人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。     

NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。     

大鼠胸腺素β4基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠胸腺素β4 (Tβ4)基因的重组慢病毒载体,转染293T细胞并观察Tβ4的表达.方法 从Genbank获取大鼠Tβ4基因序列,化学合成后连接入线性化慢病毒载体pGC-FU,得到重组慢病毒载体pGC-FU-Tβ4,将其转化细菌感受态细胞后行菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,对PCR鉴定阳性的克隆进行测序鉴定. pGC-FU- Tβ4、pHeIper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞,收集上清液浓缩后使用实时定量PCR(Real-time PCR)进行滴度检测.用所得病毒感染293T细胞后,Western blot检测Tβ4表达.结果 目的基因质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱示酶切片段大小为143 bp;菌落PCR结果示阴性转化子得到198 bp片段,阳性转化子得到333 bp片段;测序结果与预期相符合;Real-time PCR示所得病毒滴度约为2×109TU:Western blot示Tβ4转染组在33 KD处有特征条带.结论 成功构建大鼠Tβ4基因慢病毒载体pGC-FU- Tβ4,并建立慢病毒过表达系统.     

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的：构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法：利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeI酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富舍病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Westernblot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果：①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×10^8 TU／ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93．5％,经RT-PCR与Westernblot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论：成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

大鼠Aggrecanse-1，2特异性shRNA慢病毒表达载体的构建及测序

目的：利用RNA干扰技术，以大鼠aggrecanse-1，2基因为靶基因，设计aggrecanse-1，2基因特异性的小干扰RNA（siRNA），构建其短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒表达载体，并进行测序鉴定。方法：根据Tuschl原则设计并合成大鼠aggrecanse-1，2基因特异性的DNA寡核苷酸，连接到经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切线性化的pKCSHR-GFP质粒上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。结果：将合成的8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后，分别克隆到线性化的pKCSHR-GFP载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下，筛选出相应的阳性菌落，经DNA测序鉴定确定为设计的序列。结论：成功构建了8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体，可进一步用于干扰aggrecanse-1，2基因的mRNA转录，从而为制备aggrecanse-1，2基因表达受抑制的大鼠软骨细胞奠定基础。     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建

目的 构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.方法 将铁蛋白重链基因构建入线性化的慢病毒载体pGC-FU,以获得中间质粒pGC-FU-HF;进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒,以获得目的质粒pGC- agRNA- HF;通过病毒的包装和浓缩,应用Realtime PCR法检测重组慢病毒的滴度,应用NG108-15细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达.结果 抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体,病毒滴度2.00×109 TU/ml,该病毒转染NG108-15细胞后,β-arrestin2表达下调,铁蛋白表达上调.结论 成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.     

表达小鼠B7-1基因的重组逆转录病毒载体构建及真核表达

目的：构建表达小鼠B7—1基因的重组逆转录病毒载体并在真核细胞中检测其蛋白表达。方法：PCR法获基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，酶切法鉴定，真核细胞中检测蛋白表达。结果：酶切所得片段与所需相符，在真核细胞中检测到蛋白表达。结论：成功构建重组的逆转录病毒载体，为今后研究奠定了基础。     

STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的：构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法：根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5OC,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Westernblot检测原始细胞株（MHCC97L）,稳转细胞株（MHCC97－statl）中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。结果：测序证实STAT1基因过表达载体构建成功。过表达慢病毒包装成功。慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加。结论：STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

下调TPH2重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建色氨酸羟化酶(TPH)-2基因小干涉RNA的重组慢病毒载体.方法 在TPH-2 mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体,获得重组质粒pU6 -MCS-CMV-TPH2-shRNA,后者与慢病毒试剂共转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-TPH2-siRNA.经聚合酶链反应(PCR)鉴定目的基因的表达并测定病毒滴度.结果 PCR表明Lentivirus-TPH2-siRNA构建正确,病毒滴度为3×108 TU/rnl.结论 获得的Lentivirus-TPH2-siRNA可以用于转基因瘙痒治疗的实验研究.     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

Apr-1基因对胆管癌细胞QBC939细胞周期的调节机制研究

目的 研究Apr-1基因对胆管癌细胞的细胞周期调节作用及机制.方法 采用脂质体介导法将Apr-1基因转染胆管癌细胞系QBC939,建立稳定表达Apr-1基因的细胞模型(QBC939-Apr-1).运用RT-PCR检测转染前后QBC939细胞系中Apr-1 mRNA的表达;流式细胞分析以及生长曲线等方法观察目的 基因对该细胞系的细胞周期的影响.采用细胞周期基因芯片,观察Apr-1基因对细胞周期相关基因表达的调节作用.结果 Apr-1基因在QBC939细胞系中呈阴性表达,转染Apr-1基因的QBC939-Apr-1细胞出现了Apr-1 mRNA的表达,成功建立了稳定表达Apr-1基因的细胞模型,该细胞模型表现出细胞生长受抑,细胞周期显示G2期细胞由9%增加至13%(P＜0.01).细胞周期抑制;并且细胞周期基因芯片检测结果发现:Skp2、UBE基因的表达水平出现明显上调,而CDC6、Cyclin H等25种基因的表达下降,其中MRE11A、CKS2、CDK8、CDC45下调在3倍以上.结论 Apr-1基因在体外能够使QBC939细胞的细胞周期在G2期延长,出现细胞周期多种调节基因的表达差异.

Abstract：

Objective To investigate the role and the mechanism of Apr-1 gene on cholangiocarcinoma QBC939 cell lines proliferation and cell cycle regulation. Methods Apr-1 gene was transfected into QBC939 cells by using liposomes to establish a QBC939 cell model ( QBC939-Apr-1 ) stably expressing Apr-1 gene. Apr-1 mRNA expression and the changes in cell cycle and cell growth of QBC939 cells were analyzed by RT-PCR, flow cytometry ( FCM ) and growth curve before and after transfection. The regulatory effect of Apr-1 gene on the expression of cell cycle-related genes was investigated in QBC939 cells before and after Apr-1 transfection using cell cycle gene microarrays. Results Significant suppression of cell growth was observed with the cell model stably expressing Apr-1 gene. Apr-1 over-expression caused cell arrest from 9% to 13% (P ＜0. 01 ) increase in G2 population. Cell cycle gene microarrays demonstrated that the expression of Skp2 、UBE1 was up-regulated, while the expression of MRE11A 、CKS2 、CDK8 、CDC45 was down-regulated by more than 3 folds. Conclusions Apr-1 gene suppresses QBC939 cell proliferation in vitro, QBC939 cells presented with differences in the expression of cell cycle-related genes after Apr-1 gene transfection.