兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

目的:在体外原代培养兔骨髓间充质干细胞,观察兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性,为用于组织工程学的种子细胞培养提供实验基础。方法:自兔股骨、胫骨取骨髓,分离骨髓间充质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液两组进行培养,对第3代细胞进行酶动力学法碱性磷酸酶(ALP)活性检测及钙结节茜素红染色,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果:两组细胞其培养液中的ALP含量不断升高,经过两独立样本t检验,矿化液诱导组第2,6,10天的ALP水平较正常对照组均明显升高(P<0.05)。细胞表现出成骨细胞特性,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外适当的培养条件下,增殖能力很强,可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究

目的：探讨兔骨髓基质干细胞的体外培养技巧,观察免骨髓基质干细胞的体外生长特性,为用于骨组织工程的功能细胞提供实验基础。方法：自兔髂骨抽取骨髓,分离骨髓基质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液进行培养,绘制细胞生长曲线,对细胞行碱性磷酸酶染色,计算细胞碱性磷酸酶染色阳性率,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果：第1-3代细胞生长曲线基本相同,加入矿化液后细胞生长速度明显减慢,但细胞表现出成骨细胞特性,其碱性磷酸酶染色阳性率大大提高,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论：兔骨髓基质干细胞在体外适当的培养条件下可以向成骨细胞方向分化,可作为骨组织工程的种子细胞．     

人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞

目的：探讨人骨髓基质干细胞体外定向诱导成骨细胞的培养方法，为应用人骨髓基质干细胞进行骨科细胞治疗提供依据。方法：抽取人骨髓组织，梯度离心后置于含100ml／L小牛血清的DMEM培养液中，培养24h换液，待细胞完全贴壁融合长满瓶底后，胰酶消化，传代，换诱导培养基继续培养、扩增。倒置显微镜观察细胞的形态，结合细胞化学染色、免疫组织化学染色进行细胞鉴定，以及采用细胞增殖法（MTT比色试验）分别于1、2、4、6、8、d测细胞OD值，绘制细胞生长曲线。结果：传代细胞4～5d即可传代，在诱导培养基中2周形成多层结构，并聚集成黑色结节。培养细胞ALP染色强阳性，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈黄褐色，细胞在接种后3～6d增殖最快。结论：本实验方法应用骨髓基质干细胞体外定向诱导所培养的细胞符合成骨细胞的形态特征和生物学特性。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学活性观察

目的建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增的方法，并进行生物学活性观察。方法穿刺抽取新西兰大耳白兔骨髓5ml，通过密度梯度离心法获取MSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第2代细胞用矿化液连续培养后，进行ALP及矿化结节染色。结果体外成功建立兔骨髓间充质干细胞分离扩增传代的方法，能够连续传至8～9代；矿化液培养的细胞ALP及矿化结节染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养，具有向成骨细胞诱导分化的特性，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

幼龄及成龄鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

目的比较幼龄及成龄大鼠骨髓基质干细胞体外培养过程中生物学特性的差异.方法取3周及3月龄SD大鼠股骨骨髓原代培养基质干细胞.第2代细胞添加诱导成骨培养液,分别通过相差显微镜观察细胞生长,MTT法检测细胞增殖,钙钴法、茜素红染色了解体外矿化,测定细胞总蛋白含量,RT-PCR测Ⅰ型胶原mRNA表达,透射电镜了解细胞及胞外基质分泌来比较两者差异.结果幼鼠细胞增殖更快,倍增时间4.8 d;培养第7天出现较多集落;钙钴法、茜素红染色深染细胞数目多,结节典型;细胞总蛋白含量高.成龄鼠细胞增殖相对慢,倍增时间5.4 d;未见细胞集落,钙化呈片状;细胞总蛋白含量较低.两者琼脂糖电泳均可显示Ⅰ型胶原mRNA条带;超微结构内质网丰富,胞外基质为前胶原样结构.结论不同鼠龄的骨髓基质干细胞经体外诱导均可分化为成骨细胞,考虑到细胞增殖及成骨潜能,幼鼠基质干细胞是研究细胞/生物材料相互作用更理想的工具.     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

早期贴壁分离并机械刮除纯化法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系

①目的探讨早期（60-80分钟）贴壁分离法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系，对细胞贴壁分离的时机以及传代后的形态变化的影响。②方法采用早期贴壁分离方法及机械刮除纯化法纯化问充质细胞，并用钙钴法染色检测细胞的ALP表达情况、使用成骨诱导荆诱导间充质细胞。用茜素红染色观察矿化结节的形成。③结果第一代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性；经条件培养基定向培养5天的细胞呈集落生长，并形成钙结节，茜素红染色阳性。④结论采用早期贴壁分离法可以短期内得到大量较纯的免间充质干细胞。在诱导剂作用下可成功分化成为成骨细胞，是培养骨组织工程用途的种子细胞的理想方法。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

骨形态发生蛋白1A型受体介导的信号通路在成骨细胞终末分化中的调节作用

目的 观察骨形态发生蛋白1A型受体(bone morphogenetic protein receptor 1A,BMPR1 A)介导的信号通路在成骨细胞终末分化中的调节作用.方法 使用Lox P/Cre系统,以3.2 kb Ⅰ型胶原蛋白为启动子,在小鼠成骨细胞中特异性敲除BMPR1A(不含Cre的小鼠记为对照组),采用Von Kossa染色、细胞茜素红染色,扫描电镜观察成骨细胞矿化能力的改变;MASSON染色、天狼星红染色观察成骨细胞胶原合成能力的变化;免疫组化染色、细胞周期检测初步探讨其成骨细胞终末分化阻滞的可能机制.结果 BMPR1A敲除小鼠与对照组小鼠相比:①矿化能力明显下降,且细胞间连接减少,间隙变大;②胶原合成能力减弱,胶原排列不规则;③FGF23与OPN的表达升高,细胞周期的阻滞是成骨细胞终末分化障碍可能的原因.结论 BMPR1A在成骨细胞终末分化中起着至关重要的作用,敲除后可导致小鼠骨矿化减弱,胶原合成能力下降.     

C57BL／6小鼠树突状细胞的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞对FBL-3细胞杀伤效应的研究

目的探讨C57BL／6小鼠树突状细胞（DC）的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对FBL-3细胞的杀伤效应。方法应用GM—CSF和114培养C57BL／6小鼠骨髓DC,用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,用3H—TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4h51cr释放测定法检测CTL杀伤活性。结果用IL4和GM—CSF联合培养小鼠骨髓细胞3天后,可见细胞形态发生改变,细胞形态不规则。培养第6～8天,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的DC特征。流式细胞仪检测DC表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad表达。FBL-3细胞冻融组和PBS组的DC在体外均可以诱导T细胞增殖,冻融组的DC体外诱导T细胞增殖能力明显高于PBS组。冻融组DC体外诱导的CTL对FBL-3细胞有明显的细胞毒作用。结论应用IL-4联合GM—CSF培养C57BL／6小鼠骨髓细胞,可大量扩增成熟DC,培养的DC符合其自身的特性;用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,可以诱导T细胞细胞大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL。     

熟地强筋合剂对大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察熟地强筋合剂在骨髓基质细胞向成骨分化过程中的作用。方法:采用体外培养大鼠骨髓基质细胞,分别观察各含药血清组碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原染色情况;取各组不同时间点培养液测定碱性磷酸酶比活性及骨钙素含量。结果:碱性磷酸酶染色强弱顺序为D组>C组>B组,Ⅰ型胶原染色强弱顺序为D组>C组>B组>A组,碱性磷酸酶比活性各加药组与对照组比较明显提高(P<0.05);各加药组与对照组比较BGP含量均明显提高。结论:熟地强筋合剂能促进大鼠骨髓基质细胞增殖,诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞;用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞;以MTT测定诱导细胞的增殖活性;免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达;诱导后的细胞移植于白兔膝关节内,X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

改良大鼠成骨细胞原代培养方法的实验研究

目的获得一种操作简便、细胞数量多而纯的成骨细胞原代培养方法。方法改良I型胶原酶消化获得成骨细胞的方法,并检测成骨细胞形态、碱性磷酸酶染色、矿化结节形成。结果经改良的大鼠成骨细胞原代培养方法获得的细胞数量多,形态正常,且碱性磷酸酶分泌及矿化特性正常。结论改良大鼠成骨细胞原代培养方法是一种操作简便、细胞数量多的成骨细胞原代培养方法。     

克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性研究

目的 建立克隆化兔骨髓基质干细胞（MSC）系，并对其生物学特性进行研究，为组织缺损修复寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法 应用密度梯度离心和贴壁分离培养方法，从兔骨髓中获得原代骨髓MSCs，再应用克隆化分离培养技术，建立克隆化扩增的骨髓MSC系。体外传代培养、低温冻存复苏、形态学观察、生长曲线测定、染色体分析和分化潜能鉴定。结果 建立了一株克隆化兔骨髓MSC系。该细胞系在含10％胎牛血清的LG-DMEM中连续传代至第32代，仍保持旺盛的增殖能力，P4和P32代细胞染色体众数保持稳定的二倍体核型，成骨细胞诱导试验阳性。结论 获得一株具有旺盛的增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的克隆化兔骨髓MSC系。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率〉95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养生长特性的初步观察

①目的从形态学角度观察兔骨髓间充质干细胞体外培养的生长特性,建立一套体外分离、培养骨髓问充质干细胞的可靠方法。②方法取兔骨髓后,通过离心,贴壁培养,分离出问充质干细胞。在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化并记录其特点。③结果随时间的推移可见细胞由贴壁前的圆形变成椭圆彤、梭形,少部分呈多角形,细胞呈漩涡样生长。同时可见脂肪细胞出现,部分细胞由梭形变为圆形,周围可见光强反射基质形成,类似软骨细胞。然后细胞增殖由快变慢,更换特制培养液细胞增殖速度加快。④结论兔骨髓间充质干细胞在体外可向成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞转化。细胞生长因子可增强及加速骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。     

兔自体骨髓干细胞移植联合骨髓动员治疗下肢缺血的实验研究

目的：探索自体骨髓干细胞移植联合骨髓动员治疗下肢缺血性疾病的可行性。方法：于2008年3月-2008年6月进行兔骨髓干细胞移植联合骨髓动员治疗下肢缺血实验研究。建立新西兰雄兔右后肢缺血动物模型,将其分为4组：实验1组（7只）单纯应用重组粒细胞集落刺激因子进行骨髓动员,实验2组（7只）取自体骨髓干细胞制备成干细胞悬液,注射于右后肢缺血部位,实验3组（7只）为自体骨髓干细胞移植后进行骨髓动员组,4组（7只）为生理盐水注射组,于动物模型制备后第5周行血管造影观察血管新生程度,CD34免疫组化检测毛细血管密度。结果：动脉造影显示进行骨髓干细胞移植联合骨髓动员的新西兰雄兔缺血右后肢缺血部位动脉较其他组明显增多,CD34免疫组化标记毛细血管密度增加。结论：自体骨髓干细胞移植联合骨髓动员是一种方法简便、安全有效的治疗下肢缺血性疾病的方法。