感染性角膜炎的16S rDNA PCR分析:病例报道

目的:探讨PCR在细菌感染性角膜炎治疗中的作用。方法:4例患严重感染性角膜炎患者的角膜刮片行细菌培养,16S核糖体D NA(rD N A)PCR分析,以及扩增后直接测序。患者的病史包括激光原位角膜磨镶术(LA SIK)、穿透性角膜移植术(PK P)和外伤。结果:通过PCR,4例患者均发现了可能的致病菌,而细菌培养的结果为阴性或与临床表现不符。发现的4种细菌为:假单胞菌、软弱贫养菌、嗜麦寡养食单胞菌以及牙龈卟啉单胞菌。结论:角膜刮片的16S rD NA PCR分析可以作为常规微生物检测的辅助方法,由于该方法相对较新,结果分析需谨慎。感染性角膜炎的16…     

细菌16S rDNA基因T碱基特异的PCR产物片段化

目的探讨细菌16S rDNA检测芯片杂交前的样本处理优化方法。方法设计针对细菌16S rDNA基因全长的通用引物,通过PCR时掺入一定比例的dUTP替代dTFP,扩增长度为1：5kb的片段,用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)消化处理掺入到双链上的dUTP后,再经浓氨水特异性断开DNA双链上原dUTP处的磷酸二酯键,然后用聚丙烯酰胺凝受胶电泳(PAGE)和琼脂糖电泳确认片段化的效果。结果本实验选用的基因当dUTP与dTFP的比例在3：7～1：1时,都能够获得比较理想的片段化结果。结论通过控制一定的dUTP掺入比例再经UDG及氨水处理能够得到稳定的片段化结果。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

PCR技术在食物中毒病原菌检测中的应用

金黄色葡萄球菌（金葡菌）肠毒素已被视为食物中毒的主要因素之一，引起世界各国的普遍关注，因此建立快速检验方法势在必行。一般传统方法的整个操作过程繁杂，时间长。我们将PCR技术应用于食物中毒中金葡菌肠毒素的检测与分型，不仅缩短了检测时间，提高了检出率，而且能够对肠毒素进行分型，可为流行病学调查提供准确依据。     

PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

活性污泥中硝化细菌16S rDNA鉴定方法研究

目的 以活性污泥为材料，研究其中硝化细菌的分离及16Sr DNA鉴定方法。方法 采用氨氧化细菌与亚硝酸氧化细菌富集、分离技术从武汉某啤酒厂曝气池活性污泥中分离得到2株纯培养菌株N。和Nz。分别提取2株细菌的总DNA，利用氨氧化细菌与亚硝酸氧化细菌的16Sr DNA特异性引物进行多聚酶链反应(PCR)扩增；扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳和Sanger末端终止法测序分析，用NCBI-Blast软件将测序结果在GenbAnk等数据库中进行同源性检索。结果 N1和N2的DNA扩增产物片断大小分别为526 bp和391 bp，测序结果经检索证实N1、N2分别与标准菌株Nitrosomonas sp、DYS317和Nitrobacter sp.R6的保守性片段有99％、100％的同源性。结论 可以判定所分离得到的N1和N2菌株分别为亚硝化单胞菌属和硝化杆菌属。     

流感嗜血杆菌16S rRNA和p6基因PCR检测结果比较

目的 比较流感嗜血杆菌(Hi) 16S rRNA和p6基因的PCR检测结果的差异.方法 以Hi的16S rRNA基因及外膜蛋白p6基因作为靶基因,设计特异性引物分别对临床标本分离的43株Hi进行PCR快速检测. 结果 34株16S rRNA基因扩增出538bp大小DNA片段,检出率为79%;43株p6基因均扩增出296bp大小DNA片段,检出率为100%.同时,其他细菌对照株16S rRNA和p6基因扩增均未出现假阳性结果.结论 相比于16S rRNA基因,p6基因对Hi检测和鉴定更具特异性,可用于临床对Hi感染疾病的快速诊断和流行病学研究.     

16S rDNA测序鉴定β溶血性G群链球菌

目的 对一起群聚性儿童肾小球肾炎暴发事件中分离到的26株β溶血性G群链球菌进行16S rDNA测序鉴定,探讨该方法在病原学鉴定方面的意义.方法 分别采用API20 Strep生化鉴定系统、部分和全序列测定16S rDNA鉴定26株β溶血性G群链球菌;使用Mega V3.1软件,采用Neighbour-joining 方法和boot-strap test对部分菌株的全序列进行树状图分析.结果 API20 Strep生化鉴定率低,未能鉴定出目的菌;采用16S rDNA测序,结果均为咽峡炎链球菌(S.anginosus),鉴定率大于97%.其中4株G群的全序列树状图分析显示,G群链球菌均与咽峡炎链球菌聚类在同一簇.结论 16S rDNA序列鉴定能提供详细明确的核苷酸信息,能区分G群链球菌不同的种,显示其在菌株鉴定方面的独特优势.     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物,制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针,以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针,将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记;将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

实时荧光定量PCR检测儿童肺炎支原体16S rRNA的临床意义

目的探讨实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测肺炎支原体(MP)16S核糖体RNA在儿童支原体肺炎诊治中的临床意义。方法收集70例支原体肺炎患儿的临床及实验室资料,将其分为轻症组及重症组。采用RTFQ-PCR测定肺炎支原体16S核糖体r RNA的表达并比较痰液及咽拭子标本阳性率的差异。对检测阳性患儿给予大环内酯类抗生素为主的方案治疗,根据临床症状的缓解及用药疗程复查,分析RTFQ-PCR定量指标与临床治疗效果的相关性。结果痰液MP RTFQ-PCR阳性率高于咽拭子(92.86%vs.54.29%),支原体肺炎轻症组MP RTFQ-PCR转阴时间短于重症组[(2.78±0.42)周vs.(5.34±1.04)周],差异均有统计学意义(P0.05)。结论 RTFQ-PCR检测肺炎支原体定量指标可以指导大环内酯类药物应用时间,减少副作用产生,具有重要的临床指导意义。     

16S rDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用

目的建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值。方法收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99%及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属。当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析。结果经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100%)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0%。17株不常见菌株中,10株(58.8%)细菌只与1种菌相似性大于98.0%,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3%)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0%;1株菌与已知菌相似性在96.0%~98.0%之间只能鉴定到属(棒状杆菌)。进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平。结论结合16S rDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定。     

婴幼儿奶粉中病原菌多重PCR检测研究

目的建立婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。方法根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A（ompA）基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，设计两对特异性引物。对反应条件进行优化，建立针对婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法，并对奶粉进行模拟检测。结果两对引物能特异扩出282bp和482bp的目的条带；在优化条件下，可同时检测模拟样品中两菌DNA，灵敏度达到10^3CFU／ml。结论与传统方法比较，研究建立的多重PCR方法敏感、特异，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。     

多重PCR检测唾液标本中的幽门螺杆菌16S rRNA及cagA基因

目的 检测唾液标本幽门螺杆菌（Hp）的16S rRNA基因及cagA基因,了解消化道疾病患者口腔中Hp存在情况及致病情况。方法 利用生物学信息技术,设计Hp 16S rRNA、cagA基因特异性引物,建立检测Hp 16S rRNA、cagA基因的多重PCR方法;重组克隆质粒构建标准阳性对照品;收集156例消化道疾病患者的唾液标本,提取唾液标本中细菌DNA,应用建立的多重PCR方法,检测Hp 16S rRNA基因及cagA基因,并对结果进行分析。结果 建立的检测Hp 16S rRNA基因及cagA基因的多重PCR方法特异性强,灵敏性较高,最低检测线为103 copies· μL-1;重组质粒pGMT-16s和pGMT-cagA,可作为鉴定Hp的标准阳性对照品;检测Hp感染的消化道疾病患者的唾液标本,口腔携带Hp 16S rRNA基因的阳性率为87.2%,cagA基因阳性率为23.1%。结论 Hp感染的消化道疾病患者口腔唾液标本中存在Hp,口腔中存在Hp可能是诱发消化道Hp感染及治疗后复发的一个重要原因。     

16S-23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针对结核患者痰标本的检测

目的：应用结核分枝杆菌特异的寡核苷酸探针杂交检测结核患者痰标本中的结核分枝杆菌，以评价其在临床应用中的价值。方法 对生物素标记５‘－端的一个２０ｂｐ的寡核苷酸探针的敏感性、特异性的研究，并应用该探针对９０例结核患者和３０例非结核患者痰标本进行了检测。结果 寡核苷酸探针分别检测基因组ＤＮＡ、３５０ｂｐ ＰＣＲ扩增产物、２５０ｂｐ ＰＣＲ扩增产物的敏感性分别为５５ｎｇ，０．５ｎｇ，０．１ｎｇ。探针检测     

基于16S rDNA测序的帕金森病患者肠道菌群初步分析

目的对帕金森病患者的肠道菌群进行初步分析。方法收集2018年10月～2019年4月某三甲医院收治的7例帕金森病患者及7例健康对照者的粪便样本,提取菌群DNA,选取细菌16S r DNA的V3～V4区序列进行基因扩增及Illumina测序,生物信息学分析肠道菌群测序数据。结果 Alpha多样性分析中,Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数在两组样本间无显著统计学差异(P0.05)。在界、门分类水平上PD组及健康对照组物种数目相等,在纲、目、科、属、种、OTU分类水平上PD组所包含的物种数目依次高于健康对照组。受试样本中肠道菌群结构由4个主要的菌门组成,分别为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。在PD组中,检测到了12种显著升高的肠道菌群组分(P0.05)。结论帕金森病患者与健康对照者的肠道菌群结构在大体上是相似的,有部分菌群在两组间存在着差异,深入分析肠道菌群变化有望为研究帕金森病的发病机制、疾病预防及治疗提供新思路。     

23S rDNA基因芯片对临床常见致病菌的检测

目的 建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型。方法 使用合成的23S rDNA寡核苷酸探针，制备基因芯片。细菌核糖体DNA经过23S rDNA通用引物扩增后与芯片上的探针杂交，用荧光扫描仪检测信号。结果 基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性。结论 寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力，比常规培养法快速、准确。     

同时检测四种病原菌的PCR方法分析

目的本文主要是讨论同时检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌的四种在食物感染常见的病原菌的快速PCR检测方法。方法选取我中心从2010年3月-2011年3月检验科收集的病原样本共60例作为研究对象。其中包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌。采用多重PCR检测方法进行检验。结果将需要检测的4中病原菌加入需扩增浓度混合液中,并且加入PCR扩增体系中进行PCR扩增。结果显示没有出现有扩征带,并且4种病原菌均出现其特异性扩增带,说明4种病原菌之间没有相互干扰,而且没有出现假阳性结果。结论多重PCR病原菌检测方法能准确检出金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌等四种常见的肠道病原,值得在卫生应急食物中毒事故处理中推广使用。     

细菌性感染性腹泻常见病原菌的多重PCR检测

目的:建立一种能同时检测细菌性感染性腹泻标本中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法:根据沙门菌的invA基因序列、志贺菌的ipaH基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列、副溶血性弧菌的tdh基因序列设计特异性引物,通过多重PCR反应对样品中上述4种病原茵的目标基因进行扩增,同时优化反应体系。结果:本方法的特异性和灵敏性良好,该方法能检测的灵敏度分别为103.56pg的沙门菌DNA,94.85pg的志贺菌DNA,14.1pg的金黄色葡萄球菌DNA,115.32pg的副溶血性弧菌DNA。结论:该方法特异性和灵敏度高,检测周期短,适用于细菌性感染性腹泻标本中多种致病菌的快速检测,具有较好的应用前景。