克罗卡林预处理对脑缺血/再灌注大鼠水通道蛋白4表达及血脑屏障通透性的影响

目的 研究ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂克罗卡林对大鼠脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)后水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP-4)表达及血脑屏障(blood-brain-barrier,BBB)通透性的影响. 方法 30只健康雄性Wistar大鼠参照随机数目表按三组安全随机分组法分为假手术组(A组)、脑I/R对照组(B组)、脑I/R+克罗卡林组(C组),每组10只.应用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,脑缺血2 h再灌注24h后,观察动物神经行为缺损,并取脑检查.Bederson法评价动物的神经行为功能,应用苏木素-伊红(HE)染色观察病理变化,干湿重法测定脑组织含水量,并通过免疫组织化学方法检测IgG及AQP-4的表达. 结果 与A组脑含水量(78.2±1.3)%,IgG、AQP-4蛋白表达(0.0±0.0,13.6±1.5)相比,B组脑含水量(81.3±1.2)%,IgG、AQP-4蛋白表达(2.4±0.4,19.8±1.9)均明显增高(P<0.05),而C组脑含水量(79.5±0.6)%变化则差异无统计学意义(P>0.05),但IgG与AQP-4的表达(1.1±0.2,15.7±1.2)也明显升高(P<0.05);与B组相比,C组神经行为缺损评分明显减低(P<0.05),IgG、AQP-4(1.1±0.2,15.7±1.2)蛋白表达及脑组织含水量(79.5±0.6)%亦明显降低(P<0.05).结论 脑I/R损伤过程中,克罗卡林可能通过降低AQP-4的表达和BBB的通透性,减轻脑水肿,发挥脑保护作用.     

七氟醚麻醉对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织水通道蛋白9表达的影响

目的 评价七氟醚麻醉对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织水通道蛋白9( AQP-9)表达的影响.方法 成年雄性SD大鼠75只,体重230～270 g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=25):假手术组(S组)、缺血再灌注组(UR组)和七氟醚麻醉组(SE组).S组和I/R组静脉注射芬太尼10μg/kg后静脉输注芬太尼25μg·kg-1·h-1,吸入65％N2O和35％O2;SE组吸入2.0％七氟醚和35％ O2.I/R组和SE组采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h后恢复灌注.分别于再灌注6h、1、2、3和5d时测定神经功能缺陷评分和脑组织AQP-9表达,计算脑肿胀率.结果 与S组比较,I/R组和SE组再灌注6h、1、2、3和5d时神经功能缺陷评分升高,再灌注1、2、3d时脑肿胀率升高,再灌注1、2、3和5d时脑组织AQP-9表达上调(P＜0.05);与I/R组比较,SE组再灌注2和3d时神经功能缺陷评分下降,脑肿胀率降低,再灌注2、3和5d时脑组织AQP-9表达上调(P＜0.05).结论 七氟醚麻醉减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的机制与上调脑组织AQP-9的表达有关.     

PPARγ对前列腺癌细胞增殖及糖酵解的影响

目的:研究PPAR-γ基因表达对前列腺癌细胞增殖和肿瘤特殊糖酵解代谢的影响。方法:采用RNAi技术构建PPARγ低表达的腺病毒载体并转染到前列腺癌细胞株,并以空白载体为对照组,进行细胞增殖检测、细胞凋亡检测、糖酵解代谢基因及产物乳酸检测,并比较两组之间的结果差异。结果:经RNAi抑制的PPAR-γ前列腺癌细胞株与对照组相比,蛋白表达量降低至(26.00±4.06)%,增殖抑制率最大为第2天达(39.50±4.92)%,细胞凋亡率升高至(21.03±3.08)%,糖酵解代谢基因产物(Myc和Glut-1)下降,第4天培养液中乳酸浓度为对照组的69.71%,上述结果具有统计学差异(P<0.01)。结论:抑制PPAR-γ基因的表达有望成为治疗前列腺癌新方法。     

p38 MAPK抑制剂对急性胰腺炎肺损伤肺内细胞间黏附分子-1表达和肺微血管通透性的影响

目的 观察p38蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂对大鼠急性胰腺炎肺损伤(LI)肺内细胞间黏附分子(ICAM)-1表达和肺微血管通透性的影响.方法 SD大鼠36只,假手术组12只;5%的牛黄胆酸(0.1 ml/100 g)逆行注射到SD大鼠的胰胆管内,造成重症急性胰腺炎(SAP);分为SAP组12只和p38 MAPK抑制剂组(SB203580,0.5 mg/kg,静脉注射)12只.各组在3、6、12 h分别剖杀大鼠,检测肺组织的含水量、肺组织髓过氧化物酶(MPO);免疫组织化学检测肺组织p38 MAPK的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织ICAM-1 mRNA表达水平;检测肺微血管通透性Balf/Serum FITC比率;光镜F检测肺组织组织损害.结果 假手术组肺组织含水量、MPO、肺组织病理评分、ICAM-1 mRNA分别为3.41±0.05、1.48±0.10、0和0.48±0.03;SAP组在3、6、12 h肺组织含水量分别为为3.77±0.12、3.87±0.11和4.03±0.05,SB治疗组分别为3.53±0.07、3.57±0.05和3.69±0.09,SAP组MPO分别为2.17±0.42、4.65±0.26和7.70±0.01,SB治疗组分别为1.72±0.14、2.46±0.29和5.63±0.15;SAP组肺组织病理评分分别为3.16±0.03、5.33±0.05和7.18±0.02,SB治疗组分别为3.12±0.02、5.26±0.03和7.13±0.02;;SAP组ICAM-1 mRNA在6、12 h表达为1.45±0.04和1.65±0.06,SB治疗组分别为1.19±0.06和0.96±0.05.SAP组和SB治疗组上述指标较假手术组升高(P<0.05),但SB治疗组较SAP组下降(P<0.05);而且肺组织p38 MAPK表达和ICAM-1 mRNA表达一致,在12 h达高峰.结论 急性胰腺炎肺损伤可能与肺组织中p38 MAPK和ICAM-1 mRNA过度表达有关;p38 MAPK抑制剂可抑制肺内ICAM-1表达,降低肺微血管通透性,减轻急性胰腺炎肺损伤.     

大鼠肝缺血再灌注损伤NF-κB与ICAM-1在脑组织的表达及意义

目的:观察大鼠在肝脏缺血再灌注(IR)过程中肝脏炎性细胞因子TNF-α、IL-1βmRNA表达与脑组织NF-κB、ICAM-1表达之间的关系,探讨肝脏IR是否可导致脑组织损伤及其可能的机制.方法: 选健康雄性Wister大鼠48只,随机分为对照组、缺血30min组(I组)、缺血30min再灌注组(IR组)、缺血30min再灌注后1h组(IR 1h组)、缺血30min再灌注后2h组(IR 2h组)、缺血30min再灌注后4h组(IR 4h组),每组8只.应用免疫组化法分别检测各组大鼠肝脏TNF-α及脑皮质、海马和下丘脑区NF-κB、ICAM-1的表达情况,应用原位杂交的方法检测肝脏IL-1βmRNA表达情况.结果:肝脏IR导致肝脏明显的损伤,表现为血清GPT、AKP、γ-GT升高(P<0.01),肝组织中TNF-α、IL-1βmRNA表达显著增加(P<0.01),肝细胞水肿,炎性细胞浸润,甚至细胞坏死.随着再灌注时间的延长,脑组织HE染色可见脑细胞水肿,甚至个别脑细胞坏死.与对照组比较, I组和IR组大鼠脑皮质、海马和下丘脑中NF-κB、ICAM-1表达的差异无统计学意义(P>0.05),IR 1h组、IR 2h组和IR 4h组的差异有统计学意义(P<0.05 ,P<0.01).IR 1h、IR 2h、IR 4h组与对照组、I组、IR组比较,各部位脑组织NF-κB、ICAM-1的表达显著增加(P<0.05或P<0.01).各组大鼠不同部位脑组织间NF-κB、ICAM-1表达无统计学意义(P>0.05).结论:肝脏IR对脑组织可产生损伤性影响,NF-κB、ICAM-1介导的炎性细胞反应,参与了脑组织损伤的发生机制.     

罗格列酮保护大鼠重症急性胰腺炎肾损伤的机制

目的 探讨高选择性过氧化物酶体增殖物激活受体-γ( PPAR-γ)的激动剂罗格列酮(ROSI)保护大鼠重症急性胰腺炎(SAP)肾损伤的可能机制.方法 将雄性Wistar大鼠54只随机分为假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)和罗格列酮处理组(ROSI组),每组大鼠18只.胆胰管逆行注射5％牛磺胆酸钠制备重症急性胰腺炎模型.ROSI组造模前30 min经股静脉注射10％二甲基亚砜(DMSO)溶解的罗格列酮(6 mg/kg);SO组、SAP组则经股静脉注射等量10％DMSO(0.2 ml/100 g).术后3、12、24h分批剖杀大鼠,每个时间点6只.分别取肾组织检测一氧化氮(NO)及其合成酶(iNOS)的水平和核转录因子-κB( NF-κB)/p65蛋白表达水平,并观察不同时间点组大鼠肾脏肿瘤坏死因子-α( TNF-α)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的mRNA及蛋白表达.结果 SAP组各时点NO含量分别为(2.34±0.31)、(7.73 ±0.48)、( 17.33±0.89) mg/g;SAP组各时点NF-κB/p65含量分别为30648.11 ±2655.13、53 654.63±3065.94、70 546.85±5046.55;SAP组各时点TNF-α表达水平为4.18±0.61、5.69 ±0.82、11.86±2.49;SAP组各时点ICAM-1表达水平为3.68±0.58、6.48 ±0.76、8.62±1.09,均与SO组各时间点比较显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);ROSI组12、24h时点NO含量分别为(4.10±0.62)、(6.09±0.79) mg/g;ROSI组24h时点NF-κB/p65含量为30468.48±2684.59; ROSI组24h时点TNF-α表达水平为6.60±1.34;ROSI组24h时点ICAM-1表达水平为2.92±0.88,均较SAP组下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 罗格列酮通过抑制NF-κB的表达,从而减少TNF-和ICAM-1的产生,减轻炎症反应的发生发展,显示其参与了保护重症急性胰腺炎所诱发的肾损伤机制.     

肠缺血再灌注损伤大鼠小肠运动功能的变化与细胞间黏附分子1表达的关系

目的 探讨肠缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion,IIR)损伤大鼠小肠运动功能的变化及其与细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的关系.方法 将Wistar大鼠30只随机分为ⅡR组、ICAM-1单抗组和假手术组,ⅡR组采用夹闭-放开肠系膜上动脉的方法建立IIR损伤模型,ICAM-1单抗组于阻断肠系膜上动脉血供同时静脉给予ICAM-1单克隆抗体1 mg/kg.用荧光分光光度法测定各组大鼠小肠传输功能,多导生理仪测定环行肌条收缩能力的变化,RT-PCR法检测小肠肌层ICAM-1 mRNA的表达量,免疫组化法检测ICAM-1蛋白表达,图像分析系统计数小肠肌层浸润白细胞数量,比色法测定小肠肌层组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性.结果 ICAM-1单抗组较ⅡR组大鼠小肠传输功能明显改善,几何中心分别为8.4±0.7和3.4±0.5;两组环形平滑肌条收缩力为(1.81±0.28)g/mm2·s-1和(0.52±0.09)g/mm2·s-1;浸润白细胞数量为(5.6±2.2)c/f和(18.2±3.1)c/f;MPO活性为(2.03±0.56)U/g和(6.41±1.25)U/g,两组各项指标之间比较差异均有统计学意义(P＜O.05).两组小肠肌层ICAM-1 mRNA的表达量为1.69±0.57和1.76±0.32,差异无统计学意义(P＞0.05).IIR组和ICAM-1单抗组小肠肌层均有大量棕色颗粒样染色.结论IIR损伤上调小肠肌层ICAM-1 mRNA的表达,介导中性粒细胞的黏附和浸润,导致小肠运动功能的障碍.

Abstract：

Objective To evaluate the relationship between the intestinal motility alterations and intercellular adhesion molecule-1 ( ICAM-1 ) expression within the rat intestinal muscularis after ischemia reperfusion. Methods Thirty Wistar rats were divided randomly into IIR, monoclanal anti-ICAM-1 and sham group (n = 10), HR models were established by clamping-releasing the superior mesenteric artery. Gut transit was measured in vivo and intestinal circular muscle contractions were measured in an organ bath. The expression of ICAM-1 mRNA was detected by RT-PCR and immunohistochemisty. Leukocyte infiltration and myeloperoxidase (MPO) activity were quantified in sham and ischemia/reperfusion rats with and without monoclonal anti-ICAM-1 antibody treatment. Results The gut transit of monoclonal anti-ICAM-1 group was improved obviously as compared with IIR group. Circular smooth muscle contractility stimulated by ICAM-1 mRNA expression was 1.69 ± 0. 57 and 1.76 ± 0. 32 within the muscularis; Leukocyte infiltration into the muscularis was (5.6 ±2. 2) c/f and ( 18. 2 ±3. 1 ) c/f. MPO activity was (2. 03 ±0. 56) U/g and (6. 41 ± 1.25 ) U/g respectively. The differences were all statistically significant between IIR and treatment groups ( P ＜ 0. 05 ). The expression of ICAM-1 protein in IIR and anti-ICAM-1 groups was not significantly different (P ＞ 0. 05). Conclusions The up-regulated expression of ICAM-1 after ⅡR injury calls forth local infiltration of PMN within the intestinal muscularis, leading to intestinal motility dysfunction.     

罗格列酮对大鼠急性胰腺炎肺损伤黏附分子表达的作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮(ROSI)对大鼠急性胰腺炎肺损伤(APALI)黏附分子的作用及其机制.方法 雄性Wistar大鼠54只,随机分为假手术组(SO组)、急性胰腺炎组(SAP组)和罗格列酮预处理组(ROSI组).胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备急性胰腺炎模型.ROSI组造模前30 min经股静脉注射10%二甲基亚砜(DMSO)溶解的罗格列酮(6 mg/kg);SO组、SAP组则注射等量10%DMSO.术后3 h、6 h、12 h分批剖杀大鼠,每个时间点6只.检测血清淀粉酶(AMY)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)、肺湿干比(W/D),取肺组织行病理学检查;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素和E_选择素mRNA表达水平.结果 SAP组各时间点AMY、MPO、W/D和肺组织病理评分均较S0组升高(P<0.05);ROSI组上述指标较SAP组下降,AMY、MPO、W/D和病理评分在6 h、12 h差异有统计学意义(P<0.05).SAP组ICAM-1、P-选择素和E-选择素mRNA表达在12 h达高峰,均较SO组12 h升高(P<0.05),ROSI组上述指标mRNA表达在12 h点均较SAP组下降(P<0.05).结论 罗格列酮通过抑制肺组织IcAM-1、P-选择素和E-选择素的表达,减轻急性胰腺炎肺损伤程度.     

罗格列酮对大鼠急性胰腺炎肺损伤黏附分子表达的作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮(ROSI)对大鼠急性胰腺炎肺损伤(APALI)黏附分子的作用及其机制.方法 雄性Wistar大鼠54只,随机分为假手术组(SO组)、急性胰腺炎组(SAP组)和罗格列酮预处理组(ROSI组).胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备急性胰腺炎模型.ROSI组造模前30 min经股静脉注射10%二甲基亚砜(DMSO)溶解的罗格列酮(6 mg/kg);SO组、SAP组则注射等量10%DMSO.术后3 h、6 h、12 h分批剖杀大鼠,每个时间点6只.检测血清淀粉酶(AMY)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)、肺湿干比(W/D),取肺组织行病理学检查;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素和E_选择素mRNA表达水平.结果 SAP组各时间点AMY、MPO、W/D和肺组织病理评分均较S0组升高(P<0.05);ROSI组上述指标较SAP组下降,AMY、MPO、W/D和病理评分在6 h、12 h差异有统计学意义(P<0.05).SAP组ICAM-1、P-选择素和E-选择素mRNA表达在12 h达高峰,均较SO组12 h升高(P<0.05),ROSI组上述指标mRNA表达在12 h点均较SAP组下降(P<0.05).结论 罗格列酮通过抑制肺组织IcAM-1、P-选择素和E-选择素的表达,减轻急性胰腺炎肺损伤程度.     

罗格列酮对大鼠急性胰腺炎肺损伤黏附分子表达的作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂罗格列酮(ROSI)对大鼠急性胰腺炎肺损伤(APALI)黏附分子的作用及其机制.方法 雄性Wistar大鼠54只,随机分为假手术组(SO组)、急性胰腺炎组(SAP组)和罗格列酮预处理组(ROSI组).胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备急性胰腺炎模型.ROSI组造模前30 min经股静脉注射10%二甲基亚砜(DMSO)溶解的罗格列酮(6 mg/kg);SO组、SAP组则注射等量10%DMSO.术后3 h、6 h、12 h分批剖杀大鼠,每个时间点6只.检测血清淀粉酶(AMY)、肺组织髓过氧化物酶(MPO)、肺湿干比(W/D),取肺组织行病理学检查;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、P-选择素和E_选择素mRNA表达水平.结果 SAP组各时间点AMY、MPO、W/D和肺组织病理评分均较S0组升高(P<0.05);ROSI组上述指标较SAP组下降,AMY、MPO、W/D和病理评分在6 h、12 h差异有统计学意义(P<0.05).SAP组ICAM-1、P-选择素和E-选择素mRNA表达在12 h达高峰,均较SO组12 h升高(P<0.05),ROSI组上述指标mRNA表达在12 h点均较SAP组下降(P<0.05).结论 罗格列酮通过抑制肺组织IcAM-1、P-选择素和E-选择素的表达,减轻急性胰腺炎肺损伤程度.     

异丙酚预先给药对大鼠局灶性脑缺血再灌注时脑组织p-JNK、MMP-9和AQP-4表达的影响

目的 评价异丙酚预先给药对大鼠局灶性缺血再灌注时脑组织磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和水通道蛋白-4(AQP-4)表达的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠72只,体重250～280g,随机分成4组(n=18):假手术组(S组);脑缺血再灌注组(IR组)于缺血前30 min腹腔注射生理盐水10ml/kg;不同浓度异丙酚预先给药组(P1组和P2组)于缺血前30 min分别腹腔注射0.5%或1%异丙酚10 ml/kg.IR组、P1组和P2组采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2 h,再灌注24 h.大鼠清醒后,进行神经功能缺陷评分.再灌注24 h时处死大鼠,处死前1 h股静脉注射2%伊文氏蓝(EB)溶液3 ml/kg,处死后取脑组织,测定含水量、EB含量、p-JNK、MMP-9和AQP-4的表达水平.结果 与S组比较,IR组、P1组和P2组神经功能缺陷评分、脑组织含水量和EB含量升高,p-JNK、MMP-9和AQP-4的表达上调(P＜0.05);与IR组比较,P1组和P2组神经功能缺陷评分、脑组织含水量和EB含量降低,p-JNK、MMP-9和AQP-4的表达下调(P＜0.05);与P1组比较,P2组脑组织p-JNK和MMP-9的表达下调(P＜0.05),神经功能缺陷评分、脑组织含水量、EB含量和AQP-4表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 异丙酚预先给药可通过抑制JNK信号通路的激活,抑制脑组织MMP-9和AQP-4的表达上调,减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤.     

6%羟乙基淀粉血液稀释对大鼠全脑缺血/再灌注后ICAM-1表达的影响

目的 研究6％羟乙基淀粉(贺斯,200/0.5)血液稀释对大鼠全脑缺血/再灌注期血管内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法84只Wistar大鼠分为假手术组(S组)、缺血/再灌注组(Ⅰ组)和6％贺斯血液稀释组(H组),其中Ⅰ组和H组又各分为缺血10分钟再灌注2h、4h、8h和12h组,采用免疫组织化学方法检测脑组织ICAM-1的表达。结果Ⅰ组和H组再灌注2h、4h、8h和12h时ICAM-1的表达均较S组高(P均<0.01);H组再灌注2h、4h、8h和12h ICAM-1的表达均较Ⅰ组相应时间点低(P均<0.05)。结论(1)脑缺血/再灌注时血管内皮细胞ICAM-1的表达增加;(2)6％贺斯血液稀释降低再灌注早期阶段脑组织血管内皮细胞ICAM-1的表达。     

腹膜间皮细胞过氧化物酶体增殖物活化受体γ的表达及其配体对CD40和细胞间黏附分子1的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPAR-γ）在大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）中的表达以及脂多糖（LPS）的调节作用，并探讨PPAR-γ天然配体15d-PGJ2及人工合成配体ciglitazone对RPMCs表达CD40和ICAM-1的影响。方法分离及培养RPMCs，常规传代及鉴定，取第2代细胞用于实验研究。LPS不同浓度（0．1、1．0、10、50及100μg／ml）、LPS（1μg／ml）处理后不同时间点及15d-PGJ2（3μmol／L）、ciglitazone（10μmol／L）作用细胞36h后收集细胞。RT-PCR检测PPAR-γ、CD40以及ICAM-1 mRNA表达。免疫细胞化学检测PPAR-γ在RPMCs中的分布。Western印迹检测PPAR-γ及ICAM-1蛋白表达。结果（1）常规培养的RPMCs表达一定量PPAR-γ，表达部位主要分布于RPMCs细胞核内，在细胞浆微弱表达。（2）随着LPS浓度逐渐增大，PPAR-γ蛋白表达水平呈逐渐增高的趋势，LPS浓度为10μg／ml时其表达为最高峰。LPS（1μg／ml）作用12h时PPAR-γ蛋白表达最强，PPAR-γ1表达高于PPAR-γ2；之后显著降低，持续至72h。（3）LPS刺激后RPMCs CD40mRNA表达显著增强；15d-PGJ2、ciglitazone显著降低CD40 mRNA表达（P均〈0．01）。（4）LPS刺激后RPMCs ICAM-1蛋白表达显著增加：15d-PGJ2增加LPS介导的ICAM-1 mRNA表达（P〈0.01），但显著抑制ICAM-1蛋白表达（P〈0．05）。ciglitazone对LPS介导的ICAM-1 mRNA和蛋白表达均有显著抑制作用（P均〈0．05）。结论RPMCs结构性表达PPAR-γ。LPS调节PPAR-γ表达呈现先增强后抑制趋势。PPAR-γ配体可显著抑制LPS介导的CD40mRNA和ICAM-1蛋白的表达。提示RPMCs功能性表达PPAR-γ．可能通过负性调节炎症介质分泌而参与腹腔局部防御。     

靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ基因siRNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建、鉴定靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPAR-γ)基因的siRNA腺病毒载体.方法 遵循siRNA片段的设计原则,依据GenBank中PPARγ基因(AF013266)的序列,设计3个特异性靶序列(36～54位、73～91位和404～422位);体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其克入pSIREN-Shuttle载体,通过PCR和I-Ceu I和PI-Sce I酶切鉴定后,再亚克隆入pAdeno-X腺病毒载体.对插入序列进行DNA序列分析.结果 发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后,电泳可见明亮靶条带;PCR扩增和酶切鉴定得到阳性克隆pSIREN-Shuttle-siPPARγ-1、pSIREN-Shuttle-siPPARγ-2和pSIREN-Shuttle-siPPARγ-3.亚克隆重组腺病毒载体pAdeno-X siPPARγ1、pAdeno-X-siPPART-2和pAdeno-X-siPPARγ-3,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论 成功构建3个靶向PPARγ基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步的基因治疗研究奠定了实验基础.     

曲格列酮保存液对大隐静脉黏附分子和一氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)配体-曲格列酮是否能够减轻所保存的大隐静脉血管内皮细胞损伤.方法 9例CABG的大隐静脉移植血管自身配对分为对照组(自体肝素化血液保存组)和实验组(含20 μmol/L曲格列酮自体肝素化血液保存组)室温下保存1 h,采用免疫组织化学和Western免疫印迹法检测黏附分子和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达,以及酶化学法测定血管组织中髓过氧化物酶(MPO)活性.结果 在实验组黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达分别为(753±132、3731±294)明显低于对照组(7201±934、8292±793,P＜0.01);而实验组eNOS表达(7983±834)明显高于对照组(3989±1008,P＜0.01),血管组织MPO活性明显低于对照组[(1.52±0.42)、(5.04±1.26)U/g,P＜0.01].结论 PPARγ配体-曲格列酮保存液能够减轻大隐静脉内皮细胞激活和减少白细胞黏附,对静脉移植血管具有一定保护作用.     

羟乙基淀粉对重症急性胰腺炎大鼠肝脏水通道蛋白-1表达及肝脏损伤的影响

目的 研究羟乙基淀粉130/0.4(万汶)对重症急性胰腺炎大鼠肝脏水通道蛋白-1(AQP-1)表达及肝脏损伤的影响.方法 将雄性SD大鼠48只按完全随机法分为假手术组(sham operation group,Sham组)、重症急性胰腺炎组(severe acute pancreatitis,SAP组)、羟乙基淀粉治疗组(HES组),每组分6 h、24 h两个时间点,每个时间点8只.以5%牛磺脱氧胆酸钠逆行胰胆管注射建立SAP模型.各组于造模后6 h、24 h处死大鼠,检测血淀粉酶(AMY),谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),肝脏含水量,HE染色观察胰腺、肝脏组织病理,酶联免疫吸附(ELISA)方法检测血清TNF-α水平,RT-PCR检测肝组织AQP-1mRNA,免疫组化检测肝组织AQP-1蛋白.结果 各时间点SAP组与假手术组比较,血淀粉酶、ALT、AST、肝脏含水量、血清TNF-α水平、AQP-1mRNA及AQP-1蛋白均显著上调(P＜0.05);HES组与SAP组比较,血淀粉酶、ALT、AST、肝脏含水量、血清TNF-α水平、AQP-1mRNA及AQP-1蛋白均显著下调(P＜0.05).6 h时间点,Sham组、SAP组和HES组AQP-1mRNA表达量分别为(0.402±0.023)mmol/L、(0.811±0.032)mmol/L和(0.595±0.015)mmol/L,3组间差异有统计学意义(P＜0.05);24 h时间点,各组AQP-1mRNA表达量分别为(0.412±0.017)mmol/L、(0.823±0.029)mmol/L和(0.607±0.021)mmol/L,3组间差异有统计学意义(P＜0.05).6 h时间点,Sham组、SAP组和HES组AQP-1蛋白表达分别为(2.07±0.25)、(6.90±0.38)和(4.48±0.29),3组间差异有统计学意义(P＜0.05);24 h时间点,各组AQP-1蛋白表达分别为(2.32±0.31)、(7.04±0.32)和(4.56±0.25),3组间差异有统计学意义(P＜0.05).胰腺、肝脏组织病理HES组较SAP组明显改善.结论 HES130/0.4可一定程度改善重症急性胰腺炎的肝脏损伤,减轻毛细血管渗漏,AQP-1在重症急性胰腺炎肝脏损伤导致的毛细血管渗漏中起一定作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of hydroxyethyl starch (HES 130/0. 4) on the expression of aquaporin 1 (AQP-1) and liver injury in rats with severe acute pancreatitis(SAP).Methods Forty-eight male SD rats were randomly divided into three groups: Sham, SAP, and HES;each group was divided into 6 hour and 24 hour timepoints, with 8 in each subgroup. An SAP model was induced by injecting 5% sodium taurodeoxycholate into the biliary pancreatic duct. AMY, ALT,AST and water content in the liver were measured and TNF-a was examined by ELISA, and the expression of liver AQP-1mRNA was determined by RT-PCR, and the expression of liver AQP-Ⅰ protein was evaluated by immunohistochemical methods. Results Compared with the Sham group, the level of AMY, ALT, AST, TNF-a, water content, AQP-1mRNA and AQP-1 protein increased significantly in the SAP group (P＜0.05). Compared with the SAP group, the level of AMY, ALT, AST,TNF-a, water content, AQP-1mRNA and AQP-1 protein decreased significantly in the HES group (P＜0.05). At 6 hours, the expressions of liver AQP-1mRNA were (0. 402 ± 0. 023), (0. 811 ±0. 032) and (0. 595 ± 0. 015) in the Sham, SAP, and HES groups, respectively; at 24 hours, they were(0. 412 ± 0. 017), ( 0. 823 ± 0. 029) and (0. 607 ± 0. 021 ), with significant differences between each group (P＜0. 05). At 6 hours, the expressions of liver AQP-1 proteins were (2.07±0.25),(6.90±0.38)and (4.48±0.29) in the Sham, SAP and HES groups, respectively;at 24 hours, they were (2. 32±0. 31 ), (7. 04 ± 0. 32) and (4. 56 ± 0. 35), with significant differences between each group (P＜0. 05). Compared with the SAP group, the pathology of the pancreas and liver ameliorated significantly in the HES group. Conclusions Hydroxyethyl starch 130/0.4 may ameliorate liver injury of severe acute pancreatitis and alleviate the capillary leak. AQP-1 may play a role in the capillary leak caused by the liver injury of severe acute pancreatitis.     

胰腺癌黏蛋白4基因修饰的树突状细胞疫苗构建及对胰腺癌细胞的免疫效应

目的 构建含有胰腺癌相关抗原黏蛋白(MUC)4(sv12)的腺病毒载体并转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗,观察DC疫苗对胰腺癌细胞的免疫效应.方法 NCBI获得MUC4(sv12)mRNA序列,利用片段内酶切位点和重叠聚合酶链反应(PCR)技术获得MUCA(sv12)的编码序列,编码序列克隆到腺病毒载体,构建重组腺病毒(rAd-MUC4).病毒颗粒感染树突状细胞,产生活化的MUCA特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Elispot法分别检测体外杀伤活性及干扰素(IFN)-γ的表达,同时设置空病毒(GFP)组和磷酸盐缓冲液(PBS)组作为阴性对照.结果 成功构建含有胰腺癌相关抗原MUCA(sv12)基因的重组腺病毒,LDH法检测结果:MUCA特异性CTL对HLA-A2+和MUC4+Capan-1细胞的毒性[E/T=10:1时为(13.7±6.0)%,20:1时为(21.4±4.7)%,40:时为(36.1±9.5)%],高于HLA-A2+Mcf-7细胞及MUCA+Bxpe-3细胞(P<0.05).Elispot法检测结果:E/T=20:时,Capan-1细胞的MUCA组斑点数为(139.1±23.3),高于GFP组(66.0±16.4)和PBS组(30.5±4.4),P<0.05;GFP组和PBS组差异无统计学意义.结论 腺病毒介导MUCA基因修饰的DC疫苗,可以体外诱导产生特异性CTL细胞,并获得有效的HLA限制性杀伤效应.     

siRNA腺病毒载体对兔骨髓基质细胞成脂分化的干扰效应

目的 观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因siRNA腺病毒载体阻断乙醇诱导兔骨髓基质细胞(MSCs)的成脂分化.方法 培养兔MSCs随机分为7组:N:对照组,M:模型组,CO:感染空载体组,C1:感染无关siRNA组,S1、S2、S3:干扰1、2、3组.将重组腺病毒载体转染细胞,检测MSCs内PPARγ mRNA、osteocalcin mRNA、PPARγ蛋白表达、甘油三酯、ALP活性和培养液骨钙素含量,并计数脂肪细胞.结果 N、M、CO、C1组PPARγ mRNA和osteocalcinmR-NA表达值分别为(0.39±0.02)、(0.75±0.03)、(0.74±0.03)、(0.73±0.02)和(1.09±0.19)、(0.50±0.10)、(0.46±0.12)、(0.49±0.13),M、CO、C1组脂肪细胞多,甘油三酯高,ALP活性与骨钙素量均低.S1、S2、S3组PPARγ mRNA和osteocalcin mRNA表达值分别为(0.28±0.03)、(0.30±0.03)、(0.31±0.01)和(0.92±0.09)、(0.87±0.32)、(0.93±0.25),脂肪细胞数、甘油三酯量、ALP活性值与骨钙素含量均接近正常,与M、CO、C1组间差异有统计学意义(P<0.05),与N组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 该腺病毒载体能阻断乙醇诱导的MSCs成脂分化.     

胆碱酯酶抑制剂他克林对兔内毒素性脑损伤的影响

目的 评价胆碱酯酶抑制剂他克林对兔内毒素性脑损伤的影响.方法 健康成年雄性新西兰大白兔21只,体重1.7～2.3 ks,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n＝7):假手术组(S组)脑池内注射生理盐水；内毒素组(LPS组)脑池内注射内毒素200 μg/kg;胆碱酯酶抑制剂组(THA组)脑池内注射内毒素200 μg/kg和盐酸他克林150 μg/kg.注射后4h时处死动物,取脑组织,提取细胞核蛋白,采用Western blot法测定NF-κBp65表达,ELISA法测定血浆、脑脊液和脑组织TNF-α水平,采用分光光度法测定脑组织髓过氧化物酶(MPO)活性,称重后计算湿干重比.结果 与S组比较,LPS组和THA组NF-κB p65表达上调,血浆、脑脊液和脑组织TNF-α水平、MPO活性和湿干重比升高(P<0.05)；与LPS组比较,THA组NF-κB p65表达下调,血浆、脑脊液和脑组织TNF-α水平、MPO活性和湿干重比降低(P<0.05).结论 胆碱酯酶抑制剂他克林可通过抑制局部炎性反应减轻兔内毒素性脑损伤.     

电针对肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤的影响

目的:观察电针肺俞穴和足三里穴对肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤的影响。方法:40只健康雄性新西兰大白兔,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组和非穴位电针组(每组n=10)。采用夹闭股动脉3 h、再灌注4 h的方法制备兔肢体缺血再灌注损伤模型。电针组于模型制备前1～4 d(30 min/次,1次/d)及模型制备过程中电针肺俞穴和足三里穴(疏密波,刺激电流l～2 mA,频率2/15 Hz,波宽0.2～0.6 ms,以兔出现轻微肌颤为宜);非穴位电针组以相同的参数电针刺激肺俞穴和足三里穴旁开0.5 cm非经非穴处。再灌注4 h时处死兔,取肺组织行肺损伤评分,计算肺湿/干重(W/D)比值;测定肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、Western blotting法检测肺组织核因子-κBp65 (NF-κBp65)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白表达水平。结果:模型组、电针组和非穴位电针组再灌注4 h时肺组织W/D比值分别为6.75±0.36、4.90±0.23、6.68±0.39,均明显高于假手术组(3.09±0.15, P0.05);上述三组肺损伤评分分别为8.12±1.05、4.38±0.64、8.23±0.98,均明显高于假手术组(0.87±0.29, P0.05);上述三组MPO活性分别为(5.18±0.45)U/g、(3.76±0.33) U/g、(5.24±0.39) U/g,均明显高于假手术组[(1.59±0.25) U/g,P0.05];与假手术组相比,模型组、电针组和非穴位电针组ICAM-1及NF-κBp65表达水平升高;与模型组比较,电针组再灌注4 h时肺组织W/D比值、肺损伤评分、MPO活性、ICAM-1及NF-κBp65表达水平降低(P0.05)。结论:电针肺俞穴和足三里穴可减轻肢体缺血再灌注诱发的兔肺损伤,其机制可能与抑制NF-κB激活,从而减少ICAM-1介导的中性粒细胞聚集有关。