨针对HBVS基因翻译起始区的反义锁核酸（LNA）片断体外抗乙型肝炎病毒表达的作用。方法 合成三段均互补于HBVS区同一位点的反义核酸片断：锁核酸、反义寡核苷酸、全硫代反义寡核苷酸及无关对照序列,作用于HepG22．2．15细胞,采用ELISA法动态检测细胞上清中HBsAg含量的变化并比较其抗HBV抗原表达作用,以四甲基偶氮唑兰（MTT）法检测LNA对细胞的毒性。结果 三段反义寡核苷酸均能抑制HBsAg的表达,作用7d后抑制率分别为52％、42％、45％,其中LNA抗病毒活性最强且对细胞代谢无影响．无关序列无明显抑制作用。结论 针对HBVS区的锁核酸体外能有效抑制乙型肝炎病毒的表达．为乙肝的分子治疗开辟了新的前景。     

核酸类似物PNA在HepG2．2．15细胞中对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的评价核酸类似物PNA在HepG2．2．15细胞中对乙型肝炎病毒复制的抑制作用。方法以HepG2．2．15细胞作为细胞模型,拉米夫定作为阳性对照药物。HepG2．2．15细胞于药物处理14d后,收集上清液及细胞。采用ELISA检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,HBV荧光定量检测上清液和细胞内HBV DNA水平,CCK-8试剂盒检测药物对细胞的毒性作用。结果核酸类似物PNA与拉米夫定在浓度1．6-1000μmol·L^-1内对HepG2．2．15细胞的毒性均较小。与药物未处理组比较,PNA和拉米夫定均可有效抑制细胞上清HBV DNA,半数抑制浓度（IC50）分别为0．05-0．10μmol·L^-1和0．09-0．18μmol·L^-1,两者之间差异无统计学意义。结论在体外细胞实验中,PNA对细胞的毒性小,与拉米夫定的安全指数相当;PNA对乙型肝炎病毒复制有较强的抑制作用,且具有一定时效量效关系,与拉米夫定的抑制强度相当。     

六月青含药血清对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的:研究六月青(LYQ)含药血清对HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用。方法:采用血清药理学方法,在HBV的体外细胞培养系统(HepG2.2.15细胞)中观察LYQ抗HBV的作用。结果:LYQ含药血清在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制HBV DNA的复制,其作用呈显著的浓度-效应和时间-效应关系。结论:LYQ在体外能显著抑制HBV,可能是复方六月雪主要活性成分之一。     

甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG 2.2.15细胞及其HBsAg表达的影响

目的探讨甘草甜素联合单磷酸阿糖腺苷对HepG2.2.15细胞株存活率及其HB-sAg表达的影响,评价甘草甜素(GL)与单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)合用体外抗HBV效果。方法利用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞检测细胞培养上清液中的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),作为这两种药物联合在体外抗HBV效果的观察指标(以抑制率来表示)。用MTT法检测HepG2.2.15细胞的存活率。结果(1)各药对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率呈药物浓度和时间依赖性;联合组与两个单药组分别比较,抑制HBsAg差异有显著意义(P<0.05或P<0.01)。(2)随着浓度的增加,各药对细胞的存活率均显示抑制作用,尤其联合组高于其它两个单药组。结论GL联合Ara-AMP在体外HepG2.2.15细胞中具有协同抗HBV的作用。     

以HepG2.2.15细胞为对象的RNAi实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒(HBV)X区设计的siRNA表达载体pGenesil-HBVX对HepG2.2.15细胞相应蛋白表达的影响。方法筛选出最佳转染效率的剂量配比,将阳离子脂质体METAFECTENE与pGen-esil-HBVX的复合物转染HepG2.2.15细胞,于转染后24、48、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)。结果具有最佳转染效率而且不显著影响细胞活性的剂量配比为8μl∶2.5μg。pGenesil-HBVX转染HepG2.2.15细胞后24h,细胞上清液中HBsAg、HBeAg含量尚无显著变化(P>0.05);48h后HBsAg、HBeAg表达均有明显下降(P<0.01),并且持续至72h。结论pGenesil-HBVX可以在获得一定转染效率的基础上有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV的表达。     

山芝麻水提液对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用

目的观察山芝麻水提液（water extracts from Helicteres angustifolia,WHA）的体外抗乙型肝炎病毒的作用。方法采用HepG2．2．15细胞模型进行体外培养,给予不同浓度山芝麻,以拉米夫定作阳性对照,作用72h后检测上清液中HBsAg、HBeAg的分泌,观察药物对HepG2．2．15细胞分泌HBV病毒抗原的影响,同时以MTT法检测药物在体外对HepG2．2．15细胞的生长抑制作用,从而评价药物的抗HBV作用。结果山芝麻水提液对HepG2．2．15细胞的半数细胞毒浓度（TC50）为482．1mg·L-1;对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg的半数抑制浓度（IC50）为7．3mg。L-1,其治疗指数（TI）为66;对HBeAg,其Ic,n为14．6mg·L-1,TI为33。结论山芝麻水提液在体外有显著的抗HBV的作用,且毒性较低。Tel：（0771）5358342E—mail：gxLx60@163．COll]     

SiRNA沉默 HBx对 HepG2.2.15细胞人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

目的探讨应用RNA干扰技术沉默HBx对HepG2．2．15细胞中hTERT基因表达的影响。方法（1）将pSIHBV／X质粒转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR法评估沉默效率。（2）MTT法检测转染24h、48h、72h后细胞增殖情况。（3）Real-timePCR和Westernblot检测hTERT表达情况。结果测序结果显示pSIHBV／X质粒构建正确;RT-PCR检测HBVX基因的沉默效率为53．6％;MTT检测结果显示转染24h、48h、72h后H印G2．2．15细胞的增殖受抑制,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;Real-timePCR和Western blot检测结果均显示,转染pSIHBV／X质粒后HepG2．2．15细胞中hTERT基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA沉默HBx基因可抑制HepG2．2．15细胞中癌症标志基因hTERT的表达。     

In vitro antiviral activity of 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose against hepatitis B virus

This study examined the antiviral activity of the root of Paeonia lactiflora PALL. Among the solvent fractions of the crude drug, the ethyl acetate fraction showed anti-hepatitis B virus (HBV) activity (IC50, 8.1 microg/ml) in an HBV-producing HepG2.2.15 cell culture system. The active anti-HBV principle was isolated and identified as 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose (PGG) from the crude drug by activity-guided fractionation. PGG isolated from P. lactiflora was examined for the inhibition of HBV multiplication by measurement of HBV DNA and hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels in the extracellular medium of HepG2.2.15 cells after 8-d treatment. PGG decreased the level of extracellular HBV (IC50, 1.0 microg/ml) in a dose-dependent manner. PGG also reduced the HBsAg level by 25% at a concentration of 4 microg/ml. The gallate structure of PGG may play a critical role in the inhibition of anti-HBV activity. These results suggest that PGG could be a candidate for developing an anti-HBV agent.