HSP-70和HO-1诱导对鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨缺血预处理(IPC)和阿霉素预处理(DPC)延迟保护作用的发生机制.方法:建立大鼠部分肝脏热缺血再灌注模型.IPC组采用肝脏缺血10 min,再灌注10 min,DPC组经静脉注射阿霉素(1 mg/kg体重),对照组等量生理盐水注射.肝组织热休克蛋白70(HSP-70)、血红素氧化酶1(HO-1)蛋白、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)浓度分别采用Western blot法和ELISA法测定.结果:IPC后HO-1和HSP-70含量分别于12 h和24h达到高峰;IPC和DPC后24 h诱导HSP-70、HO-1的量无显著差异(P＞0.05).对照组缺血再灌注后3 h血清中TNF-α、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)及湿重/干重(W/D)的水平明显升高,而IL-10的含量降低,与假手术组相比差异显著(P＜0.01);IPC或DPC后降低了TNF-α的释放和AST、ALT、LDH及W/D的水平,提高了IL-10的含量,与对照组相比差异显著(P＜0.01).结论:IPC和DPC的延迟保护作用与HSP-70和HO-1的诱导生成有关.     

模拟飞行对内皮细胞损伤机制研究

目的 探讨模拟飞行对主动脉内皮细胞损伤的影响机制.方法 将16只雄性新西兰白兔随机分为对照组和模型组.模拟飞行内皮细胞模型由离心机训练建立.ELISA法检测细胞悬液血红素氧化酶-1(HO-1)及内皮素-1(ET-1)含量;测定细胞悬液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD).结果 与空白对照组相比,模拟飞行组的主动脉内皮细胞SOD活性显著降低(P＜0.05);MDA含量显著增加(P＜0.05).与空白对照组相比,模拟飞行组的主动脉内皮细胞HO-1含量增高(P＜0.05);ET含量显著增加(P＜0.05).结论 模拟飞行可能通过氧化应激及释放血管活性物质ET-1,诱导内皮细胞损伤;而HO-1可能起到自我保护作用.     

原代培养大鼠肝窦内皮细胞凋亡的检测及意义

目的检测原代分离培养肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells,SECs)的凋亡状况.方法用胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心加选择性贴壁的方法分离SEC;用光镜形态学、Ⅷ因子和CD14免疫细胞化学染色及RECA-1单抗间接免疫荧光法及SEM鉴定SEC;采用TEM及AnnexinV联合PI双染的方法检测SEC的凋亡.结果分离培养的SEC得率为(2.06±0.35)×107/只大鼠,活力≥92%,纯度达90%;光镜下细胞形态典型,Ⅷ因子染色阴性而CD14染色阳性,RECA-1单抗间接免疫荧光染色阳性,SEM下可见SEC表面具有典型的窗孔结构;即使在培养基中加入ECGF,TEM下仍可观察到SEC出现凋亡的典型形态特征,且随培养时间延长,凋亡率明显升高,培养12 h的SEC凋亡率与新鲜分离的相比,差异已具有显著性(F=53.11,P＜0.05).结论体外培养的SEC存在明显的自发凋亡,且这种凋亡呈生长因子抵抗性.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

阿霉素诱导亚铁血红素氧化酶-1在大鼠肝、脾和肾脏组织的表达及其对肝功能的影响

目的：观察阿霉素诱导亚铁血红素氧化酶-1（HO-1）在大鼠肝、脾和肾脏组织的表达及对肝功能的影响。 方法：雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、小剂量阿霉素组(1 mg•kg^-1) 和大剂量阿霉素组(10 mg•kg^-1)，分别于给药后6、12、18、24和48 h切取阿霉素组与对照组部分肝脏用蛋白电泳法检测HO-1表达，切取注药后48 h阿霉素组和对照组部分肝、脾和肾行HO-1免疫组化染色，同时检测三组大鼠肝功能、血清ET-1和TNF-α。 结果：蛋白电泳检测显示HO-1蛋白在正常肝脏内的表达阴性；给药后6 h两组均可检测出HO-1的表达，24 h达到高峰，48 h HO-1表达已明显减弱。免疫组化染色显示，注射阿霉素48 h,肝、脾和肾仍可见大量HO-1染色阳性细胞；对照组肝脏无染色阳性细胞，脾肾可见少量染色阳性细胞。肝功能指标、血清TNF-α和ET-1对照组与小剂量阿霉素组差异无显著性(P>0.05)，大剂量阿霉素组上述指标明显高于对照组和小剂量阿霉素组(P<0.05)。 结论：阿霉素可诱导肝脏、脾脏和肾脏HO-1表达，小剂量阿霉素对大鼠肝脏未造成明显损害。     

肺缺血再灌注损伤时血红素氧合酶-1的变化及意义

目的:探讨肺缺血再灌注损伤时血红素氧舍酶-1(HO-1)的变化规律及意义.方法:40只健康日本大耳白兔随机分成假手术对照(C)组、肺缺血再灌注(IR)组、肺缺血再灌注 氯铁血红素(H)组和肺缺血再灌注 锌原卟啉(Z)组.各组在缺血前后,再灌注1 h、2 h、3 h分别抽血检测一氧化碳血红蛋白(COHb)浓度,实验结束时取肺组织测湿/干重比(W/D)、肺泡损伤数(IAR)、HO酶活力并观察细胞超微结构的改变.结果:与C组相比,IR组COHb浓度随缺血和再灌注时间的延长而逐渐升高,H组这种趋势更加明显,Z组升高较缓和;IR组W/D、IAR升高,H组下降而Z组明显增加;IR组HO酶活力增加,H组上升更加显著而Z组明显降低;超微结构显示H组较IR组损伤减轻而Z组加重.结论:HO-1诱导可能通过一氧化碳(CO)介导减轻肺缺血再灌注损伤.     

阿霉素诱导亚铁血红素氧化酶-1对大鼠肝脏缺血再灌注的保护作用

目的:探讨阿霉素诱导亚铁血红素氧化酶-1(HO-1)对大鼠肝脏缺血再灌注的保护作用及其机制。 方法:48只雄性Wistar大鼠,随机分成6组（每组8只）：正常组(N)、阿霉素组(DOX)、原卟啉锌-Ⅸ组(ZnPP)、缺血再灌注组(IR)、阿霉素+缺血再灌注组(DOX-IR)和阿霉素+原卟啉锌+缺血再灌注组(DOX-ZnPP-IR)。测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)含量作为肝功能指标;放射免疫法测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)和内皮素(ET)作为应激标志物指标;应用Western blotting法和免疫组织化学S-P法观察HO-1蛋白表达;透射电子显微镜观察细胞超微结构变化。 结果:DOX-IR组ALT、AST、ET-1和TNF-α值均显著低于IR组 (P<0.05);DOX组与正常组比较,肝功能、ET-1和TNF-α值差异无显著性 (P>0.05);DOX-ZnPP-IR组与IR组比较,肝功能值差异无显著性(P>0.05)。Western blotting法和免疫组织化学S-P法检测显示DOX 组和DOX-IR组 HO-1蛋白表达增加,HO-1在正常肝脏内的表达呈阴性。透射电镜检查IR组肝细胞细可见明显的细胞器损害现象,DOX -IR细胞器受损较轻。 结论：阿霉素预处理可以提高器官对缺血再灌注损伤的耐受性,其机制可能与阿霉素所诱导的HO-1表达有关,小剂量阿霉素对大鼠肝脏未造成明显损害。     

虫草菌丝提取物对二甲基亚硝胺大鼠肝窦内皮细胞损伤和表型改变的影响

目的 探讨虫草菌丝提取物(CME)对二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞(SECs)损伤和表型改变的影响.方法 采用DMN复制大鼠肝纤维化模型,分别于3 d、2周、4周作为观察时相点;透射电镜观察肝组织超微结构,免疫组织化学法观察肝窦壁CD44、Ⅷ因子相关抗原(vWF);放射免疫法测定血清透明质酸(HA)含量.造模同时给予CME 0.74 g/kg灌胃,每日1次,共4周.结果 DMN造模后第3天,CD44染色减弱、vWF阳性染色明显增强,SECs窗孔减少,血清HA含量显著升高(P<0.05),4周时可见SECs失窗孔和SECs下基底膜形成;CME早期(3 d)能够使SECs失窗孔减轻;CME灌胃2周、4周后,大鼠血清HA水平下降(P<0.05),肝窦壁CIM4表达增强、vWF阳性染色减弱(P<0.05),SECs失窗孔和SECs下基底膜形成减轻.结论 CME能够减轻DMN大鼠肝窦内皮细胞损伤和表型改变,抑制肝窦毛细血管化形成.     

Protective effect of heme oxygenase-1 on lung injury induced

Background Intratracheal instillation of blood induces self-repaired acute lung injury. However, the mechanism of repair has been unclear. Heme-oxygenase （HO）-1, which catalyzes heme breakdown, acts as an inducible defense against oxidative stress and plays an important role in inflammation. The objective of this study was to test the role of HO-1 in lung injury caused by intratracheal instillation of red cells. Methods Forty healthy, male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups： normal group, saline group, erythrocyte group, erythrocyte＋zinc-protoporphyrin （ZnPP, HO-1 inhibitor） group and saline＋ZnPP group. At 2 days after intratracheal instillation of red cells, lung tissues and lavage samples were isolated for biochemical determinations and histological measurements. Results Histological analysis revealed that administration of ZnPP worsened the acute lung injury induced by instilled erythrocytes. HO-1 was over-expressed in the erythrocyte group and in the erythrocyte ＋ ZnPP group. Compared with the erythrocyte ＋ ZnPP group, the levels of total protein, lactate dehydrogenase and tumor necrosis factor-a in the lavage were lower （P 〈0.01）, while the level of interleukin-10 was higher in the erythrocyte group （P 〈0.01）. Conclusion HO-1 protects against erythrocyte-induced inflammatory injury in lung.     

Tat融合蛋白表达载体TAT-OCT4的克隆化及蛋白表达研究

目的构建重组表达载体TAT-OCT4,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白。为进一步通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供物质基础。方法经RT-PCR获得编码人OCT4的全基因序列,连接到原核表达载体TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-OCT4,转化大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导TAT-OCT4融合蛋白的表达。表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导人皮肤成纤维（human skin fibroblasts,HSF）细胞的效果。结果成功构建了TAT-OCT4融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确。免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内。结论 TAT-OCT4融合蛋白可以安全,高效地转导入HSF细胞中。     

TAT PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对白血病细胞系K562凋亡诱导作用

目的研究基因重组HIV-1反式激活蛋白(TAT)的蛋白转导域(PTD)与BCR/ABL SH3结构域融合蛋白(PTD-BCR/ABL SH3)导入白血病细胞株(K562)的细胞后对K562细胞增殖、凋亡的影响. 方法通过台盼蓝拒染法、流式细胞术、透射电镜(TEM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)及凋亡细胞原位标记(TUNEL)等方法,测定了PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白作用于K562细胞后细胞的增殖、形态学变化、细胞凋亡和细胞周期参数的改变. 结果≥5 μmol*L-1的PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对K562细胞生长有抑制作用,浓度越高,抑制作用越强;苔盼蓝拒染法、细胞形态学、电镜超微结构、TUNEL原位杂交和FCM检测的观察证明,PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白可引起K562细胞的凋亡和坏死;FCM检测显示该融合蛋白可将细胞阻滞在G2/M期. 结论 PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白进入K562细胞后可引起细胞凋亡和坏死,导致细胞增殖抑制. 这一结果可能为慢性粒细胞性白血病(CML)的治疗提供一种新的治疗策略.     

葛根素对兔肺缺血再灌注损伤中血红素加氧酶-1的影响

目的:观察葛根素对兔肺缺血再灌注损伤(IRI)中血红素加氧酶-1(HO-1)的影响.方法:30只健康日本大耳白兔随机分成假手术对照组(C组)、肺缺血再灌注组(IR组)和葛根素组(Pur组).复制兔单侧肺缺血再灌注损伤模型,对比观察各组肺湿干重比(W/D)、肺泡损伤数(IAR)、HO-1活性、HO-1mRNA及其蛋白的表达.结果:IR组与Pur组W/D、IQA均比C组为高(P＜0.01),但Pur组显著低于IR组(P＜0.01);与C组相比,IR组HO-1活性、HO-1mRNA及其蛋白表达增加(P＜0.01),Pur组上升更加显著(P＜0.01).结论:葛根素能增加HO-1的活性,上调HO-1mRNA及其蛋白的表达,对肺缺血再灌注损伤有明显的保护作用.     

HLA衍生肽对大鼠脾细胞增殖功能及HO-1活性的影响

目的观察一种新型组织相容性白细胞抗原(histocompatibility leukocyte antigen, HLA)衍生肽(RDP1258)的免疫抑制功能并探讨其机制.方法人工固相合成一种HLA衍生肽(RDP1258),用 3 H-TdR法观察其在体外对大鼠脾细胞增殖反应的影响,以酶化学法观察其对脾细胞血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)活性的影响.结果 RDP1258可显著抑制淋巴细胞转化及MLR的增殖反应;该肽体外降低HO活性呈现出剂量依赖性.结论 RDP1258能够显著抑制大鼠脾细胞经丝裂原或同种抗原刺激引起的增殖反应,这种作用可能是通过影响HO-1活性而达到的.     

TAT／LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究

目的：表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT／LMP-3,观察融合蛋白TAT／LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能．方法：采用基因工程技术构建原核表达载体pET43．1a—TAT／LMP-3和pET43．1a—LMP-3并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni—NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体．将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响．结果：成功地构建了pET43．1a—TAT—LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT／LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT／LMP-3纯度大于90％．成功制备了TAT／LMP-3的兔源性多克隆抗体．Western Blot分析证实TAT—LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT／LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化．结论：成功进行了TAT／LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT／LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础．     

帕瑞昔布对缺血再灌注后肺组织血红素加氧酶-1表达水平及凋亡程度的影响*

目的 探讨不同剂量帕瑞昔布对大鼠肺缺血再灌注（IR）后肺组织内血红素加氧酶-1（HO-1）表达水平及凋亡程度的影响。方法 随机将40只雄性SD大鼠（280～300?g）分为5组：对照组（C组）、缺血再灌注组（IR组）、帕瑞昔布低剂量组（L组，2?mg/kg）、帕瑞昔布中剂量组（M组，10?mg/kg）及帕瑞昔布高剂量组（H组，20?mg/kg）。复制单侧肺IR模型，检测肺内丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）含量、肺组织湿重/干重，观察肺组织病理改变及凋亡情况，检测肺内HO-1表达。结果 与C组比较，其他4组肺内MDA和MPO含量、肺组织湿重/干重、肺内凋亡细胞均增加（P?<0.05），IR组增加最多，L组次之，M组和H组增加最少，且M组和H组差异无统计学意义（P?>0.05）。肺IR后，IR组肺损伤最严重，不同剂量帕瑞昔布处理后，肺损伤均减轻，M组和H组较L组减轻更明显。C组内HO-1表达低，其余4组均升高（P?< 0.05），其中L组较IR组升高，M组和H组较L组进一步升高，M组和H组差异无统计学意义（P?>0.05）。结论 帕瑞昔布可减轻肺IR损伤，在一定程度呈剂量依赖性，其机制可能与增加肺组织中HO-1表达有关。     

苦参碱防治肝血窦内皮细胞冷缺血-再灌注损伤

目的：探讨苦参碱对大鼠原位肝移植中肝血窦内皮细胞冷缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制。方法：应用大鼠原位肝移植模型，供肝保存5h，168只大鼠随机分为对照组、小剂量治疗组、大剂量治疗组和假手术组，分别检测移植术后1、2、4、24h血透明质酸(HA)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量，并观察肝血窦内皮细胞形态学的改变。结果：与对照组比较，治疗组术后各时间点的HA和ICAM-1表达均显著减少，NO含量增加，TNF—α、MDA、SOD水平均明显降低，肝血窦内皮细胞形态出现改善。结论：苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血-再灌注中肝血窦内皮细胞损伤具有保护作用。     

Over-expression of heme oxygenase-1 does not protect porcine endothelial cells from human xenoantibodies and complement-mediated lysis

Accommodated organs can survive in the presence of anti-organ antibodies and complement. Heme oxygenase-1 (HO-1) is essential to ensure accommodation in concordant xenotransplant models. However, whether induction of HO-1 over-expression could protect porcine endothelial cells (PECs) against human xenoantibodies and complement-mediated lysis and induce an in vitro accommodation is still unknown. The SV40-immortalized porcine aorta-derived endothelial cell line (iPEC) was pre-incubated with 20, 50, or 80 μmol/L of cobalt-protoporphyrins IX (CoPPIX) for 24 h, and the HO-1 expression in iPECs was analyzed by using Western blotting. CoPPIX-treated or untreated iPECs were incubated with normal human AB sera, and complement-dependent cytotoxicity (CDC) was measured by both flow cytometry and lactate dehydrogenase (LDH) release assay. In vitro treatment with CoPPIX significantly increased the expression of HO-1 in iPECs in a dose-dependent manner. Over-expression of HO-1 was successfully achieved by incubation of iPECs with either 50 or 80 μmol/L of CoPPIX. However, HO-1 over-expression did not show any protective effects on iPECs against normal human sera-mediated cell lysis. In conclusion, induction of HO-1 over-expression alone is not enough to protect PECs from human xenoantibodies and complement-mediated humoral injury. Additionally, use of other protective strategies is needed to achieve accommodation in pig-to-primate xenotransplantation.     

脆性组氨酸三联体基因与HIV-TAT蛋白转导域融合蛋白表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：制备脆性组氨酸三联体（FHIT）基因与HIV-TAT蛋白转导域的融合蛋白FHIT/TAT以及该融合蛋白的兔抗多克隆抗体,探讨FHIT基因对肝肿瘤的作用及其机制.方法：构建FHIT基因与HIV-TAT蛋白转导域的融合蛋白表达载体,确定该载体的最佳诱导表达条件,在大肠杆菌中大量表达并获得纯化的FHIT/TAT融合蛋白,同时以该融合蛋白免疫兔制备抗FHIT/TAT融合蛋白的多克隆抗体.结果：构建了FHIT基因与HIV-TAT蛋白转导域的融合蛋白表达载体;确定了该载体的最佳诱导表达条件;Western Blot检测也证实了该融合蛋白在大肠杆菌中的表达;以此为基础在大肠杆菌中大量表达并获得了70%纯度的FHIT/TAT融合蛋白;同时制备了较高滴度的兔抗FHIT/TAT融合蛋白多克隆抗体.结论：成功建立了制备具有高效转导作用的HIV-TAT蛋白转导域与FHIT基因融合蛋白的原核表达体系,获得了该融合蛋白的兔抗多克隆抗体,为FHIT基因对于肝肿瘤的作用及其机制研究,特别是肝肿瘤的基因治疗和预防等打下了良好的基础.     

扶正化瘀方增加毛细血管化肝窦内皮细胞窗孔结构

目的：体外实验探讨扶正化瘀方对毛细血管化肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)窗孔 变化的影响。方法：扶正化瘀方药物粉末以0.46 g/kg大鼠体质量的剂量配制成悬液,给予10只Sprague Dawley (SD)大 鼠灌胃,采取二次重复给药方式,1 h后心脏采血提取扶正化瘀方药物血清(扶正化瘀方组,n=10),同法以三蒸水灌 胃10只SD大鼠,提取血清作为对照血清(对照组,n=10)。两组血清均以10%的浓度配成培养基,以其培养体外传代 的LSECs,观察不同条件下体外传代的LSECs vWF和CD31的蛋白表达情况,并用电镜观察LSECs窗孔结构的变化。 结果：1)免疫细胞化学及Western印迹结果均显示：扶正化瘀方组体外传代的LSECs表达vWF和CD31蛋白均较对 照组明显下调,扶正化瘀方组vWF 和CD31的灰度值分别为0.548±0.020和0.262±0.010,对照组分别为0.845±0.090和 0.383±0.010,两组比较差异均有统计学意义(分别t=5.18,9.61,均P<0.05)。2)扫描电镜显示：对照组LSECs大部分窗 孔处于闭塞甚至消失状态,而扶正化瘀方组LSECs表面窗孔的数目明显增多、增大。结论：扶正化瘀方可抑制肝窦内 皮细胞vWF和CD31的表达,增加细胞表面的窗孔结构,具有潜在的逆转肝窦毛细血管化的作用。     

莪术醇对小鼠肝窦内皮细胞结构的影响及其对肝内血管新生的抑制作用

目的:探讨莪术醇对小鼠肝窦内皮细胞(LSEC)结构的影响,阐明其对LSEC介导的肝内血管新生的作用.方法:30只SPF级KM小鼠使用灌注及消化法分离原代LSEC,将其分为空白对照组、模型组、莪术醇组和丹参酚酸B组,空白对照组仅用普通培养基处理;模型组用100μg·L-1廋素进行活化,培养细胞48 h;莪术醇组先用45 ...