肾衰Ⅱ号方对慢性肾衰竭大鼠有氧糖酵解及肾间质纤维化的影响

目的观察肾衰Ⅱ号方对慢性肾衰竭大鼠有氧糖酵解及肾间质纤维化的影响,探讨其抗肾间质纤维化的作用机制。方法体内实验以5/6(A/I)手术构建慢性肾衰竭大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、中药组、西药组,进行相应干预8周后,取肾组织行PAS染色观察肾脏病理变化,Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达,免疫组化检测α-SMA、己糖激酶(HK)2蛋白定位,紫外法检测肾组织HK活性,比色法检测肾组织乳酸、丙酮酸浓度;体外实验以白细胞介素(IL)-1β刺激大鼠肾成纤维细胞NRK-49F构建NRK-49F增殖活化模型,细胞分为空白组、IL-1β组、IL-1β+肾衰Ⅱ号方低剂量组(200μg/mL)、IL-1β+肾衰Ⅱ号方高剂量组(400μg/mL)、IL-1β+2-脱氧-D-葡萄糖组(10 mmol/L),Western blot检测NRK-49F细胞α-SMA、增殖细胞核抗原(PCNA)、纤维连接蛋白(FN)、HK2蛋白表达,比色法检测细胞培养基乳酸浓度,葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基葡萄糖浓度,免疫荧光检测HK2蛋白表达。结果体内实验:与假手术组比较,模型组PAS染色提示肾间质糖原含量增加,肾小球、肾小管形态异常;α-SMA蛋白表达明显升高(P0.01),肾组织乳酸浓度、乳酸/丙酮酸、HK活性、HK2蛋白表达均明显升高(P0.01)。与模型组比较,中药组和西药组肾组织病理变化改善,α-SMA蛋白表达、乳酸浓度、乳酸/丙酮酸、HK活性、HK2蛋白表达均明显降低(P0.05,P0.01)。体外实验:与空白组比较,IL-1β组NRK-49F细胞FN、α-SMA、PCNA、HK2蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01);细胞培养基p H值、葡萄糖浓度明显降低(P0.05),乳酸浓度明显升高(P0.01);与IL-1β组比较,各干预组NRK-49F细胞FN、α-SMA、PCNA、HK2蛋白表达明显降低(P0.05,P0.01);细胞培养基p H值、葡萄糖浓度升高(P0.05,P0.01),乳酸浓度明显降低(P0.01)。结论肾衰Ⅱ号方可通过抑制NRK-49F细胞有氧糖酵解反应,从而阻止成纤维细胞增殖活化,实现其抗肾间质纤维化的作用。     

血管紧张素Ⅱ激活肾间质成纤维细胞的实验研究

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对正常大鼠肾间质成纤维细胞株NRK-49F功能变化的影响,探讨其参与肾小管间质纤维化的作用机制。方法用不同浓度AngⅡ(10-6,10-7,10-8,10-9mol/L)刺激NRK-49F(6 h,12 h,24 h和48 h)。蛋白免疫印迹法检测α平滑肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)和TGF-β受体(TβR I)的表达。ELISA方法检测细胞上清液中TGF-β1的浓度。明胶酶谱法检测细胞上清液中MMP2/9的表达量。结果①10-7mol/L AngⅡ能刺激NRK-49F细胞上调FN和α-SMA表达,随着AngⅡ浓度的增加,该细胞表达FN和α-SMA的量亦随之增加,呈明显的剂量依赖性;②10-9mol/L AngⅡ能够上调NRK-49F细胞TβR I的表达,10-7mol/L AngⅡ刺激该细胞6 h后,TGF-β1的表达开始增加,12 h后达到峰值,24 h和48 h仍能维持较高的水平;③10-7mol/L AngⅡ能够刺激NRK-49F细胞表达MMP2和MMP9,其中MMP2的表达量显著多于MMP9的表达量。结论AngⅡ能够激活间质成纤维细胞,并可能以此参与肾小管间质纤维化的发生发展。     

黄芪甲苷联合大黄素通过Smads通路抑制TGF-β1诱导的足细胞凋亡

目的:探讨黄芪甲苷联合大黄素是否通过Smads通路抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠足细胞株凋亡。方法:①体外培养小鼠足细胞株。②应用不同浓度TGF-β1(10-1¹04ng/L)诱导小鼠足细胞凋亡。③TGF-β1不同刺激时间(12、24、48 h)诱导小鼠足细胞凋亡。④黄芪甲苷、大黄素联用抑制TGF-β1诱导小鼠足细胞凋亡,实验分为正常组、TGF-β1组、黄芪甲苷+TGF-β1组(黄芪甲苷组)、大黄素+TGF-β1组(大黄素组)、黄芪甲苷+大黄素+TGF-β1组(黄芪甲苷+大黄素组)。⑤采用流式细胞仪检测Annexin V、Caspase 3。⑥实时定量PCR及Western印迹法检测Smad2、Smad3 mRNA及蛋白质表达。结果:①随着TGF-β1浓度增加(10-1104ng/L)诱导小鼠足细胞凋亡。③TGF-β1不同刺激时间(12、24、48 h)诱导小鼠足细胞凋亡。④黄芪甲苷、大黄素联用抑制TGF-β1诱导小鼠足细胞凋亡,实验分为正常组、TGF-β1组、黄芪甲苷+TGF-β1组(黄芪甲苷组)、大黄素+TGF-β1组(大黄素组)、黄芪甲苷+大黄素+TGF-β1组(黄芪甲苷+大黄素组)。⑤采用流式细胞仪检测Annexin V、Caspase 3。⑥实时定量PCR及Western印迹法检测Smad2、Smad3 mRNA及蛋白质表达。结果:①随着TGF-β1浓度增加(10-1¹04ng/L)、刺激时间增加,足细胞凋亡比率增多(P<0.05),足细胞Smad2、Smad3 mRNA表达增加。TGF-β1103ng/L为最佳诱导小鼠足细胞凋亡浓度,24 h为最佳诱导凋亡时间。②TGF-β1组与正常组相比Caspase 3阳性细胞比率增加(P<0.01);Smad2、Smad3蛋白质表达明显增加(P<0.01)。③黄芪甲苷+大黄素组与TGF-β1组、黄芪甲苷组、大黄素组比较:足细胞凋亡比率明显减少(P<0.05);Caspase 3阳性细胞比率减少(P<0.05);Smad2、Smad3蛋白质表达减少(P<0.05)。④黄芪甲苷+大黄素组较TGF-β1组Smad2、Smad3 mRNA表达减少。结论:①TGF-β1能通过Smads通路诱导小鼠足细胞凋亡,呈浓度及时间依赖性。②黄芪甲苷联合大黄素能通过Smads通路阻断足细胞凋亡,其机制可能与减少TGF-β1的表达,阻止其激活Smads蛋白,从而阻止Caspase家族诱导的足细胞凋亡有关。     

降压通络方对缺氧诱导的大鼠肾小管上皮细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的探讨降压通络方对缺氧诱导的大鼠肾小管上皮（NRK-52E）细胞凋亡的相关分子机制。方法制备降压通络方（1.42g/mL灌胃大鼠）含药血清和缬沙坦（0.83mg/mL灌胃大鼠）含药血清，采用缺氧诱导大鼠NRK-52E细胞凋亡模型，分为4组：正常组、模型组、降压通络方组和缬沙坦组。采用CCK-8试剂盒检测细胞活力值，AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，ELISA法检测细胞上清液转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白表达，免疫荧光法检测TGF-βRⅠ、Smad2/3蛋白定位，WesternBlot法检测TGF-βRⅠ、Smad2/3蛋白表达。结果TGF-βRⅠ、Smad2/3在NRK-52E细胞上广泛表达。与正常组比较，模型组细胞活力值降低（P<0.01），凋亡率升高（P<0.01），TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad2/3表达升高（P<0.01）。与模型组比较，降压通络方组和缬沙坦组细胞活力值升高（P<0.01），凋亡率降低（P<0.05，P<0.01），TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad2/3表达降低（P<0.01，P<0.05）。与缬沙坦组比较，降压通络方组TGF-β1表达升高（P<0.05），细胞活力值、凋亡率、TGF-βRⅠ和Smad2/3表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论降压通络方能抑制缺氧诱导的NRK-52E细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制TGF-β1/TGF-βRⅠ/Samd2/3信号通路而实现。     

半枝莲提取物逆转上皮间质转化抑制肝癌细胞迁移侵袭的研究

目的:探讨半枝莲提取物(Extracts from Scutellaria barbata,ESB)对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭的抑制作用及分子机制。方法:利用转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)诱导肝癌HepG2细胞上皮间质转化模型,通过MTT法、Transwell实验测定细胞增殖、迁移及侵袭能力,Western blot检测各组细胞相关蛋白表达情况。结果:MTT结果显示ESB抑制HepG2细胞增殖,且呈浓度及时间依赖性,24 h及48 h IC_(50)分别为317.3μg/mL,243.8μg/mL。Transwell实验显示,与对照组比较,TGF-β组细胞迁移与侵袭能力增强(P 0.05);与TGF-β组比较,TGF-β+5μg/mL ESB组,TGF-β+10μg/mL ESB组细胞迁移及侵袭能力减弱(P 0.05)。Western blot实验显示,在建立上皮间质转化模型后,与TGF-β组比较,TGF-β+ESB (5μg/mL、10μg/mL)组E钙黏蛋白(E-cadherin)表达上调(P 0.05),N钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达下调(P 0.05),同时磷酸化的Smad2蛋白(Phosphorylated Smad2,p-Smad2)、磷酸化的Smad3蛋白(Phosphorylated Smad3,p-Smad3)、磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(Phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNk)、磷酸化的p38蛋白(Phosphorylated p-38,pp38)、磷酸化的胞外信号调节激酶(Phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p-ERK)、整合素αV亚单位(IntegrinαV)、整合素β3亚单位(Integrinβ3)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloprotein2, MMP2)、基质金属蛋白酶9 (matrix metalloprotein9,MMP9)表达显著下调(P 0.05)。结论:ESB可能通过阻断TGF-β/Smad/AMPK信号通路,下调IntegrinαV、Integrinβ3、MMP2及MMP9逆转TGF-β诱导的上皮间质转化,抑制肝癌HepG2细胞迁移及侵袭。     

甘草酸联合大黄素抑制成纤维细胞增殖及转分化的抗肾脏纤维化作用

目的研究甘草酸联合大黄素抑制成纤维细胞增殖及转分化的抗肾脏纤维化作用。方法分别单独及联合应用大黄素、甘草酸(两药联用比例分别为1∶1、1∶5、1∶10)处理NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞48 h后,采用MTT法检测细胞增殖。建立TGF-β1诱导NIH3T3细胞向肌成纤维细胞转分化模型,根据细胞增殖抑制实验结果,分别以适宜浓度的大黄素、甘草酸以及大黄素-甘草酸(1∶5)处理48 h,通过Western blot法检测α-SMA、TGF-β1、Col-1、FN蛋白表达水平。结果 NIH3T3细胞增殖抑制率随着大黄素浓度增加而逐渐升高。大黄素与甘草酸比例为1∶5时,联合应用效果最佳。转分化细胞模型经药物处理48 h后,大黄素单用组与联合用药组α-SMA、TGF-β1、Col-1、FN蛋白表达水平与模型组比较均显著降低(P0.05);与大黄素单用组比较,联合用药组α-SMA、Col-1、FN蛋白表达水平显著降低(P0.05)。结论大黄素及大黄素-甘草酸联合用药可抑制NIH3T3细胞增殖及向肌成纤维细胞转分化,降低细胞外基质的产生,而且两者具有协同作用,最佳比例为1∶5。     

扶正祛风方通过TGF-β1/Smad信号通路抑制膜性肾病大鼠足细胞转分化的机制

目的:研究扶正祛风方对膜性肾病(MN)模型大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路及足细胞上皮间充质转化(EMT)的影响,探讨其保护足细胞的分子机制。方法:大鼠随机分为正常组和造模组,造模组经阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导构建MN模型后分为模型组、氯沙坦钾组(0.05 g·kg^-1)及扶正祛风方高、中、低剂量(41,20.5,10.25 g·kg^-1)组,给药4周。给药0,2,4周检测24 h尿蛋白(24 h-Upro)水平;给药4周后检测尿素氮(BUN)及血肌酐(SCr)水平,肾组织经苏木素-伊红(HE),马松(Masson),过碘酸-六胺银(PASM)染色后光镜观察病理改变,透射电镜观察肾小球基底膜(GBM),足突改变;免疫组化(IHC)观察足细胞EMT标志物结蛋白(Desmin)的分布及表达强度;蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测肾组织TGF-β1,Smad2/3,磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3),Smad7,Desmin mRNA及蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组24 h-Upro,BUN,SCr水平显著升高(P<0.01),免疫复合物沉积升高,GBM增厚和足突融合明显,Desmin mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01),TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Smad3 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,扶正祛风方各组及氯沙坦钾组24 h-Upro,BUN水平降低(P<0.05),扶正祛风方中剂量组血SCr水平降低(P<0.05),扶正祛风方各组及氯沙坦钾组肾小球上皮下免疫复合物沉积减少,GBM增厚和足突融合减轻,扶正祛风方高、中剂量组和氯沙坦钾组Desmin在基底膜的表达强度降低;扶正祛风方中剂量组肾组织TGF-β1和p-Smad2/Smad2 mRNA及蛋白表达降低,Smad7 mRNA及蛋白表达升高(P<0.05),扶正祛风方高剂量组p-Smad3/Smad3 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05),扶正祛风方高、中剂量组及氯沙坦钾组肾组织Desmin mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论:扶正祛风方可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路激活介导的足细胞EMT实现MN足细胞保护的作用。     

半夏泻心汤人含药血清对HP感染GES-1细胞TGF-β/Smad信号通路的影响

目的:探讨半夏泻心汤人含药血清对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染人胃黏膜上皮GES-1细胞转化生长因子-β(TGF-β)/信号转导蛋白(Smad)信号通路的影响,以揭示该方治疗消化性溃疡可能的作用机制。方法:GES-1细胞分为空白组,HP感染模型组,健康人血清组,雷贝拉唑血清组,用药前血清组,10%半夏泻心汤血清组,20%半夏泻心汤血清组。除空白组外,其余各组均接种HP造成幽门螺杆菌感染模型,采用雷贝拉唑、半夏泻心汤含药血清及用药前、健康人血清进行干预,24 h后收集细胞及其上清液,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Smad2/3,Smad7,TGF-β1及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3),磷酸化Smad7(p-Smad7)蛋白的表达。结果:与空白组比较,HP可明显抑制GES-1细胞的增殖,降低GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1及p-Smad2/3蛋白表达,增加Smad7及p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01);与HP感染模型组比较,雷贝拉唑血清组及10%,20%半夏泻心汤血清组可明显降低HP对GES-1细胞增殖的抑制,增加GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1,p-Smad2/3蛋白表达,并明显降低Smad7,p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01);与用药前血清组比较,加入雷贝拉唑、半夏泻心汤含药血清后均可降低HP对GES-1细胞增殖的抑制,其中雷贝拉唑血清组及20%半夏泻心汤血清组可增加GES-1细胞内Smad2/3,TGF-β1,p-Smad2/3蛋白表达,降低Smad7,p-Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论:半夏泻心汤能够减轻HP诱导GES-1细胞的损伤,促进GES-1细胞增殖,治疗HP相关性消化性溃疡,提高溃疡愈合质量,其机制可能与其调控TGF-β/Smad信号通路有关。     

TGF-β1/Smad信号通路在腺嘌呤导致的肾纤维化大鼠肾脏组织中的作用与意义

目的:探讨肾组织中TGF-β1/Smad信号通路在腺嘌呤导致的肾纤维化模型损伤过程中的变化与意义。方法:将23只SD大鼠随机分为正常组10只和模型组13只,采用腺嘌呤制备肾纤维化大鼠模型;采用RT-PCR检测两组大鼠TGF-β1mRNA的表达,ELISA法检测Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达,免疫组化法检测a-SMA蛋白表达。结果:模型组较正常组TGF-β1mRNA表达增强,Smad2、Smad3水平升高,Smad7水平下降,差异均具有统计学意义(P0.01)。结论:腺嘌呤导致的大鼠肾纤维化与TGF-β1/Smad信号通路密切相关,通过调节TGF-β1/Smad信号通路,对抑制肾纤维化的发生发展有重大意义。     

垂盆草总黄酮通过TGF-β_1/Smad2/3通路干预肝星状细胞上皮间质转化的分子机制

目的:探讨垂盆草总黄酮对肝星状细胞(HSC-T6)增殖及上皮间质转化的影响及其作用机制。方法:将HSC-T6细胞分为空白对照组、水飞蓟素阳性对照组及垂盆草总黄酮低(1 mg/mL)、中(1.5 mg/mL)、高(2 mg/mL)浓度组。MTT法检测各组细胞增殖情况;观察细胞形态学变化;ELISA法检测细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;Western blot检测各组细胞TGF-β_1、Smad2/3、E-cadherin、Vimentin蛋白表达;Real-time PCR检测E-cadherin、Vimentin、TGFβ_1、Smad2、Smad3 mRNA表达。结果:垂盆草总黄酮能显著抑制HSC-T6细胞增殖,明显改变细胞形态,降低肝星状细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量,上调E-cadherin蛋白及mRNA表达,下调Vimentin蛋白及mRNA表达,并能显著降低HSC-T6细胞中TGF-β_1、Smad2/3蛋白及mRNA表达(P0.05)。结论:垂盆草总黄酮能显著抑制肝星状细胞(HSC-T6)增殖及上皮间质转化,作用机制可能与其抑制TGF-β_1/Smad2/3信号通路的激活有关。     

阿魏酸钠对乙醛诱导的肝星状细胞增殖、活化和胶原合成的影响

目的:研究阿魏酸钠(SF)对体外乙醛诱导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖、活化、胶原合成的影响及其作用机制。方法:体外培养HSC-T6细胞,建立乙醛诱导的HSC-T6增殖模型,设空白组、乙醛组、秋水仙碱组(2.5μmol·L~(-1))及SF组(1,10,25,50,100,200,400μmol·L~(-1)),通过细胞增殖和毒性检测(MTS)比色法检测细胞增殖,筛选合适的SF浓度。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SF(400,200,100μmol·L~(-1))对乙醛诱导的HSC-T6细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测Ⅰ型,Ⅲ型胶原浓度,酸水解法检测羟脯氨酸(Hyp)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测转化生长因子-β_1(TGF-β_1),信号转导蛋白Smad2,Smad3,Smad4,Smad7,基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)基因mRNA表达变化。结果:与空白组比较,200μmol·L~(-1)的乙醛能显著诱导HSC-T6体外增殖(P0.01);与空白组比较,模型组HSC-T6增殖显著增加(P0.01),α-SMA和I型,Ⅲ型胶原和Hyp含量显著增加(P0.01),TGF-β_1,Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA的表达显著上调(P0.01),MMP-1和TIMP-1 mRNA表达显著上调(P0.01)。与模型组比较,400,200,100μmol·L~(-1)浓度的SF能明显抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖(P0.05,P0.01),显著降低α-SMA和I型,Ⅲ型胶原和Hyp含量(P0.01),下调TGF-β_1,Smad2,Smad3,Smad4基因mRNA的表达(P0.05,P0.01),上调Smad7基因mRNA表达(P0.01),并明显上调MMP-1 mRNA表达(P0.05,P0.01)和下调TIMP-1 mRNA表达(P0.01)。结论:SF能通过调控TGF-β_1/Smad和MMP-1/TIMP-1信号通路,抑制乙醛诱导的体外HSC-T6细胞的增殖,活化和胶原分泌。     

槲皮素抗肺纤维化的分子机制研究

目的:探究槲皮素在体外抑制小鼠肺纤维化的潜在分子机制。方法:用TGF-β刺激小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NIH3T3构建体外纤维化模型,然后用槲皮素处理,MTT法检测各组细胞不同时间(0、12、24、48 h)细胞增殖情况。ELISA法检测细胞培养液中Ⅰ型胶原Col1和透明质酸酶HA的含量;收集细胞并提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR法检测细胞中TGF-β1超家族信号转导蛋白7(Smad7)mRNA的表达;Western blot检测细胞中TGF-β1超家族信号转导蛋白7(Smad7)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)的表达。结果:槲皮素能够抑制TGF-β诱导NIH3T3细胞的增殖(P0.05)。ELISA检测结果显示槲皮素处理组细胞分泌的Col1与HA的含量较空白组降低(P0.05)。Western blot和RT-q PCR结果显示,Smad7表达水平较对照组显著升高(P0.05),α-SMA、FN蛋白的表达水平显著降低(P0.05)。结论:槲皮素能够缓解TGF-β诱导的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NIH3T3纤维化,作用机制可能是通过调控Smad7信号来实现的。     

姜黄素对肝星状细胞转化生长因子β1及受体和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

目的探讨姜黄素对体外培养大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体、下游信号通路及效应的影响。方法培养HSC细胞,给予不同浓度姜黄素处理,采用MTT比色法检测HSC细胞增殖;Hoechst 33342染色检测姜黄素对HSC凋亡的影响;采用免疫细胞化学法检测Smad3、Smad7蛋白表达;用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β1及其I、II受体(TβRI、TβRII)和I、III型胶原(Col-I、Col-III)mRNA的表达。结果姜黄素能抑制HSC细胞增殖,诱导HSC细胞凋亡,免疫组化结果显示姜黄素能抑制HSC表达Smad3,并提高Smad7表达,RT-PCR结果显示姜黄素使HSC细胞TGF-β1及其I、II受体、Col-I、Col-III mRNA表达降低。结论姜黄素能抑制HSC增殖和活化,抑制TGF-β1及其受体和信号通路,是其抗肝纤维化的作用机制之一。     

氧化苦参碱对TGF-β1诱导的PANC-1细胞Smad3/Gli1通路相关因子表达的影响

目的研究氧化苦参碱(OM)对接受转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的人胰腺导管癌PANC-1细胞中Smad3/Gli1通路相关因子表达的影响。方法以TGF-β1刺激PANC-1细胞模拟胰腺纤维化模型,并观察给予OM干预对Smad3/Gli1通路相关因子表达的影响。通过细胞转染技术将Gli1及Smad3的RNA干扰质粒转染入PANC-1细胞;通过Western blotting技术检测Smad3、Gli1和α-SMA的蛋白表达,ELISA技术检测纤连蛋白(FN)和I型胶原(Co L-I)在细胞培养上清中的表达。结果与对照组相比,PANC-1细胞接受TGF-β1刺激后Smad3、Gli1和α-SMA的蛋白表达显著升高;与TGF-β1组相比,OM和TGF-β1共同处理组Smad3、Gli1和α-SMA的蛋白表达显著降低。转染Smad3干扰质粒后,Gli1、α-SMA、FN和Co L-I表达显著下降。与TGF-β1组比较,转染Gli1干扰质粒后加TGF-β1组α-SMA、FN和Co L-I表达显著降低。结论 OM可能通过调节PANC-1细胞TGF-β1/Smad3/Gli1通路发挥抗胰腺纤维化作用。     

“调肝肾,祛痰瘀”复方血压峰值前给药对自发性高血压大鼠心肾组织TGF-β1-Smads信号通路的影响

目的:探讨"调肝肾,祛痰瘀"复方血压峰值前给药对自发性高血压大鼠(SHR)心肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)-Smads信号通路的影响。方法:将30只12周龄的自发性高血压大鼠,随机分为复方组(4 g·kg-1),氯沙坦组(30 mg·kg-1)和模型组,另设SD大鼠10只为正常组,12周后,采用RT-q PCR检测心肾组织Smad2,Smad3和Smad7 m RNA表达,免疫组化法检测肾组织Smad2,Smad3和Smad7蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组肾脏Smad2,Smad3和心脏TGF-β1,Smad2,Smad3的m RNA表达明显升高,心脏和肾脏Smad7的m RNA表达明显降低(P0.01),肾组织Smad2和Smad3的蛋白表达均明显升高,Smad7蛋白表达明显降低(P0.01);与模型组比较,复方组能够下调肾脏Smad2,Smad3和心脏TGF-β1,Smad3的m RNA表达,上调肾脏和心脏Smad7的m RNA表达;复方组转化生长因子β1(TGF-β1)m RNA表达的下调程度比氯沙坦组明显(P0.05);同时复方组的Smad2和Smad3的蛋白表达均明显下调(P0.01),Smad7蛋白表达均明显上调(P0.01),其中,复方组的Smad7蛋白表达与正常组无统计学差异。结论:调肝肾祛痰复方血压峰值前给药能够明显减少ECM聚积而减少高血压心肾纤维化。其作用机制应是在中医阴阳升降机制协同下,通过下调心肾的Smad2,Smad3和上调Smad7的表达以阻断TGF-β1-Smads信号转导通路所致。     

益气通阳方对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的观察益气通阳方对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化及TGF-β1/Smad7信号通路的影响,探讨其可能的作用机制。方法将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组和西药组各10只。除假手术组外,其余各组建立UUO模型。西药组予依那普利溶液0.18mg/mL灌胃,中药组予益气通阳方浓缩液1.188g/mL灌胃,假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃,每日1次。14d后心脏取血检测大鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平,处死大鼠取其肾组织行HE和Masson染色,免疫组化检测肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)和纤维连接蛋白(FN)的表达,Western blot和RT-PCR分别检测Smad7蛋白和m RNA的表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠血清SCr、BUN明显升高(P0.01),病理改变明显,TGF-β1、FN蛋白表达明显升高(P0.01),Smad7蛋白和m RNA表达明显降低(P0.01);与模型组比较,中药组和西药组大鼠血清SCr、BUN明显降低(P0.05),病理改变减轻,TGF-β1、FN蛋白表达明显降低(P0.05),Smad7蛋白和m RNA表达明显升高(P0.05)。结论益气通阳方可能通过上调Smad7表达,抑制UUO大鼠肾组织TGF-β1的高表达,进而延缓肾间质纤维化进展。     

淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖及纤维连接蛋白表达的影响

目的考查淫羊藿苷(Icariin)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖以及纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)表达的影响。方法采用体外培养HK-2细胞,分为空白对照组、模型组(5 ng·mL~(-1)TGF-β1)、淫羊藿苷不同浓度给药组(5 ng·mL~(-1)TGF-β1+25、50、100、200μg·mL~(-1)淫羊藿苷),培养24 h后给药处理。药物作用72 h后,观察细胞形态变化,并采用MTT法检测细胞增殖情况;采用实时荧光定量PCR法检测细胞FN mRNA的表达;采用ELISA法检测细胞上清液中FN蛋白的含量。结果与空白对照组比较,模型组的细胞增殖受到明显抑制(P0.01),HK-2细胞的FN mRNA表达显著增加(P0.01),细胞培养液中FN蛋白含量显著升高(P0.01)。与模型组比较,25μg·mL~(-1)淫羊藿苷可以促进HK-2细胞的增殖(P0.01),并使细胞形态逐渐趋向正常;不同浓度组的淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞FN mRNA表达以及细胞培养液中的FN蛋白含量均有下调作用,50、100、200μg·mL~(-1)浓度组作用明显(P0.01)。结论淫羊藿苷可能通过促进HK-2细胞增殖与抑制其FN mRNA及蛋白表达,发挥抗TGF-β1诱导的HK-2细胞向成纤维细胞转化的作用。     

虫草素调控eIF2α/TGF-β/Smad信号通路 改善肾间质纤维化的机制

目的:观察冬虫夏草主要有效成分——虫草素(cordycepin)对肾间质纤维化及其e IF2α/TGF-β/Smad信号通路的干预作用和机制。方法:将15只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组,建立小鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)肾间质纤维化模型,虫草素组小鼠经皮下注射虫草素(5 mg·kg-1·d-1),同时,以生理盐水干预对照组和模型组,共5 d。实验结束后,取小鼠结扎侧的肾脏,观察肾间质纤维化病理特征,并测定肾组织I型胶原(collagen type I,Col I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)核酸表达(Northern blot);另外,在体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞),在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β联合或不联合虫草素干预后,观察I型胶原、IV型胶原(collagen type IV,Col IV)核酸表达的变化(Northern blot),并检测e IF2α、磷酸化e IF2α(phosphorylated e IF2α,p-e IF2α)以及Smad2/3、磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3,p-Smad2/3)蛋白表达的变化(Western blot)。结果:虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化,包括纤维化的病理特征以及I型胶原、α-SMA核酸的表达;虫草素在体外促进NRK-52E细胞p-e IF2α的高表达,抑制TGF-β诱导的p-Smad2/3以及I型、IV型胶原的表达水平。结论:虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用,它可能是通过诱导e IF2α磷酸化,抑制TGF-β/Smad信号通路中的关键信号分子——p-Smad2/3表达,减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化。     

当归-红芪超滤膜提取物对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1表达的影响

目的:研究当归-红芪超滤膜提取物对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织转化生长因子-β_1(TGF-β_1),Smad信号通路的调控作用,探讨其对DN大鼠的作用及产生该作用可能的机制。方法:采用一次性大剂量(60 mg·kg-1)腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立DN大鼠模型。将DN大鼠随机分为正常组、模型组、厄贝沙坦组及当归-红芪超滤膜提取物低、中、高剂量组,之后开始灌胃给药,每天1次,8周后测空腹血糖(FBG),尿素氮(BUN),血肌酐(SCr),24 h尿蛋白;光镜观察肾组织结构变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠TGF-β_1,Smad2/3含量;免疫组化法检测肾组织TGF-β_1,Smad2/3蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测肾组织TGF-β_1,Smad2/3的mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG,BUN,SCr,24 h尿蛋白水平明显升高,ELISA检测大鼠TGF-β_1,Smad2/3含量明显升高,肾组织病理结构异常较为明显,TGF-β_1,Smad2/3蛋白量表达明显升高(P0.05,P0.01);与模型组比较,当归-红芪超滤膜提取物各组均不同程度降低了DN大鼠FBG,BUN,SCr,24 h尿蛋白水平(P0.05);ELISA检测大鼠TGF-β_1,Smad2/3含量降低(P0.05),肾组织病理结构异常得到改善,TGF-β_1,Smad2/3蛋白量表达减少(P0.05,P0.01),TGF-β_1,Smad2/3 mRNA表达减少(P0.05,P0.01)。结论:当归-红芪超滤膜提取物可改善DN大鼠肾功能病变,延缓DN慢性病理进展,其机制可能与其抑制TGF-β_1/Smad信号通路有关。     

肾安提取液对糖尿病小鼠肾脏TGF-β1表达的影响

目的:探讨肾安提取液对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠肾脏转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:STZ诱导的糖尿病小鼠模型,随机分为模型组、厄贝沙坦组(厄贝沙坦10mg.kg-1.d-1)、肾安低、中、高剂量组(肾安提取液2.272、4.544、9.088mg.kg-1.d-1),另设正常对照组,疗程4周。检测TGF-β1 mRNA(实时荧光定量PCR法)及蛋白(Western blot分析法)、纤连蛋白(FN)及Smad7蛋白(免疫化学法)表达;透射电镜观察超微结构;并检测血糖、24h尿蛋白定量、肾质量指数、肾小球硬化指数。结果:肾安各组及厄贝沙坦组TGF-β1 mRNA及蛋白表达较模型组明显降低(P<0.01),肾脏FN及Smad7的表达较模型组明显减少(P<0.05,P<0.01);肾脏超微结构改善,肾小球基底膜增厚被明显抑制(P<0.05,P<0.01);24h尿蛋白定量、肾质量指数、肾小球硬化指数均较模型组明显改善(P<0.01);肾安高剂量组及厄贝沙坦组间上述指标无统计学意义;模型组及各药物干预组间血糖差异无统计学意义。结论:肾安提取液可能通过抑制TGF-β1的表达,减轻ECM积聚;并抑制TGF-β1/Smad7信号转导,减少足细胞凋亡,从而对DM肾损害起保护作用。