肝癌切除肝缺血再灌注损伤前后的蛋白质组学变化◆

背景:肝癌切除肝缺血再灌注损伤可促进微小转移灶的侵袭转移并引起线粒体损伤.目的:比较肝癌切除手术过程中肝正常组织缺血再灌注损伤前后蛋白质表达谱的改变,筛查发生肝缺血再灌注损伤应激的相关蛋白质分子标志物并探讨可能机制.方法:应用双向等电聚焦/聚丙烯酰胺凝胶电泳建立20例肝癌切除患者肝缺血再灌注前与灌注后15 min肝正常组织的全细胞蛋白质和线粒体蛋白质表达图谱,并进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化串联时间质谱对差异蛋白质点进行鉴定,并进行生物信息学分析.结果与结论:相同条件下对各组全细胞和线粒体蛋白样品分别进行3次双向电泳,筛选在3次电泳中均存在的差异点进行分析,在全细胞蛋白质图谱中共鉴定出5个差异蛋白,在线粒体蛋白质图谱中未鉴定出明显的差异蛋白.结果可见肝癌切除手术过程中肝缺血再灌注15 min即可使细胞骨架蛋白、热休克蛋白等细胞保护蛋白表达发生改变,同时有促进肿瘤转移的风险,需要采取预防措施降低影响,但线粒体蛋白表达基本未发生改变.     

线粒体蛋白质组学及其在疾病诊断中的应用

线粒体是提供细胞能量的细胞器,同时还参与细胞内许多重要的生理过程。随着蛋白质组学技术的发展,线粒体蛋白质组学已成为亚细胞结构蛋白质组学研究的一个典范。许多物种的线粒体及其亚结构的蛋白质组学已得到研究,并构建了一些线粒体蛋白质组数据库;对不同生理、病理状态下的线粒体蛋白质组学也进行了大量的研究,发现了一些疾病相关的线粒体蛋白质,为线粒体相关的疾病诊断和治疗提供了重要的标志物和靶标。     

线粒体蛋白质是如何进入线粒体的

肝细胞中有上百个椭园形与细胞能量代谢有关的细胞器——线粒体,而另外一些细胞中的线粒体数目可少到十多个。但每个动物细胞均含有这种细胞器。这给研究者们提出一个问题:线粒体中的近几百种蛋白质差不多都不在线粒体内合成,而是在细胞浆中合成,因此这些蛋白质是怎样进入线粒体的?又是怎样在它的内膜、外膜和嵴上正确定位的?答案似乎是存在于线粒体中的蛋白质先被合成为一些带有特殊氨基酸序列的前体蛋白。线粒体可识别这些氨基酸序列从而允许线粒体摄取这些蛋白质。在大多数情况下,     

肝癌切除肝缺血再灌注损伤前后的蛋白质组学变化

背景：肝癌切除肝缺血再灌注损伤可促进微小转移灶的侵袭转移并引起线粒体损伤。目的：比较肝癌切除手术过程中肝正常组织缺血再灌注损伤前后蛋白质表达谱的改变,筛查发生肝缺血再灌注损伤应激的相关蛋白质分子标志物并探讨可能机制。方法：应用双向等电聚焦/聚丙烯酰胺凝胶电泳建立20例肝癌切除患者肝缺血再灌注前与灌注后15min肝正常组织的全细胞蛋白质和线粒体蛋白质表达图谱,并进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化串联时间质谱对差异蛋白质点进行鉴定,并进行生物信息学分析。结果与结论：相同条件下对各组全细胞和线粒体蛋白样品分别进行3次双向电泳,筛选在3次电泳中均存在的差异点进行分析,在全细胞蛋白质图谱中共鉴定出5个差异蛋白,在线粒体蛋白质图谱中未鉴定出明显的差异蛋白。结果可见肝癌切除手术过程中肝缺血再灌注15min即可使细胞骨架蛋白、热休克蛋白等细胞保护蛋白表达发生改变,同时有促进肿瘤转移的风险,需要采取预防措施降低影响,但线粒体蛋白表达基本未发生改变。     

新生大鼠脑组织中线粒体的分离

线粒体是细胞的重要细胞器,它在细胞能量代谢、自由基生成、蛋白质磷酸化,尤其是在细胞凋亡过程中起核心调控作用。Science于1999年发表了＂Mitochondrial make a comeback＂专题系列论文,重申线粒体再度成为当今生命科学和分子医学中的热点和前沿。线粒体功能缺陷可引起神经肌肉疾病、心血管病、糖尿病、帕金森氏病和肿瘤学等多种疾病,分离线粒体对于我们理解线粒体功能障碍与相关疾病的机制有重要作用。     

葡萄糖调节蛋白75生物学功能研究概述

葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75,grp75)是一种主要存在于细胞线粒体中的热休克蛋白(heat shock protein,HSP)[1].它行使分子伴侣的功能,协助细胞质中合成的线粒体蛋白肽链转运入线粒体,帮助肽链在线粒体中正确折叠和装配,介导异常蛋白质的降解[2].本文对grp75生物学功能的研究现状作一概述.     

洛铂用于治疗宫颈癌的作用机制研究

目的探讨洛铂用于治疗宫颈癌的作用机制。方法体外培养宫颈癌Caski细胞,取指数生长期的Caski细胞进行实验,分为实验组和对照组。MTT比色法检测洛铂对Caski细胞增殖的抑制作用;根据洛铂作用Caski细胞的IC50曲线,选用12μg/mL洛铂作用24h后,分别收集实验组和对照组细胞,提取细胞核蛋白、线粒体蛋白,双向电泳技术分离蛋白质,PDQuest软件分析洛铂处理前后差异表达的细胞核、线粒体蛋白组,选取明显表达差异在2倍以上的蛋白质斑点,进行串联飞行时间质谱分析。结果洛铂能够抑制宫颈癌Caski细胞的增殖并诱导其凋亡,随洛铂作用时间和浓度的变化而变化。经2DE电泳和串联飞行时间质谱分析后,成功鉴定了2个细胞核蛋白,4个线粒体蛋白。结论洛铂能显著抑制宫颈癌Caski细胞增殖。洛铂可干扰细胞能量代谢、通过线粒体氧化呼吸链的损伤诱导肿瘤细胞发生凋亡。     

亚健康疲劳状态血清对骨骼肌细胞蛋白质表达的影响

背景;前期研究表明亚健康疲劳状态时血清对体外培养骨骼肌细胞的生存活力、细胞超微结构、细胞线粒体膜细胞色素C氧化酶活性和线粒体能量负荷具有显著影响.目的:进一步运用二维凝胶电泳和质谱技术观察亚健康疲劳状态血时清对骨骼肌细胞蛋白质表达谱的影响.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-03/05在南方医科大学中医证候研究实验室和天津生物芯片技术有限责任公司蛋白质组学实验室完成.材料:亚健康疲劳状态时血清和正常状态时血清为自制:人骨骼肌细胞为Sciencell公司产品.方法:体外培养骨骼肌细胞,随机分为正常组和亚健康组,分别用含30%正常血清和30%亚健康疲劳者血清的DMEM/F12细胞培养液培养72 h,收集细胞,提取细胞总蛋白.主要观察指标:通过PDQuest7.3.0软件分析二:维凝胶电泳图谱,比较各组间蛋白表达量,然后利用质谱制作差异蛋白点的肽谱,确定差异蛋白,通过生物信息学分析所得蛋白的功能.结果:在2组凝胶中有15个蛋白质点显著差异表达,亚健康组中表达升高的蛋白质点有10个,下降有5个,其主要涉及能量代谢,核苷酸合成,细胞修复,应激等相关蛋白.结论:亚健康疲劳状态时血清可影响人骨骼肌细胞相关蛋白的表达.     

Bcl-2、Bax与气道上皮细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡抑制基因(Bcl-2)、Bax是Bcl-2基因家族分别抑制和促进气道上皮细胞凋亡的结构相似、作用相反的一对胞内蛋白质,其比值决定细胞凋亡抑制作用强弱及气道上皮细胞凋亡的发生、发展方向.本文综述了Bcl-2、Bax基因及相关蛋白的特点,Bcl-2蛋白可能通过稳定线粒体膜发挥基质金属蛋白酶(MMP)的抑制效应抗气道上皮细胞凋亡,Bax作用于线粒体增加其外膜通透性促进气道上皮细胞凋亡及二者相互作用调节气道上皮细胞凋亡的机制.     

线粒体自噬分子机制的研究进展

线粒体是细胞内物质能量代谢的主要场所,其生成的ATP是细胞生命活动的主要能量来源.线粒体受损能够导致活性氧(reactive oxygen speeies,ROS)或者细胞凋亡因子的释放,可以造成细胞的损伤或者促使细胞凋亡[1-3].因此,及时清除这些受损伤的线粒体,维持线粒体的正常功能与数量对细胞生命活动是至关重要的.近年来,人们逐渐认识到自噬溶酶体途径在调控细胞内受损线粒体的降解、维持线粒体的代谢稳定方面发挥了重要作用[4].     

缺失线粒体DNA的人喉癌细胞系的建立

目的为了研究线粒体DNA在人喉癌细胞的增殖、分化及凋亡中的影响及作用,培养线粒体DNA缺失的喉癌细胞系,为构建融合喉癌细胞,研究线粒体DNA突变和线粒体功能改变与喉癌发生之间的关系奠定基础.方法人喉癌细胞系JHUo11加入10%FBS的RPMI1640培养基中,然后在培养基中加入丙酮酸、尿苷、溴化乙锭(EtBr)以去除线粒体DNA,不加溴化乙锭的o11细胞作为对照.经过90天培养,线粒体DNA缺失的喉癌细胞通过健那绿染色后光镜观察和PCR法鉴定.结果 o11细胞经过75ng/μl溴化乙锭持续作用90天后可见细胞肿胀变圆,透光度增加,线粒体DNAPCR扩增未见目的条带,细胞可扩增出定位于mtDNA的500bp片段,健那绿染色对照细胞,可见散在蓝绿色线粒体,而加EB的细胞未见线粒体.结论喉癌细胞o11经过溴化乙锭持续作用90天培养出线粒体DNA缺失的ρ0o11喉癌细胞,这种缺失线粒体DNA的细胞系需补充外源性丙酮酸和尿苷来维持其生存,否则细胞很快死亡.通过观察细胞的增殖和分化发现,ρ0o11细胞生长速度比未经EB处理的对照组慢的多.     

白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体形态功能改变

目的:研究白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的机制,探讨白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡过程中线粒体形态功能的改变.方法:采用AnnexinV-FITC/PI标记结合流式细胞仪测定白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡的作用;电子显微镜观察白藜芦醇处理8 h、12 h和24 h后线粒体的超微结构变化;rhodamine123标记结合流式细胞仪观察白藜芦醇处理后HepG2细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化.结果:流式细胞术分析显示,白藜芦醇能显著诱导HepG2细胞凋亡,并呈浓度依赖性.白藜芦醇处理细胞12 h后,电子显微镜检测到线粒体外膜肿胀或破裂,并可伴有线粒体嵴数量减少或消失,24 h后观察到明显的细胞线粒体消失、染色质浓缩、细胞核裂解为碎块等细胞凋亡特征.流式细胞仪结果显示,经白藜芦醇处理后,rhodamine123的荧光强度明显降低.说明白藜芦醇可使△ψm去极化.结论:线粒体的形态和结构变化在白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡过程中起着重要作用,白藜芦醇诱导细胞凋亡的作用可能与其破坏△ψm和影响线粒体结构有关.     

睾丸Sertoli细胞在精子发生中的作用及辐射损伤

Sertoli细胞位于睾丸生精小管内皮,作为与生精细胞接触的惟一体细胞,在生精过程中起至关重要的调控作用.Sertoli细胞在精子发生过程中可为精子发生提供物质基础和能力,为精了发生提供有利的微环境,对精子的生成有复杂的作用.X射线照射后即出现生精细胞和支持细胞线粒体明显肿胀,线粒体嵴减少,且随着时间延长,线粒体形念的损害进一步加重,线粒体数量减少,线粒体嵴消失.说明辐射可造成支持细胞的损伤,但完整的理论体系还不十分清楚,还需要各学科的融合继续进一步的研究.     

NARS2在卵巢癌组织中的表达水平及生物学意义

目的 研究线粒体转运核糖核酸合成酶2(N A RS2)在肿瘤组织中的表达水平及生物学意义.方法 采用免疫组织化学技术比较244例卵巢癌及9例正常卵巢组织中NARS2的表达水平,利用Kaplan-Meier模型分析其与患者生存情况的相关性,并进一步利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测NARS2过表达卵巢癌细胞线粒体呼吸功能,采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法检测线粒体相关凋亡.结果 N A RS2在卵巢癌组织中的表达水平明显高于正常卵巢组织,且卵巢癌组织中N A RS2高表达的患者预后明显差于低表达组,差异均有统计学意义(P<0.05).高表达NARS2可明显促进线粒体的呼吸功能、电子传递链复合体Ⅰ及Ⅳ的活性,并且明显提高卵巢癌细胞的凋亡抵抗能力.结论 N A RS2有望成为一种新型卵巢癌预后评估标志物及药物治疗靶点.     

pink1-prkn PARK2通路与线粒体自噬和肝脏急性缺血再灌注损伤的关联研究

目的探讨pink1-prkn PARK2通路与线粒体自噬和肝脏急性缺血再灌注损伤的关联。方法选择C57BL/6小鼠,将Pink1-KO小鼠与Park2-KO小鼠杂交以产生Pink1Park2double-KO小鼠,制作肝脏急性缺血再灌注损伤模型。取肝脏组织行SP3的免疫组织化学染色。用质粒DNA或RNAi瞬时转染HK-2细胞;HK-2细胞在含20mM CCCP的无糖RKRB缓冲液诱导ATP耗竭,模拟再灌注;进行细胞凋亡分析;分离线粒体,测量线粒体DNA(mtDNA)的相对含量;测量HK-2细胞中的线粒体ROS;免疫印迹测定蛋白质浓度。结果缺血性急性肝脏损伤体外和体内模型的肝脏近端肝脏细胞中可诱导线粒体自噬。Pink1和Park2的缺失可消除这种条件下的线粒体自噬,证明PINK1-PARK2途径在肝脏细胞线粒体自噬中的关键作用。pink1和park2单基因或双基因敲除的小鼠中,缺血性急性肝脏损伤均加剧。Pink1和Park2缺失会增加线粒体损伤,活性氧产生和炎症反应。结论 PINK1-PARK2介导的线粒体自噬对急性肝脏损伤期间的线粒体质量控制,肝脏细胞存活和肝脏功能起重要作用。     

氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及Bax和p53的表达变化

目的 探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)凋亡的变化规律及Bax和p53表达的变化.方法 用过氧化氢(H2O2,500 μmol/L)处理不同时间模拟机体活性氧攻击损伤ATⅡ细胞的体内情况,建立氧化损伤性细胞模型;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测Bax和p53的蛋白表达变化.结果 与对照组比较,随H2O2刺激时间延长,ATⅡ细胞存活率明显下降(F=85.211,P＜0.05),线粒体膜电位也明显下降(F=72.453,P＜0.05),凋亡率却明显增加(F=54.002,P＜0.05);同时发现Bax蛋白和p53蛋白表达均明显增加(F1=28.118,F2=43.456,P均＜0.05).结论 氧化应激能损伤ATⅡ细胞,使细胞线粒体膜电位下降,细胞凋亡率增加、存活率下降,Bax和p53可能参与了ATⅡ细胞的凋亡.     

超声损伤卵巢癌细胞线粒体的体视学研究

目的 :研究超声辐照后受损伤卵巢癌细胞线粒体体视学参数的变化。方法 :观察超声辐照后细胞超微结构的变化。测量并计算受损伤细胞和对照细胞线粒体的体密度、表面积密度、表面积体积比、平均体积、数密度和平均表面积。结果 :超声辐照后部分细胞形态学变化不明显 ,部分细胞线粒体肿胀、嵴断裂。与对照细胞相比 ,受损伤细胞线粒体平均体积增大 (P<0 .0 0 5 ) ,平均表面积增大 (P<0 .0 5 ) ,体密度、表面积密度增大 (P<0 .0 0 5 ,P<0 .0 0 5 ) ,表面积体积比减小 (P<0 .0 1) ,数密度无明显改变 (P>0 .0 5 )。结论 :超声辐照可损伤卵巢癌细胞线粒体 ,受损细胞线粒体肿胀其体积增大较表面积增大明显。     

tMfn2基因诱导血管平滑肌细胞的凋亡

背景:线粒体融合素2蛋白,主要通过磷脂酰肌醇3激酶,蛋白激酶B诱导血管平滑肌细胞凋亡.去除穿膜区序列的线粒体融合素2蛋白,相对分子质量减小41%,诱导凋亡作用可能更强.目的:观察比较去除穿膜区序列的大鼠线粒体融合素基因2对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及其相关的信号通路.设计、时间及地点:基因水平的对比观察实验.于2008-01/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心实验室完成.材料:大鼠血管平滑肌细胞及携带半乳糖甘酶基因、携带线粒体融合素2基因和携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒均由陈光慧教授惠赠.方法:将大鼠血管平滑肌细胞传代培养3～10代后随机分为4组,①空白对照组:不加干预.②携带半乳糖甘酶基因的对照组:感染携带半乳糖甘酶基因的重组腺病毒.③携带线粒体融合素2基因的实验组:感染携带线粒体融合素2基因的重组腺病毒.④携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的实验组:感染携带去除穿膜区序列线粒体融合素2基因的重组腺病毒.主要观察指标:①重组腺病毒感染血管平滑肌细胞24 h后观察完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因的表达情况.②感染后24,48和72 h采用流式细胞术、酶联免疫吸附法观察细胞凋亡情况.③免疫印迹分析病毒感染血管平滑肌细胞24 h后磷酸化蛋白激酶B表达变化.结果:①感染后完整的和去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因在血管平滑肌细胞中均有表达.②去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用显著增强,且呈时间依赖性(P<0.01).③两个实验组中磷酸化蛋白激酶B水平均明显降低,但去除穿膜区序列的线粒体融合素2基因实验组更显著(P<0.01).结论:去除穿膜区序列的线粒体融合素基因2诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用更强,其机制与抑制蛋白激酶B磷酸化有关.     

碳离子辐射引起Hela细胞线粒体DNA 4 977 bp的缺失

背景:线粒体DNA 4 977 bp缺失的累积对衰老的多细胞动物来说是一个显著的特征,同时也与各种肿瘤细胞的转移和凋亡有关.目前的研究己证明辐射可特异性地诱导此缺失的产生,有望将其作为新的DNA水平的辐射损伤生物剂量标记.目的:用聚合酶链反应方法检测碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA 4 977 bp突变缺失.并观察碳离子辐射剂量及辐射时间与线粒体DNA 4 977 bp缺失的相关性.设计、时间及地点:细胞DNA水甲的对照实验,于2008-10/11在甘肃省兰州市近代物理研究所完成.材料:人宫颈癌细胞Hela细胞株.方法:Hela细胞经2-8 Gy的碳离子辐射后,于2～24 h各个时间点分别提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,并用聚合酶链反应法扩增线粒体DNA 4 977 bp缺失的特异片段,通过限制反应模板浓度和聚合酶链反应循环数的方法进行定性分析.主要观察指标:碳离子辐射剂量及辐射时间对线粒体DNA 4 97H7 bp缺失的影响.结果:经2 Gy辐照处理的Hela细胞在2,4,8,24 h 4个时间点的检测中均无聚合酶链反应阳性产物,8 Gy辐照处理的Hela细胞在12,16,24 h 3个时间点可检测到线粒体DNA 4 977 bp缺失,且随时间延长而累积.辐照后12 h Hela细胞在8 Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA 4 977 bp缺失,辐照后16和24 h Hela细胞在6,8 Gy辐照处理后可检测到线粒体DNA4 977 bp缺失.结论:碳离子辐射引起的Hela细胞线粒体DNA 4 977 bp缺失存在剂量相关性,且其累计程度可能与辐射时间有关.     

CD45表达与骨髓瘤细胞凋亡敏感性的关系

目的 探讨CD45分子的表达与骨髓瘤细胞凋亡的关系.方法 用马法兰诱导骨髓瘤细胞系U266的凋亡;无血清培养法诱导转染CD45基因或空质粒的U266细胞凋亡;无葡萄糖培养法诱导AMO1细胞凋亡;动物实验比较U266细胞CD45阴性和阳性两群细胞在体内的存活能力;流式细胞术检测凋亡细胞率和线粒体膜电位;Western blot法检测线粒体内细胞色素C的释放和caspase-9的激活.结果 经马法兰处理后,45%的CD45+U266细胞发生凋亡,而CD45-U266细胞只有30%发生凋亡;在无葡萄糖培养条件下,与低表达CD45的AMO1细胞相比,高表达CD45的AMO1细胞更易发生凋亡.无血清培养5 d,转染CD45RB基因的U266细胞60%发生凋亡,而转染空质粒的U266细胞的凋亡数无明显增加,与对照组相似,约为10%.动物体内实验表明,CD45-U266细胞群在SCID-hIL-6小鼠体内存活能力是CD45+U266细胞群的5倍.经DiOC6染色流式细胞术检测马法兰处理的U266细胞线粒体膜电位,CD45+U266细胞线粒体膜电位下降60%,而CD45-U266细胞线粒体膜电位仅下降30%,两对照组线粒体膜电位下降均为10%左右.经紫外线照射后,CD45+U266细胞更易从线粒体释放细胞色素C,导致更多的caspase-9被激活.结论 CD45分子的表达参与线粒体介导的细胞凋亡过程,使骨髓瘤细胞对多种凋亡刺激因子的敏感性增加.