伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的检测与分析

目的 探讨伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的菌种相关性或亲缘性.方法 分离提取伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,采用16SrRNA基因引物进行PCR扩增,对扩增的16SrDNA产物进行琼脂糖凝胶电泳和碱基序列测定.结果 经PCR扩增后伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型均获得了大小约230 bp的特异性片段,其产物经琼脂糖凝胶电泳可见在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带,碱基序列测定显示具有同其亲代细菌型一致的核苷酸序列.结论 伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学可检测的绝大多数表型特征,但检测16SrRNA基因能快速、灵敏地对其进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定,并且也有利于对各种不能自发返祖的细菌稳定L型进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定.     

伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的生物学特性

目的探讨细胞壁缺陷对细菌生物学特性的影响。方法诱导获得伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株，采用电镜和玻片凝集试验，与亲代细菌型进行比较研究。结果伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株在营养琼脂平板上形成珊瑚红色的圆形、凸起、湿润、边缘整齐而不透明的菌落，低倍镜下菌落为圆球形细胞堆积的颗粒样，不被发酵糖类和沙门菌H或O抗血清凝集。结论细胞壁缺陷可导致细菌丧失部分代谢特性。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌多重PCR及荧光PCR分型方法的建立与评价

目的建立伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的快速和特异的检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的保守序列设计引物和改良分子信标探针,建立多重PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法。结果采用所建立的多重PCR方法可分别检测到伤寒的3条特异性条带、甲型副伤寒沙门菌的2条特异性条带和丙型副伤寒沙门菌的1条特异性条带,但是乙型副伤寒沙门菌未出现特异性条带。建立的实时荧光PCR方法可以快速、特异、灵敏地检测出伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10 fg/reaction和20 CFU/reaction;对77株细菌的检测正确率达100%。结论建立的实时荧光PCR检测方法比多重PCR方法更能快速、特异、灵敏地检测伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌。     

甲型副伤寒杆菌pagC基因分布及其重组表达产物免疫保护作用

目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯表达的rPagC。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测rPagC表达情况及其产量。采用免疫扩散法、ELISA和Western Blot鉴定其抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rPagC对甲型副伤寒杆菌感染的免疫保护效果,微量肥达试验检测rPagC免疫小鼠血清凝集伤寒和副伤寒沙门菌的效果。结果:所有被检测的甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带pagC基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.1%～100%和98.4%～100%。所构建的原核表达系统能高效表达rPagC。rPagC免疫家兔可产生高效价抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号。ELISA结果显示,97.1%(66/68)甲型副伤寒患者血清标本rPagC抗体阳性。100μg和200μg rPagC对感染小鼠的免疫保护率分别为73.3%(11/15)和86.7%(13/15)。rPagC免疫小鼠血清对甲型副伤寒沙门菌和伤寒沙门菌H抗原凝集效价高达1∶10～1∶40。结论:pagC基因在甲型副伤寒沙门菌株中分布广泛。rPagC有良好的免疫原性及较强的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原。     

多重耐药甲型副伤寒沙门菌耐药基因的研究

目的提取贵阳地区1株甲型副伤寒沙门苗基因组,以确定其是否带有抗性基因。方法从30倒样本中筛选一例贵阳地区当前单簇耐药谱最广的菌株。选择一株含抗药性最多的甲型副伤寒沙门菌,提取其基因组,进行PCR扩增Ⅰ类整合子和相关耐药基因。结果通过对该菌Ⅰ类整合子和抗性基因的检测,发现Ⅰ类整合子并携带抗性基因sul2、tetA（G）、blaTEM1等,抗性基因应定位在染色体上。结论多药耐药的甲型副伤寒沙门菌为临床分离株,抗性基因定位在于染色体上,不在以往学者怀疑的3．6kb质粒上。结果显示,此株甲型副伤寒沙门菌的抗性基因应是以Ⅰ类整合子的形式存在染色体上。     

环丙沙星敏感性降低甲型副伤寒沙门菌喹诺酮耐药决定区基因突变分布特征

目的比较研究环丙沙星敏感性降低甲型副伤寒沙门菌的喹诺酮耐药决定区（QRDR）的基因突变分布特征。方法对临床分离甲型副伤寒沙门菌QRDR基因进行扩增和测序分析,比较环丙沙星敏感性降低菌株与环丙沙星敏感菌株QRDR基因突变点差异。结果环丙沙星敏感性降低甲型副伤寒沙门菌QRDR基因存在较明显的突变特征,其中gyrA的Ser83及parC的Thr57位点突变占主导（分别占78.3%和91.3%）,Ser83位点突变率与敏感株相比存在明显差异。结论喹诺酮耐药决定区的基因突变可能是导致甲型副伤寒沙门菌对环丙沙星敏感性降低的原因之一。     

16SrRNA基因快速诊断败血症病原菌研究

目的通过合成所有细菌共有的16SrRNA基因高度保守区引物,进行PCR扩增,探讨败血症的快速诊断方法。方法用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因,以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌为对照,检测该方法的特异性;采用倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果对所测细菌株均获得920bp扩增产物,而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌无交叉反应;PCR最低能检测1.5×106/L大肠杆菌DNA。结论PCR检测方法是一种极有应用价值的用于败血症早期诊断方法。     

PCR-SSCP技术检测细菌16SrRNA基因以快速鉴定葡萄球菌

目的:利用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测细菌16SrRNA基因以快速鉴定葡萄球菌.方法:采用细菌共有的16 SrRNA基因的保守区引物作为通用引物,对葡萄球菌属常见的几种细菌进行PCR扩增,产物进行单链构象多态性分析.结果:采用一对引物的SSCP图谱各细菌之间难以区别;采用两对引物的SSCP图谱条带相对迁移率及条带之间的间距差异较大,可相互区别;金黄色葡萄球菌的标准株和临床株的图谱完全一致.结论:PCR-SSCP技术可方便快捷地检测葡萄球菌.     

用PCR扩增16Sr RNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型

目的：探讨幽门螺杆菌及其稳定L型的检测与鉴定方法。方法：用抗生素诱导、滤菌器过滤、非高渗透压培养基培养获得幽门螺杆菌稳定L型纯培养物,对幽门螺杆菌及其稳定L型进行16SrRNA基因的PCR扩增及序列测定。结果：幽门螺杆菌及其稳定L型的16SrRNA基因PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳,在紫外检测仪下可见550 bp的DNA条带,测序结果经NCB I B last分析比对,基因同源性可达100%。结论：16SrRNA基因PCR检测可用于幽门螺杆菌L型及其他形态变异的菌种鉴定。     

分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的 研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针，探针的5’端标记6-fluorescine(6-FAM)，3，端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoicacid(DABCYL)，对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果 肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袋型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104．5、85．9、83．1、94．8、46，1，Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121．3、64．2、45.6、42．8、54．5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21，结果阳性，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论 分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。     

丙型副伤寒沙门氏菌噬菌体SPC-P1在不同血清型中的分布及整合位点分析

目的:确定丙型副伤寒沙门氏菌( Salmonella paratyphi C, SPC)噬菌体SPC-P1在其他血清型中是否存在,并确定其在宿主菌基因组中的整合位点. 方法:以丙型副伤寒沙门氏菌RKS4594基因组中SPC-P1为模板,设计6对引物,分别在11株伤寒沙门氏菌、11株甲型副伤寒沙门氏菌、12株乙型副伤寒沙门氏菌和23株丙型副伤寒沙门氏菌中进行SPC-P1片段的扩增. 同时下载美国国立生物技术信息中心( National Center for Biotechnology Informa-tion,NCBI)基因组数据库中全基因组序列完成的100株20个血清型的沙门氏菌全基因组序列,通过Mauve 2. 3. 1软件进行比对,以确定SPC-P1在各个血清型中的分布. 根据SPC-P1在RKS4594基因组中的整合位点,设计引物,对10株SPC-P1阳性的丙型副伤寒沙门氏菌进行扩增,并对产物测序,根据测序结果分析SPC-P1 整合情况. 结果:SPC-P1广泛存在于丙型副伤寒沙门氏菌基因组中,14株能够扩增到所有的6个片段,2株扩增到3~5个片段,所有扩增阳性的片段与预期大小吻合. 在伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌中,6个片段均阴性或仅存在1~2个片段,并且片段均比预期小. Mauve比对结果显示,仅在与丙型副伤寒沙门氏菌进化关系较近的猪霍乱沙门氏菌中存在接近完整SPC-P1的片段,但序列相似性存在差异. SPC-P1在丙型副伤寒沙门氏菌基因组中的整合位点是固定的,位于两个相邻基因 pgtE 和yfdC之间. 结论:SPC-P1是丙型副伤寒沙门氏菌独特的致病因子,其存在可能使得丙型副伤寒沙门氏菌的宿主范围、致病性大小等功能方面有别于其他沙门氏菌.     

分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的 研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法 在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5’端标记6-fluorescine(6-FAM),3’端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL),对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果 肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袭型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104.5、85.9、83.1、94.8、46.1,Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121.3、64.2、45.6、42.8、54.5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21,结果阳性,与琼脂糖电泳分析结果一致。结论 分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。     

16S rRNA基因序列鉴定标本中病原细菌的方法学研究

目的研究16S rRNA基因序列鉴定标本中病原微生物的关键技术,评价序列分析技术作为病原微生物检测方法的可行性和实用件。方法对117份不同来源的临床标本分别采用形态学、细菌培养、16S rRNA基因扩增与测序分析,比较不同方法对病原菌检出的灵敏度与特异性。分子技术通过改良的微量核酸提取方法,扩增16S rRNA基因两个区域（BSF8-BSR534和BAK11 w-BAK2）。结果细菌培养和PCR检测的阳性率分别是49％（57／117）和72％（84／117）,63％（53／84）的PCR产物通过直接测序鉴定到种;60例（52％）培养阴性标本中有7例（12％）经序列分析再次鉴定出病原菌;形态学检查阳性率为64％（75／117）,与PCR结果接近,两者结合可提供推测性报告。第1对引物（扩增区：BSF8-BSR534）较适合革兰阳性细菌分类,第2对引物（扩增区：BAK11w-BAK2）对临床常见病原菌均可获得理想的序列。结论改进核酸提取技术、筛选恰当的引物、优化基因扩增和测序流程,通过16S rRNA基因序列直接鉴定标本中病原微生物有着广阔的应用前景。     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究

目的探讨用PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性,了解肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。方法在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV-DNA、37份肝硬化患者腹水进行PCR扩增。腹水中细菌DNA阳性者纯化后经核苷酸测序鉴别细菌种类,同时收集患者临床资料,运用SPSS11.5软件对患者基本临床特征及主要检验结果进行统计分析。结果7种对照菌株均得530bpDNA片段,而与人基因组DNA、HBV-DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。37份腹水中有9份获得530bp DNA片段(24.3%),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),二者比较有显著性差异(P<0.05)。腹水中细菌DNA阳性和阴性的两组肝硬化患者在上消化道出血的发生率、血清总胆红素水平、凝血酶原活动度、Child-Pugh积分、腹水总蛋白浓度、外周血白细胞总数等比较,有显著性差异(P<0.05)。结论用通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。肝功能损害、腹水调理活性低下和上消化道出血是肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。     

应用16S rRNA PCR技术评价益生菌VSL#3对实验性结肠炎大鼠肠道菌群的调节作用

目的:应用细菌的16S rRNA/rDNA序列设计引物,PCR检测经益生菌治疗后肠道菌群的相对变化,观察益生菌VSL#3对大鼠实验性结肠炎的保护作用。方法:将24只SD大鼠以三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇溶液一次性灌肠造成急性实验性结肠炎模型,并随机分成3组,即模型组、VSL#3组和5-氨基水杨酸(5-ASA)组,分别给予生理盐水、益生菌VSL#3、5-ASA灌胃。观察各组大鼠一般情况、体重、大便的改变。1周后处死大鼠,观察结肠病理变化,比较每组炎症积分。留取大便样本,分别进行双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌的培养、计数。应用细菌的16S rRNA/rDNA序列设计引物,对大鼠肠道双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和通用细菌的16S rDNA基因进行PCR检测,并计算前3种细菌16S rDNA基因的相对扩增产物以观察肠道菌群的变化。结果:TNBS造模1周内各组大鼠均出现懒动、食量下降、腹部膨胀、毛色无光泽、体重下降、腹泻、便血的表现。处死后发现每组均有不同程度的结肠、回盲部扩张,局部结肠淤血、与周围组织黏连,肠黏膜有出血点、溃疡甚至糜烂或肠黏膜脱落,以模型组最明显。VSL#3组和5-ASA组的炎症评分显著低于模型组(P<0.05)。经PCR及细菌培养的方法均显示VSL#3组肠道大肠杆菌含量低于另两组(均为P<0.01),而双歧杆菌和乳酸杆菌含量显著高于另两组(P<0.01或P<0.05)。结论:利用细菌16S rRNA/rDNA设计引物,对多种肠道细菌相对含量进行PCR检测,发现益生菌VSL#3可通过调节肠道菌群,达到对大鼠实验性结肠炎的治疗效果。     

Evaluation of antibiotic sensitivity pattern in cases of enteric fever in north west Rajasthan

A total of 50 cases of blood culture proved enteric fever were studied for clinical response to the treatment and compared with in vivo antibiotic sensitivity pattern. Out of 50 Salmonella strains isolated, 37 were S typhi and 13 S paratyphi A. All S typhi isolates were sensitive in vitro to gentamicin and ceftriaxone while sensitivity to ciprofloxacin was 73%, ampicillin 29.7%, chloromphenicol 27%, tetracycline 27% and co-trimoxazole 13.5%. Multidrug resistance (Ampicillin, Chloramphenicol, Cotrimoxazale and Tetracycline) was observed in 62% isolates. All Sparatyphi A isolates were sensitive to all the antibiotics. Clinical response to the antibiotic therapy was as follows: Group I--Ampicillin + Gentamicin: 15 cases, clinical response (CR), 9.1% (S typhi) and 75% (S paratyphi A), mean day of defervescence 5.33 days. Group II--Ciprofloxacin: 29 cases, clinical response 47.6% (S typhi) and 75% (S paratyphi A), mean day of defervescence--5.22 days. Group--III Ceftriaxone: 30 cases, clinical response 100% in all, mean day of defervescence--4.93 days. Thus we observed highly significant discrepancy in antibiotic sensitivity pattern of the isolates and clinical response. Most importantly we observed significantly delayed clinical response to the ceftriaxone. This may be indicative of evolving resistance to ceftriaxone.