体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

LV-EGFP标记兔角膜基质细胞体外基质层移植的实验观察

目的:探讨兔角膜基质细胞(CSCs)体外移植兔角膜后的存活时间。方法:体外培养原代兔CSCs,并行细胞免疫组化鉴定,利用慢病毒载体(LV)携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染兔CSCs,倒置荧光显微镜下观察转染后细胞生长状态及荧光强度,体外动物实验,随机分为2组,实验组行LV-EGFP标记的兔CSCs细胞悬液角膜基质注射,对照组等量生理盐水角膜基质注射,转染后1wk,1mo取材冰冻切片观察移植的CSCs荧光,石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态。结果:LV-EGFP转染兔CSCs在倒置荧光显微镜下24h后可见少量荧光,96h和110h荧光较强,转染后的CSCs与正常CSCs细胞形态无明显差异;转染后1wk,1mo实验组中角膜基质层中可见绿色荧光,对照组中无绿色荧光;石蜡切片1wk实验组见明显上皮细胞增生及角膜轻微水肿,少量炎症细胞浸润,转染后1mo实验组上皮细胞增生减弱,未见角膜层水肿;对照组1wk,1mo均未见明显异常。结论:LV-EGFP标记的兔CSCs行体外角膜基质移植,可在角膜中至少存活1mo,且与邻近组织相容性较好。     

房水对培养的角膜基质细胞的影响

目的观察房水对角膜基质细胞生长的作用。方法将新西兰大白兔的角膜去除后弹力层、内皮层和上皮层后,得到基质层,用组织块培养法体外培养角膜基质细胞。在实验组的培养基中加入10％房水,对照组使用常规培养基培养。通过CCK8实验测得角膜基质细胞的吸光度（A）值以分析细胞增生的情况。分别在培养基中加入2．5％、5％、10％、15％、20％的房水,用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。结果倒置显微镜观察可见培养的角膜基质细胞呈多角形或树枝状,与对照组相比,实验组的细胞生长状态良好,培养的角膜基质细胞数量明显增加。明胶酶谱法显示实验组的条带比对照组清晰。实验第1～5天分别测角膜基质细胞的A值,实验组的检测条带明显强于对照组,〉10％的房水培养组检测的条带明显强于2．5％、5％房水培养组。CCK8检测表明,培养1～5d实验组的角膜基质细胞A值明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论房水作用于角膜基质细胞后,可促进角膜基质细胞的生长,10％房水对体外培养角膜细胞有促细胞增生的作用。     

组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

壳聚糖构建的组织工程角膜基质的实验研究

目的 利用角膜基质细胞与壳聚糖支架共培养构建组织工程角膜基质.方法 将壳聚糖、胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠等按照一定的比例混合,加入原花青素交联剂,构建壳聚糖支架,检测获得的壳聚糖支架的特点及生物相容性.在羊膜上培养兔角膜基质细胞.兔角膜基质细胞与原花青素交联的壳聚糖支架共培养构建初步组织工程角膜基质,行兔角膜板层移植.结果 兔角膜基质细胞可在支架表面上生长,获得初步的组织工程角膜基质.兔角膜板层移植2周后,壳聚糖支架全部脱落.结论 原花青素交联的壳聚糖支架具有良好的生物相容性,在羊膜上培养的兔角膜基质细胞可以保持正常的生物学特性,兔角膜基质细胞和壳聚糖支架可以构建初步的组织工程角膜基质,但不能用于移植.     

脱细胞猪角膜基质体外支持皮肤细胞生长的实验研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质体外是否支持皮肤细胞的生长.方法 制备脱细胞猪角膜基质(前期实验已完成).体外培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞,取第3代人皮肤成纤维细胞接种在脱细胞猪角膜基质的中间基质面,培养3 d后,将材料翻转,取第3代人皮肤表皮细胞接种在材料的上皮面上,再培养10 d后,取细胞-支架复合体制作石蜡切片,HE染色后光镜下观察.结果 组织学观察显示皮肤的表皮细胞和成纤维细胞体外均可在脱细胞猪角膜基质上黏附生长.接种10 d后,皮肤表皮细胞在材料表面形成复层结构,可见角化的细胞.接种13 d可见成纤维细胞存活并在支架层间生长.结论 脱细胞猪角膜基质有良好的细胞相容性,在体外能支持皮肤细胞的生长和增生.     

角膜缘干细胞微环境的研究进展

角膜上皮的更新及损伤后修复有赖于角膜缘干细胞功能正常.角膜缘干细胞的增生及相关特性受干细胞微环境的调控影响.近年研究表明,角膜缘干细胞微环境包括干细胞龛三维结构、干细胞龛中存在的各种细胞类型、细胞分泌的细胞因子及角膜缘特异的基底膜.其中角膜缘细胞外基质和邻近细胞对角膜缘干细胞的调节尤为重要.模拟角膜缘干细胞微环境构建组织工程角膜对实现眼表重建,为患者带来复明希望具有重要意义.