牛胚胎干细胞建系方法及其影响因素

学术背景:小鼠胚胎干细胞的建系方法已基本成熟,对于建立牛胚胎干细胞无限系的相关报道较少.目的:就牛胚胎干细胞的研究概况、建系方法及影响因素等问题进行概括性论述. 检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1980-01/2007-06的相关文献,检索词"bovine,Embryonic Stem Cells,Embryonic Germ Cells",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1998-01/2007-06的相关文献,检索词"牛,胚胎干细胞,胚胎生殖细胞",并限定文章语言种类为中文.共检索到70篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章所述内容应与牛胚胎干细胞密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:①重复性研究.②Meta分析.文献评价:文献的来源主要是通过对牛胚胎干细胞的研究概况、建系方法及影响因素等方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,6篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①已有报道从牛鲜胚内细胞团、原始生殖细胞、体外受精胚胎和核移植胚胎中成功分离获得牛类胚胎干细胞.②影响牛胚胎干细胞建系的因素包括胚胎日龄、培养方法、饲养层、细胞因子、传代方法等.③传统的从牛囊胚内细胞团和原始生殖细胞中分离培养胚胎干细胞时会遇到诸多瓶颈,不少学者尝试通过卵母细胞的孤雌生殖和体外成熟、受精来拓宽胚胎干细胞的来源.牛原始生殖细胞的分离过程中,易造成大量原始生殖细胞损失和凋亡,若使用密度梯度离心或特异性荧光抗体标记后通过流式细胞仪进行分离筛选,可能会起到较好的效果.如果使用转白血病抑制因子或干细胞生长因子基因的同源牛胎儿成纤维细胞作饲养层,既可克服外源蛋白污染及动物种间病原交叉感染等问题,同时又提供了培养牛胚胎干细胞所需的外源因子,提高了饲养层的质量.对胚胎干细胞集落进行转基因,通过荧光显微镜可以很清楚地知道所需传代的集落及传代时机.不同学者报道的牛胚胎干细胞碱性磷酸酶的表达有差异,可能与不同的染色程序和细胞分化程度、表型有关,因此碱性磷酸酶活性能否作为牛多能干细胞的特异标记还有待进一步研究. 结论:尽管目前有关牛胚胎干细胞的培养与应用技术已取得一定进展,但如何维持牛胚胎干细胞自我复制及多潜能分化的调控机制、如何确定不同的细胞因子联合使用时对牛胚胎干细胞的剂量效应、不同胚胎干细胞系在分化能力上是否存在差异、如何提高利用牛胚胎干细胞制作嵌合体的成功率等诸多问题还有待深入研究.     

胚胎干细胞与生殖细胞

目的:探讨生殖细胞的发生和细胞标记及胚胎干细胞向生殖细胞分化的进展及其关系。资料来源:检索Medline1950-01/2005-12相关胚胎干细胞和生殖细胞的文献,检索词“embryonicstemcells,germcells”,并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI1990-01/2005-12相关胚胎干细胞与生殖细胞方面的文献,检索词为“胚胎干细胞,生殖细胞”,并限定语言种类为中文。资料选择:对资料初审,选取包括胚胎干细胞和生殖细胞方面的文献,开始查找文献。纳入标准:①胚胎干细胞。②生殖细胞。排除标准:综述、重复研究类文章。资料提炼:共收集到714篇关于胚胎干细胞和生殖细胞的文献,纳入23篇符合标准的文献。资料综合:胚胎干细胞是来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性(多能性)干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞及原始生殖细胞来源的胚胎生殖细胞具有一定的相似形。人类、小鼠和其它哺乳动物类胚胎干细胞的分离、建系和定向分化已经取得重要进展。而且胚胎干细胞可以诱导分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。原始生殖细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有一些共同特性,可能共同来源于早期生殖细胞。结论:胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有类型细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞有一定的相似形。     

胚胎干细胞与生殖细胞

目的：探讨生殖细胞的发生和细胞标记及胚胎干细胞向生殖细胞分化的进展及其关系。 资料来源：检索Medline 1950-01／2005～12相关胚胎干细胞和生殖细胞的文献，检索词“embryonic stem cells，germ cells”，并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI 1990-01／2005～12相关胚胎干细胞与生殖细胞方面的文献，检索词为“胚胎干细胞，生殖细胞”，并限定语言种类为中文。 资料选择：对资料初审，选取包括胚胎干细胞和生殖细胞方面的文献，开始查找文献。纳入标准：①胚胎干细胞。②生殖细胞。排除标准：综述、重复研究类文章。 资料提炼：共收集到714篇关于胚胎干细胞和生殖细胞的文献，纳入23篇符合标准的文献。 资料综合：胚胎干细胞是来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性（多能性）干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞及原始生殖细胞来源的胚胎生殖细胞具有一定的相似形。人类、小鼠和其它哺乳动物类胚胎干细胞的分离、建系和定向分化已经取得重要进展。而且胚胎干细胞可以诱导分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。原始生殖细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有一些共同特性，可能共同来源于早期生殖细胞。 结论：胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有类型细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞有一定的相似形。     

体外培养人胚胎干细胞饲养层的研究进展

人胚胎干细胞在体外培养过程中始终保持未分化和持续增殖能力的首要条件是要有饲养层的支持。目前常用的饲养层有小鼠成纤维细胞、小鼠原代成纤维细胞、同源动物胚胎成纤维细胞、人包皮成纤维细胞等。饲养层细胞能分泌多种细胞因子、细胞问黏附分子及蛋白质,能有效抑制胚胎干细胞的分化并促进其增殖。现就胚胎干细胞培养过程中所需饲养层细胞的来源与筛选、分泌物及作用机制研究进展作一综述。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长(英文)

背景:人胚胎干细胞是一种全能型细胞,可以分化为3个胚层的组织,目前国内对其无饲养层生长的研究较少.成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子.目的:探讨长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响.方法:两株人胚胎干细胞在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养3代,分别转移到含100,160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养8代.从培养皿中移出胚胎干细胞,用IV胶原酶消化聚集成团的细胞,观察细胞分化状态和全能性情况.收集传8代后的胚胎干细胞,种植于SCID小鼠体内.对所得细胞做形态学评估,并进行碱性磷酸酶染色、表面标记免疫组化检测、RT-PCR检测OCT-4的表达、体内致瘤情况.结果与结论:在含160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中,两株人胚胎干细胞可以保持原有性状,即细胞克隆呈圆形,核质比较高,中间大片区域为未分化细胞,周围为分化细胞;呈碱性磷酸酶强阳性表达;表达OCT-4转录因子蛋白;细胞表面标志SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81均呈阳性表达;聚集成团的胚胎干细胞培养10 d后形成拟胚体;种植于SCID小鼠体内可得含3个胚层组织的畸胎瘤.含100 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基不足以维持人胚胎干细胞的长期增殖,4代以后大部分细胞分化死亡.提示成纤维细胞生长因子质量浓度达160 μg/L以上时,可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖,且不影响细胞分化状态和全能性.     

胚胎干细胞及在生殖医学中的应用

背景:有报道胚胎干细胞体外培养可分化为原始生殖细胞并进一步生成配子,受精后发育为胚泡,并产生成活的子代。目的:阐述近年胚胎干细胞在生殖医学中的研究进展。方法:应用计算机检索清华同方系列数据库2000/2009有关生殖细胞、中药的相关研究文章,检索词:生殖细胞、中药,并限定文章语言种类为中文;同时应用计算机检索Pubmed数据库1998/2009相关文章,检索词:embryonic stem cells,stem cells,germ cells,oocyte,sperm,differentiation,限定文章语言种类为"English"。结果与结论:胚胎干细胞在体外分化受到内、外源因素的影响,可以诱导分化为精子和卵母细胞,是研究哺乳动物早期胚胎发育的理想模型;目前研究体外培养原始生殖细胞和配子是可行的,但体外培养生殖细胞的特性和功能仍不确定,要应用于临床需进一步确定其安全性和有效性。     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提.目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系.方法:从孕12.5～14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3～5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达.结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长.染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性.实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养.     

胚胎生殖细胞体外原代培养条件分析

目的:分析胚胎生殖细胞体外原代培养条件,为胚胎生殖细胞建系奠定基础。资料来源:应用计算机检索Pubmed数据库1994-01/2005-10有关胚胎生殖细胞的文章,检索词“embryonicgermcells,primordialgermcells,invitroculture”,限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1994-01/2005-10期间的相关文章,检索词“原始生殖细胞,胚胎生殖细胞,体外培养”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文章后的引文。纳入标准:与胚胎生殖细胞培养、分化、鉴定相关文献。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到125篇有关胚胎生殖细胞的文章,排除重复或类似的同一研究,18篇符合研究要求。资料综合:胚胎生殖细胞具有全能性和多向分化潜能,是目前研究的热点。标本的选择、取材的部位、培养基、血清、各种添加剂、细胞因子的选择、溶液的pH值、饲养层的种类及状态等均可以影响胚胎生殖细胞的培养和生长。良好的培养条件对进行更深入的研究意义重大。结论:众多的因素可以影响胚胎生殖细胞的培养及生长,建立良好的胚胎生殖细胞体外培养条件十分重要。     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较

背景:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态,但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题.目的:制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层,观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态.设计:多样本观察比较.单位:海南医学院附属医院生殖医学中心.材料:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.方法:胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏,按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1,1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态,并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.主要观察指标:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测.④体外分化实验.结果:①:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1:3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300～400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.?＃ 结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.     

人胚胎干细胞培养与肺再生

背景:肺研究领域,利用人胚胎干细胞在体外增敏培养基己成功生成Ⅱ型肺泡细胞.由于体外实验中表现出不定向增殖潜能,胚胎干细胞有望成为可应用于移植、基因治疗等取之不尽的细胞源.目的:综述人胚胎干细胞培养与肺再生的研究进展.方法:应用计算机检索2000-01/2010-01中国知网数据库相关文章,检索词为"人胚胎干细胞,肺组织再生",并限定文章语言种类为中文.同时计算机检索1990-01/2010-01 PubMed数据库相关文章,检索词为"Human Embryonic stem cells,Lung regeneration",并限定文章语言种类为English.共检索到文献396篇.结果与结论:由于肺组织结构复杂、再生能力有限,肺疾病的治疗已成为棘手的问题.目前认为人胚胎干细胞能定向分化成为肺组织细胞,将人胚胎性干细胞植入损伤的肺组织,通过诱导剂使其向肺泡上皮细胞分化,从而产生肺泡组织.这是一种很有前途的治疗手段,但目前尚处于研究的初级阶段.     

Human embryonic stem cells and gene therapy.

Human embryonic stem cells (hESCs) theoretically represent an unlimited supply of normal differentiated cells to engineer diseased tissues to regain normal function. However, before hESCs can be useful as human therapeutics, technologies must be developed to provide them with the specific signals required to differentiate in a controlled fashion, to regulate and/or shut down the growth of hESCs and their progeny once they have been transferred to the recipient, and to circumvent the recognition of non-autologous hESC-derived cells as foreign. In the context that gene therapy technologies represent strategies to deliver biological signals to address all of these challenges, this review sets out a framework for combined gene transfer/hESC therapies. We discuss how hESCs are derived, characterized, and differentiated into specific cell lineages, and we summarize the characteristics of the 500 hESC lines reported to date. The successes and failures of gene transfer to hESCs are reviewed for both non-viral and viral vectors, as are the challenges to successful use of gene transfer in developing hESC therapy. We also consider gene transfer as a means of facilitating growth and isolation of genetically modified hESCs and as a mechanism for mitigating adverse effects associated with administration of hESCs or their derivatives. Finally, we evaluate the challenges that are likely to be encountered in translating the promise of hESCs to the clinic.     

人胚胎干细胞的保存方法

目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克降数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性.实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态.方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成.①材料:清洁级孕13.5 d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供:kryo-550.16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成.②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞.程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃～-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃～-30℃,每分钟降温0.3℃ 30℃～-150℃,每分钟降温10℃.降至-150℃时置液氮中保存.改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎千细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存.传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1 h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存.③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度.鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性.结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81～13.89,P＜0.01).②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P＜0.05:t=6.89,P＜0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P＜0.01:x2=9.69,P＜0.01).③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1.81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%.结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性.②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的.     

胚胎干细胞的鉴定方法

目的:胚胎干细胞具有全能性及核型正常的特征是其作为研究哺乳动物胚胎发育、细胞分化、外源基因的表达、以及利用基因突变的胚胎干细胞建立人类遗传病动物模型的理论基础。因而,胚胎干细胞的鉴定工作对于研究和利用胚胎干细胞具有重大的意义。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1980-01/2003-12相关胚胎干细胞的文章,检索词“embryonicstemcell,embryo,Alkalinephos-phatase,Oct-4”,限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库1980-01/2003-12相关胚胎干细胞的文章,检索词“胚胎干细胞”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审。纳入标准:与胚胎干细胞鉴定有关的文献。排除标准:文献中重复研究、综述类文章。资料提炼:主要收集了16篇有关胚胎干细胞鉴定的文献。查找全文。资料综合:将所选的资料按以下顺序归纳总结:①形态和生长特性的初步鉴定。②免疫学方法鉴定。③染色体相关鉴定。④全能性和多能性鉴定。结论:胚胎干细胞的鉴定并不是用某一种方法就可以的,而是一个鉴定过程。在这个过程中,我们应先检查碱性磷酸酶和核型,然后鉴定干细胞的表面标志物,当胚胎干细胞达到一定数量后再鉴定干细胞的发育全能性,每种鉴定都要重复多次。     

胚胎干细胞的鉴定方法

目的：胚胎干细胞具有全能性及核型正常的特征是其作为研究哺乳动物胚胎发育、细胞分化、外源基因的表达、以及利用基因突变的胚胎干细胞建立人类遗传病动物模型的理论基础。因而。胚胎干细胞的鉴定工作对于研究和利用胚胎干细胞具有重大的意义。资料来源：应用计算机检索Medline数据库1980-01／2003-12相关胚胎干细胞的文章，检索词“embryonic stem cell，embryo，Alkaline phosphatase，Oct-4”，限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库1980-01／2003-12相关胚胎干细胞的文章，检索词“胚胎干细胞”，限定文章语言种类为中文。资料选择：对资料进行初审。纳入标准：与胚胎干细胞鉴定有关的文献。排除标准：文献中重复研究，综述类文章。资料提炼：主要收集了16篇有关胚胎干细胞鉴定的文献。查找全文。资料综合：将所选的资料按以下顺序归纳总结：①形态和生长特性的初步鉴定。②免疫学方法鉴定。③染色体相关鉴定。④全能性和多能性鉴定。结论：胚胎干细胞的鉴定并不是用某一种方法就可以的，而是一个鉴定过程。在这个过程中，我们应先检查碱性磷酸酶和核型，然后鉴定干细胞的表面标志物，当胚胎干细胞达到一定数量后再鉴定干细胞的发育全能性，每种鉴定都要重复多次。     

诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞的分化

背景：近年来胚胎肝干细胞备受关注,该类细胞是否具有向类心肌细胞方向分化的潜能及相关的诱导分化条件,目前报道极少。目的：探讨体外环境下化学试剂诱导小鼠胎肝干细胞向类心肌细胞方向分化的合适条件。方法：二甲基亚砜联合5-氮杂胞苷以不同的浓度和时间,作用于13.5d胎龄的昆明小鼠胎肝干细胞,观察诱导分化效果。结果与结论：体外环境下,0.8%二甲基亚砜＋5μmol/L5-氮杂胞苷能诱导小鼠胎肝干细胞表达心肌细胞特异性标志物,而增加诱导剂浓度及延长时间不能提高诱导效率。     

FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用

学术背景：胚胎干细胞无论对转基因动物的制备还是对疾病的治疗都具有巨大的潜能，但前提是用于治疗的胚胎干细胞具有其特有的多能性和全能性，而FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性都具有重要作用。目的：了解FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用。检索策略：应用计算机检索Pubmed1996—09／2007—05期间的相关文章，检索词为“FoxD3”，限定语言种类为英文。检索到67篇文章，排除重复的和与胚胎发育和胚胎干细胞相关性不大的文章，共纳入32篇文献。文献评价：32篇文献中分别涉及胚胎干细胞转录调节、FoxD3在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性的作用及其Foxd3在其他细胞中（骨髓细胞、神经嵴细胞、色素细胞）的功能等方面的内容,资料综合：胚胎干细胞具有其他细胞不可比拟的特性使胚胎干细胞应用广泛，要合理控制胚胎干细胞在体内和体外的分化，关键要了解那些控制胚胎干细胞命运的基因。FoxD3是叉头框（Forkheadbox，Fox）家族中的一个转录调控因子，它对胚胎上胚层及其衍生物的形成和建立多潜能胚胎干细胞系具有重要作用，并与控制胚胎发育和胚胎干细胞多能性的其他转录调控因子有一定的联系。结论：FoxD3是维持胚胎上胚层细胞多潜能性和在体外建立胚胎干细胞系所必需的。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。方法：取ICR小鼠13.5d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景:建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。目的:体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。方法:取ICR小鼠13.5d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。结果与结论:复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

胚胎肝脏原始细胞表型及生物学特性

背景:目前肝干细胞尚无特异性标志物,从胚胎中建立具有干细胞样特性的肝脏原始细胞群是鉴定及研究肝干细胞的一个可行方法.目的:观察胚胎肝原始细胞表型及生物学特性,寻找肝原始,干细胞候选细胞群.方法:酶消化法分离、培养孕13.5 d的BALB/C小鼠胚胎肝原始细胞,免疫细胞化学染色及免疫荧光染色、Westem blot、RT-PCR法测定AFP/Albumin/CK19/c-Met/E-cadherin等肝干细胞表面标记,以及CD45、CD14、SMA等非肝干细胞标记的表达;相差显微镜及透射电镜观察细胞形态结构;流式细胞仪测定细胞周期分布时相;表皮生长因子加二甲基亚砜诱导分化成熟后行PAS糖原染色.结果与结论:实验成功分离得到纯度较高的干细胞,原代细胞多呈集落样生长,小圆形.细胞周期测定提示细胞多数处于静止期,符合干细胞特点.透射电镜观察细胞核浆比例大,细胞器不成熟,呈现原始细胞特点.流式细胞周期测定结果S期占10.8%,G2/M期占10.6%,无异常DNA含量.PAS染色后阳性对照组肝癌细胞的糖原主要表达在靠近一侧的核周边胞质内,呈强阳性;而胚胎肝前体细胞诱导组,核浆比例大,部分细胞胞质内可见较弱的糖原表达,充满胞质.提示实验初步建立表达AFP+Albumin+CK19+c-Met+E-cadherin+标志的集落样生长的肝原始细胞群,其表达多种干细胞表型,具有未成熟肝干细胞特点.可能作为肝干细胞候选细胞.