自然杀伤细胞参与脑缺血后损伤的作用机制

目的 探讨自然杀伤细胞(NK)参与脑缺血后损伤的作用机制.方法 ①体内实验:免疫荧光检测永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)小鼠模型脑组织中NK细胞浸润情况以及干扰素(IFN)-γ表达情况;流式细胞术检测pMCAO小鼠模型脑中NK细胞浸润数目和IFN-γ表达;腹腔注射NK细胞中和抗体,流式细胞术检测pMCAO小鼠12 h脑内NK细胞浸润情况.②体外实验:建立体外血脑屏障并加入NK细胞和荧光标识的牛血清白蛋白(BSA-FITC),氧糖剥夺(OGD)实验6h后荧光分光光度计检测血脑屏障通透性;将NK细胞与小鼠神经细胞共培养,并加入IFN-γ阻断剂,OGD6h后流式细胞术检测神经细胞凋亡.结果 ①体内实验示pMCAO小鼠脑中有NK细胞浸润和IFN-γ表达,与非缺血侧相比,缺血侧的NK细胞浸润显著增多并于12 h达到高峰(P12h＜0.001);脑缺血组织中浸润的NK细胞表达IFN-γ与非缺血侧相比增多(P12h＜0.001、P24h＜0.01、P96h ＜0.05);清除体内NK细胞后,pMCAO小鼠脑内NK细胞浸润显著减少(P＜0.001),脑内IFN-γ表达显著下降(P ＜0.001).②体外实验示OGD条件下,NK细胞组与对照组相比,BSA-FITC渗透显著增多(P＜0.01);NK细胞可促进神经细胞死亡(P＜0.01).结论 NK细胞参与脑缺血损伤过程;NK细胞通分泌IFN-γ加重血脑屏障破坏和神经细胞损伤.     

缺血性脑卒中小鼠脑和血清中IL-17A的变化及其对缺血神经元的影响

目的观察白介素-17A(IL-17A)在小鼠缺血性脑卒中血清和脑脊液的变化。在离体氧糖剥夺(OGD)模型和基因敲除小鼠中,进一步探讨IL-17A在神经元缺血损伤中可能的作用及其损伤途径。方法建立小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)和脑皮层原代神经元氧糖剥夺(OGD)模型,用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测6及12 h和1、3及7 d的血清(n=7)、脑脊液和12 h梗死区周围皮层(n=5)IL-17A的含量,经5、10、100和500 ng/m L重组IL-17A(r IL-17A)处理后的野生小鼠(n=8)与未经r IL-17A处理的基因敲除小鼠原代神经元进行OGD(n=5),用MTS比色法和蛋白印迹方法检测其对缺血神经元的影响。结果 MCAO 1 h再灌12 h,梗死区周围脑皮层匀浆IL-17A升高(P0.001),脑脊液中IL-17A在12 h达到高峰(P0.05);MCAO 1 h再灌1 d,血清IL-17A开始升高,再灌3 d达到高峰(P0.001);r IL-17A对常氧下神经元的存活率无明显影响,但其可呈剂量依赖性明显加重OGD损伤后神经元的存活率(P0.05);OGD处理野生型(IL-17A+/+)小鼠脑皮层原代神经元,Beclin 1蛋白表达水平和Cl/pro-caspase 3的比值明显升高,缺乏IL-17A可以逆转OGD的作用(P0.05)。结论缺血性脑卒中小鼠的血清和脑脊液中IL-17A呈现不同的变化规律,IL-17A可能通过神经元的自噬和凋亡途径加重神经元缺血损伤。     

TREM2通过激活Th17细胞调节神经免疫炎症并保护局灶性脑缺血再灌注损伤北大核心CSCD

目的:探讨髓细胞触发受体2(TREM2)调节局灶性脑缺血再灌注损伤和神经免疫炎症的作用和机制。方法:对小鼠的大脑行中动脉闭塞术(MCAO)以建立局灶性缺血再灌注损伤模型,分为假手术组(sham组)和MCAO组(n=6)。小干扰RNA(siRNA)构建TREM2的沉默质粒(TREM2 siRNA组),构建TREM2过表达质粒(pcDNA-TREM2组),以及各自的阴性对照(CON siRNA)组和pcDNA组分别感染MCAO小鼠。采用IL-17抑制剂苏金单抗(SEC)联合pcDNA-TREM2处理MCAO组(MCAO+pcDNA-TREM2+SEC组)。qPCR和Western blot检测TNF-α、IL-1β、IL-17和TREM2表达;免疫荧光法检测脑部TREM2定位;TTC染色评价脑损伤程度;流式细胞术检测Th17细胞比例。结果:TREM2表达于小胶质细胞,且MCAO组TREM2表达均增加(P<0.05)。沉默TREM2诱导神经元细胞凋亡(F=206.971,P=0.001)、梗死体积和神经功能障碍评分升高(均P<0.05),TNF-α和IL-1β的mRNA水平升高,IL-10降低(均P<0.05)。过表达TREM2导致TNF-α、IL-1β表达降低,而IL-10和IL-17表达及Th17阳性细胞比例升高(均P<0.05)。与MCAO+pcDNA-TREM2组比较,MCAO+pcDNA-TREM2+SEC组的Th17细胞比例降低、神经元百分比降低,脑损伤程度增加,TNF-α、IL-1β表达升高,IL-10和IL-17表达降低(均P<0.05)。结论:过表达TREM2可通过激活Th17细胞并抑制神经炎症从而保护局灶性脑缺血再灌注损伤。     

IgG受体FcγRⅡB调节实验性自身免疫性脑脊髓炎致神经元损伤及Th17/Treg免疫平衡的作用研究

目的：探究IgG受体FcγRⅡB对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型小鼠神经元损伤与Th17/Treg失衡的作用。方法：C57BL/6小鼠随机分组为对照组、EAE组、FcγRⅡB组、EAE+FcγRⅡB组,每组15只,皮下注射MOG35-55肽诱导EAE模型,并给予FcγRⅡB慢病毒液处理;造模后每日称量小鼠体质量,进行神经功能评分,持续30 d;30 d后处死小鼠,HE染色观察脑组织病理形态学变化,LFB染色评估脊髓髓鞘结构变化,免疫荧光染色检测脊髓大脑皮质神经元核抗原（NeuN）和Caspase-3表达,TUNEL染色检测神经元细胞凋亡,ELISA检测血清IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β水平,流式细胞术分析脾脏Th17、Treg细胞比例分布,Western blot测定脊髓组织维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)与Forkhead家族转录因子3(Foxp3)蛋白表达。结果：与对照组比较,EAE组小鼠体质量下降,神经功能评分升高,脑组织内炎症细胞浸润明显,脊髓中出现脱髓鞘迹象,NeuN荧光表达强度减弱而Caspase-3荧光表达强度增强,TUNEL阳性着色细胞多,细胞...     

Th17细胞与肾缺血再灌注损伤关系的初步探讨

目的探讨Th17细胞与肾缺血再灌注损伤的关系。方法建立小鼠肾缺血再灌注损伤模型,再灌注后不同时间点收集血清和肾脾脏标本,测定血清肌酐、PAS染色评估肾损伤情况,并计数淋巴细胞。流式细胞术检测缺血再灌注损伤过程中肾及脾脏CD4+T淋巴细胞及其亚群表达变化。结果肾缺血再灌注后6 h,肾组织损伤较轻,但淋巴细胞浸润最多。再灌注后24 h,肾组织损伤最重,然而几乎无淋巴细胞浸润。与对照组相比,缺血再灌注后小鼠脾脏及肾脏中均检测到CD4+T淋巴细胞活化,其亚群Th17细胞表达增加,而Th1和Th2细胞表达水平无变化。结论肾缺血再灌注损伤早期,淋巴细胞浸润呈现"后滞效应"。Th17细胞可能参与肾缺血再灌注损伤早期的病理过程。     

急性缺血性脑卒中大鼠脑组织中Th17/Treg的变化

目的:免疫炎症反应在急性缺血性脑卒中的病理生理过程中发挥着重要的作用。具有促炎作用的辅助性T细胞17(Th17)及维持免疫耐受的调节性T细胞(Treg)是体内重要的2种免疫细胞。Th17/Treg细胞平衡是机体维持正常免疫的基础。本研究探讨急性缺血性脑卒中大鼠脑组织中Th17/Treg的变化。方法:采用线栓法制备SD大鼠急性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,以假手术组作为对照组。在MCAO术后3 d利用TTC染色观察各组大鼠脑梗死体积;采用ELISA测定脑组织中白细胞介素17A(IL-17A)和IL-10蛋白的含量;采用RT-qPCR测定脑组织中IL-17、IL-10、Foxp3和RORγt的mRNA表达水平;采用流式细胞术测定脑组织中Th17细胞和Treg细胞的比例变化。结果:与假手术组相比,MCAO组大鼠脑组织中IL-17A的含量增加,IL-10的含量减少(P0.05);RORγt和IL-17的mRNA表达水平上调(P0.05),Foxp3和IL-10的mRNA表达水平下调(P0.05);脑组织Th17细胞增多,Treg细胞明显减少(P0.05),Th17/Treg比值升高(P0.05)。结论:急性缺血性脑卒中大鼠脑组织Th17细胞增多,Treg细胞减少,表明脑梗死后大鼠脑组织中Th17/Treg的平衡被破坏,免疫炎症反应被激活。     

脑缺血/再灌注损伤中产生IL-17A的神经细胞类型鉴定

目的在离体细胞水平鉴定脑缺血/再灌注损伤中产生白细胞介素-17A(IL-17A)的脑固有神经细胞类型。方法利用原代培养小鼠脑皮层神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞1~4 h氧-糖剥夺/24 h复糖复氧(OGD/R)模拟细胞离体缺血/再灌注损伤模型,用免疫荧光双标、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)等技术,确定产生IL-17A的神经细胞类型。结果三种神经细胞中,除NeuN阳性神经元外,小胶质细胞和星形胶质细胞在OGD/R处理后,均可表达IL-17A蛋白,且分别与其特定标志物Iba-1和GFAP存在共定位现象。星形胶质细胞经过1~6 hOGD/24 h R处理后,IL-17A mRNA表达水平随OGD时间延长显著增高,且在4 hOGD/R时达高峰[(2.74±2.48),P0.001,每组n=5]。此外,OGD/R可促进星形胶质细胞表达IL-17A蛋白[(3.17±0.91),P0.05,每组n=5]。结论脑缺血/再灌注损伤中星形胶质细胞可能是产生IL-17A的主要来源。     

Th17细胞及其相关细胞因子在幽门螺杆菌感染中的作用研究

目的 探讨Th17细胞及其相关细胞因子在幽门螺杆菌(H.pylri)感染中的作用.方法 建立幽门螺杆菌感染的小鼠模型,同时设立治疗组与对照组.HE染色评价小鼠胃组织学改变;RT-PCR法检测胃组织IL-17 mRNA、IL-23 mRNA表达水平;ELISA法检测胃组织匀浆上清IL-17、IL-23含量;FCM检测脾脏单细胞悬液中Th17细胞应答情况.结果 与对照组相比,H.pylori感染组小鼠胃组织IL-17、IL-23在mRNA及蛋白水平表达均升高,脾淋巴细胞中Th17细胞比例显著升高;而且H.pylori感染组小鼠IL-17、IL-23 mRNA和蛋白含量以及脾淋巴细胞中Th17细胞比例随感染时间延长而增加;治疗组小鼠IL-17、IL-23表达量及脾淋巴细胞中Th17细胞比率,与治疗前即感染后4周的小鼠相比较均有所下降;感染后不同时期小鼠胃黏膜的炎症程度与IL-17、IL-23的表达量存在正相关.结论 H.pylori感染后可以诱导Th17细胞应答且IL-17、IL-23表达均上调;H.pylori感染后胃炎程度与胃组织1L-17、IL-23含量存在正相关.     

川芎嗪对小鼠哮喘模型Th17细胞的调控作用以及对Th17、Treg细胞平衡的影响

目的：研究川芎嗪对小鼠哮喘模型外周血中Th17、Treg细胞比例以及特征性细胞因子IL-17、IL-10水平的影响。方法：雄性BALB/c小鼠随机分成四组：正常对照组、哮喘模型组、川芎嗪治疗组以及激素治疗组。 OVA诱导激发哮喘,治疗组小鼠在第0、7、14天以及每次雾化吸入前30 min腹腔注射川芎嗪或地塞米松注射液,正常对照组用生理盐水替代OVA进行腹腔注射以及雾化吸入。小鼠的肺组织HE染色,分离外周血淋巴细胞做流式细胞学检测并ELISA法检测血清中IL-17、IL-10的水平。结果：哮喘模型组造模成功,川芎嗪治疗组及激素治疗组哮喘表现较轻微。 HE染色显示哮喘模型组小鼠肺组织在支气管以及小血管周围发现大量的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润;而川芎嗪治疗组和激素治疗组小鼠的肺组织切片中仅发现少量的炎性细胞。流式细胞仪检测显示哮喘组小鼠的Treg细胞较正常组小鼠比例明显降低,而Th17细胞占CD4＋T细胞显著升高;川芎嗪治疗组小鼠以及激素治疗组小鼠的变化趋势一致,Treg细胞和Th17细胞的比例趋于正常。 ELISA结果显示哮喘组小鼠的IL-17的水平显著高于正常组,IL-10的水平较正常组显著降低,川芎嗪治疗组小鼠的IL-17水平较哮喘模型组明显降低,而IL-10的水平显著升高,激素治疗组小鼠的变化趋势与川芎嗪治疗组一致。结论：在OVA诱导小鼠哮喘模型中,川芎嗪可以通过增强Treg细胞的功能,增加Treg细胞的数量,进而抑制Th17细胞的数量以及功能,减轻Th17细胞的应答,降低IL-17细胞因子的分泌,从而起到预防/控制哮喘发作的作用。     

小续命汤对OGD/R诱导HT22细胞损伤后突触可塑性的影响

目的：探讨小续命汤（XXMD）对缺血性脑卒中后脑缺血再灌注损伤突触可塑性的影响。方法：体外建立小鼠海马神经元（HT22细胞）氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,模拟脑缺血性脑卒中后海马神经元缺血再灌注损伤。采用CCK-8法检测HT22细胞活力,筛选XXMD最佳作用浓度。将HT22细胞随机分为对照组、OGD/R组和OGD/R+XXMD组,倒置荧光显微镜观察各组细胞形态变化,ELISA法测定细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,透射电镜观察细胞超微结构改变,免疫荧光染色检测神经元标志物Neu N及突触相关蛋白NF200和MAP2的荧光强度,Western blot检测各组细胞中NF200和MAP2蛋白表达水平。结果：XXMD在浓度为100 mg/L时细胞活力最强（P<0.05）。与对照组相比,模型组细胞变圆皱缩,线粒体呈现肿胀甚至空泡样改变,活力明显下降（P<0.05）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量升高（P<0.05）,NF200和MAP2的荧光强度及蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。而XXMD可改善细胞形态及超微结构,提升生存率（P&...     

异氟醚激活ERK和HIF-1α产生对神经元缺氧无糖损伤的保护作用

目的　探讨异氟醚预处理在对大鼠皮层神经元缺氧损伤中的保护作用及其可能机制。 方法　建立原代培养的大鼠皮层神经元缺氧无糖损伤（OGD）模型,采用MTT法观察异氟醚对神经元OGD损伤的保护作用,Western blot检测磷酸化ERK（pERK）和低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白表达。 结果　异氟醚预处理显著增加OGD损伤神经元中HIF-1α的蛋白含量,ERK抑制剂PD98059可以部分阻断这种作用。 结论　异氟醚预处理对于大鼠原代皮层神经元OGD损伤具有明显的保护效果。其机制可能与通过增加pERK表达,进而调节HIF-1α的表达有关。     

IL-23/Th17轴与自身免疫性疾病

既往研究认为,自身免疫性疾病主要是Th1/Th2平衡失调所致,但就Th1细胞亚群的研究结果并不能完全解释自身免疫性疾病的发病机制.Th17细胞是新发现的CD4+辅助性T细胞亚群,IL-23是Th17细胞赖以存在,并维持其稳态及扩增,促进其分泌IL-17的必需细胞因子.目前认为,越来越多的研究表明,IL-23/Th17轴参与了多种自身免疫性疾病的病理过程.     

RAGE expression is up-regulated in human cerebral ischemia and pMCAO rats

To determine whether the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) contributes to cerebral ischemia, we evaluated RAGE expression in human cerebral ischemia and a model of permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) in rats. Biopsy specimens were obtained from 12 patients with unilateral cerebral infarction. For the pMCAO model, the middle cerebral artery (MCA) of Sprague-Dawley (SD) rats was permanently occluded. Immunohistochemistry and Western blotting were used to measure RAGE expression in the ischemic hemisphere relative to the normal hemisphere. PC12 cells subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD) were used to evaluate the role of RAGE in cell injury. As expected, cerebral ischemia patients expressed elevated levels of RAGE in the ischemic hemisphere. In 1 and 2 days pMCAO rats, levels of RAGE were higher in the ischemic hemisphere relative to the non-ischemic hemisphere, and expression was primarily located in the penumbra of the ischemic hemisphere. In PC12 cells, levels of RAGE increased after 7h of OGD culture. Notably, blockade of RAGE with a selective RAGE antibody in vitro reduced the cytotoxicity caused by OGD. The present data suggest that RAGE is up-regulated in human cerebral ischemia and pMCAO rats, suggesting a role for RAGE in brain ischemia.     

Th17细胞与气道变应性疾病

气道变应性疾病传统上认为是以Th2型免疫应答占优势的Th1/Th2细胞功能失衡所致.近年来,大量研究证实Th17细胞在气道变应性炎症中发挥重要作用,使人们对气道变应性疾病有了崭新的认识.IL-17A能促进中性粒细胞的募集、活化,促进炎症反应;IL-23-Th1轴不仅能诱导中性粒细胞性气道炎症,还能正调节嗜酸性粒细胞性气...     

Th17细胞介导肿瘤免疫的双向性及其意义

Th17细胞作为众多CD4+辅助性T细胞的一种,其标志性特点是能分泌炎性因子白细胞介素(IL-17)参与炎症反应.随着人们对炎症的深入了解,发现Th17细胞不只是发挥炎性效应,其在肿瘤的发生、发展及抗肿瘤方面也有重要的作用.研究发现,在多种肿瘤中存在Th17细胞及其相关的细胞因子,Th17细胞分泌炎性因子IL-17主动增强相关的抗肿瘤信号通路,调控抗肿瘤免疫应答.另外,固有免疫细胞IL-17+γδT细胞以及IL-17+ Foxp3T细胞不仅分泌IL-17发挥促肿瘤效应,还能协同Th17细胞参与到抗肿瘤免疫反应中,共同调控机体的抗肿瘤免疫反应.因而研究Th17细胞参与肿瘤应答的机制以及与IL-17+γδT细胞和IL-17+ Foxp3T细胞在肿瘤免疫中的相互作用关系具有重要意义.     

Th17细胞的研究进展

近20年来，Th1／Th2模型为理解CI4^＋T细胞在固有免疫和适应性免疫之间的相互影响提供了框架，近期的一些研究详细地描述了CI4^＋T细胞效应性应答的一个分支，以前从未被认知的细胞系——Th17细胞系有望改变我们对于免疫调节、免疫发病机理和宿主防御的理解。来源于初始T细胞前体分泌IL-17的效应T细胞如Th17细胞特异性分泌的众多因子正迅速地被发现，这些细胞因子参与了固有免疫系统信号通路的调节，为促使T细胞前体向Th1、Th2和Th17细胞的发育提供了不同的途径。     

Th17细胞与自身免疫性疾病

Th17细胞是近年发现的不同于Th1细胞和Th2细胞的新型CD4^＋T细胞亚群。活化的Th17细胞可分泌IL—17、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）、IL-6、粒-单核细胞集落刺激因子（GM—CSF）等多种促炎症因子,Th17细胞不适当的激活与多种自身免疫性疾病和过敏性疾病密切相关。在体内阻断Th17细胞的分化、扩增及其相关细胞因子可预防、延缓或阻止自身免疫性疾病的发生、发展。     

Neuroprotective effects of berberine on stroke models in vitro and in vivo

Berberine is an alkaloid derived from herb medicine Coptidis Rhizom. Although there are increasing evidences that berberine exhibits neuroprotective effects against ischemic brain damage, little is known about the mechanism. In this study, we investigated the effect of berberine on ischemic injury in a middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. We found that berberine improved neurological outcome and reduced ischemia/reperfusion (I/R)-induced cerebral infarction 48h after MCAO. The protective effect of berberine was confirmed in in vitro study. Berberine protected PC12 cells against oxygen-glucose deprivation (OGD)-induced injury. The results showed that berberine inhibited reactive oxygen species (ROS) generation, and subsequent release of pro-apoptotic factor cytochrome c and apoptosis-inducing factors (AIFs) evoked by OGD. Findings of this study suggest that berberine protects against ischemic brain injury by decreasing the intracellular ROS level and subsequently inhibiting mitochondrial apoptotic pathway.     

Th17细胞及白细胞介素17A在慢性气道炎症性疾病中的作用

长期以来,人们对于T淋巴细胞的研究集中在辅助性T细胞1型、2型(Th1、Th2)、调节性T细胞(Treg)以及细胞毒性T细胞(Tc)等亚群上。传统理论认为,Th1细胞介导细胞免疫,在抗胞内菌感染的过程中发挥作用;而Th2细胞介导体液免疫,与过敏性疾病以及抗寄生虫感染的过程紧密相关。Th1/Th2失衡被认为是许多疾病产生和发展的重要因素。     

组织激肽释放酶对酸敏离子通道介导的神经元缺血/再灌注损伤的影响

为了解缺血/再灌注过程中组织激肽释放酶(tissu kallikrein,TK)对神经元的保护作用与酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)激活的关系以及其可能涉及的细胞内信号通路,本研究建立大鼠原代皮层神经元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)、缺氧缺糖-酸中毒(OGD-Acidosis)损伤模型以模拟在体缺血/再灌注损伤,应用细胞免疫化学方法观察损伤前后神经元形态学的变化,并检测ASIC1a的分布变化;用活细胞计数试剂盒CCK-8了解神经元存活情况并检测Caspase-3酶活性了解神经元凋亡情况。观察OGD和OGD-酸中毒对培养神经元的存活率和Caspase-3活性的影响及TK预处理、缓激肽(bradyki-nin,BK)预处理、ASIC1a特异性和非特异阻断剂预处理对OGD-酸中毒损伤神经元上述指标的影响,并检测细胞外信号调节激酶(ERK)、C-Jun-N末端激酶(JNK)和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B或Akt(PI3K/Akt)信号通路抑制剂对TK作用的影响。结果显示:OGD-酸中毒对神经元的损伤明显重于单纯OGD,阻断ASICs的激活能提高OGD-酸中毒神经的存活率、降低Caspase-3活性;TK和BK预处理能促进OGD-酸中毒损伤神经元存活、抑制Caspase-3激活;阻断ERK和PI3K/Akt信号通路能够抑制TK促OGD-酸中毒损伤神经元存活效应。结果表明,ASICs的激活参与了OGD-酸中毒神经元损伤过程;TK对OGD-酸中毒神经元的保护作用可能是拮抗了ASICs介导的谷氨酸非依赖的神经元毒性作用,并可能与ERK和PI3K/Akt信号通路的激活有关。