模拟咬合压力对人牙周膜成纤维细胞细胞周期的影响

临床常见咬合创伤引起牙齿松动、牙周膜腔增宽、牙槽骨吸收。牙周膜受损与牙周膜组织及人牙周膜成纤维细胞(hum an periodontal ligam ent fibrob last,HPLF)的生命活动异常有密切关系[1]。本组应用可控压力细胞加载装置,对HPLF加载不同大小的间断性压力[2],用流式细胞仪观察不同间断性模拟咬合压力对HPLF细胞周期的影响,推测50、100 kPa间断性压力对细胞分裂有抑制作用。1材料和方法1.1牙周膜成纤维细胞原代培养和细胞加载方法取青少年因正畸需要而拔除的前磨牙,组织块法[3]原代培养,反复贴壁纯化。置37℃,50 mL/L CO2,100%湿度CO2…     

静态牵张应变对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的:探讨牵张应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响。方法:牵张应变量设为0%、8%、13%、18%、23%共5组,每组分别加载1 h8、h、16 h、24 h后收集细胞,免疫组化检测细胞中COX-2的表达,灰度分析并进行统计学处理。结果:8%~18%牵张应变范围,细胞内COX-2表达随着加载时间和应变量的增高而增强,23%应变量作用下COX-2表达降低,且与加载时间无关联。结论:在细胞的生理应变范围(8%、13%、18%)内,静态牵张应变促进人牙周膜成纤维细胞COX-2的表达,当牵张应变量超过生理应变范围(23%),则COX-2的表达量降低。     

纤维粘连蛋白与流体剪切力对体外培养的牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的：在体外利用流体剪切力模拟咬合创伤,对牙周膜成纤维细胞（HPDLF）给予不同浓度的纤维粘连蛋白（FN）处理．在不同时段测量HPDLF的COX-2mRNA的表达量．以期模拟HPDLF在口腔存在咬合创伤的情况下FN对其生物学行为的影响。方法：收集因正畸矫治需要拔除的健康年轻恒牙,以第3代细胞作为研究对象。样本分为A、B2组,A组为利用水平摇床施加剪切力培养,转速为35r／min;B组为静态培养。A、B2组中分别分为加入FN0μg／ml（对照）、20μg／ml、40μg／ml、60μg／ml等4组,每组4孔。无血清培养6h、12h。采用SPSS13．0软件包对结果进行配对t检验。结果：HPDLF原代培养,24h后80％组织块贴壁。7～10d有细胞从组织块周围游出。14d左右长满培养瓶。免疫组化染色显示抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。RT-PCR结果显示,A组6h后COX-2表达即有体现：12h后,相同FN用量的样本的COX-2表达量较加力6h时高。且表达量随着FN用量的增加而减少。B组中,各样本电泳结果为阴性。光密度扫描分析,配对t检验结果t=13．45,P〈0．01。结论：流体剪切力可以引起HPDLF的炎性反应。人血浆FN可以减少HPDLF的COX-2mRNA表达,呈时间、剂量依赖性。     

脂多糖对人牙周膜细胞COX-2蛋白表达的影响

目的：观察脂多糖对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响,探讨牙周病发生发展过程中脂多糖（LPS）与COX-2的关系。方法：使用不同浓度LPS刺激体外培养人牙周膜成纤维细胞,免疫组织化学法检测细胞COX-2蛋白表达,灰度分析并进行统计学处理。结果：LPS组COX-2蛋白表达明显高于对照组,并且LPS浓度越高,COX-2表达越强。结论：LPS能够诱导人牙周膜成纤维细胞COX-2表达上调,随着LPS刺激浓度增高,COX-2表达逐渐增强,这一机制很可能在牙周炎发生发展过程中扮演重要角色。     

机械压力对人牙周膜成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响

目的：探明机械压力与人牙周膜成纤维细胞转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）蛋白表达的关系。方法：本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加0kPa、250kPa、500kPa、1000kPa的压力,通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量。结果：加载250kPa组、500kPa组在细胞受力后各个时段TGF-β1含量没有变化;1000kPa组在细胞受力后的第12h,TGF-β1含量显著降低。结论：人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1受到机械压力的调控;在一定载荷作用下,TGF-β1的含量随着压力的增大而有所降低。     

机械压力对牙周膜成纤维细胞P38蛋白激酶激活及转位的影响

目的：研究P38蛋白激酶是否参与机械压力在牙周膜成纤维细胞的信号转导过程，初步探讨咬合创伤对牙周组织损伤机制。方法：本实验通过免疫组化法观察机械压力刺激后，牙周膜细胞内磷酸化P38蛋白激酶不同时间定位、强度的变化。结果：当压力大于200Kpa时，细胞内P38蛋白激酶磷酸化程度增强，且在30分钟时染色颗粒由脑浆转移至胞核，约60分钟后染色降至刺激前水平。结论：初步证明机械力信号可通过细胞路膜转导，并激活脑浆内P38蛋白激酶转移至胞核。     

羧甲基壳聚糖对LPS干预人牙周膜成纤维细胞表达PGE2的影响

目的:观察脂多糖(LPS)干预下,不同浓度羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMC)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)表达前列腺素E2(PGE2)的影响. 方法:取冻存的人牙周膜成纤维细胞进行复苏培养,以浓度为10 mg/L的LPS进行诱导,用不同浓度的CMC进行干预,采用免疫组织化学方法检测PGE2在HPDLFs中的表达变化.结果:不同浓度CMC能够下调同一浓度LPS诱导的HPDLFs表达的PGE2,随CMC浓度的增加PGE2的表达量呈逐渐减弱趋势(P<0.05). 结论:CMC可能对LPS诱导的HPDLFs炎症损伤过程中表达PGE2有重要的抑制作用.     

微丝对牵张应变诱导的人牙周膜成纤维细胞中环氧合酶-2表达的影响

目的 探讨微丝的聚合在人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）正畸力信号传导中的作用。方法 将培养的hPDLFs接种于膜式细胞牵张应变施加装置上,随机分为对照组、单纯加力组、加力+细胞松弛素组。对照组牵张应变量为0;单纯加力组和加力+细胞松弛素组设定细胞静态牵张应变量为18%,加载时间分别为8 h、16 h和24 h。加力+细胞松弛素组在施加牵张应变量前加入5 μg/mL的细胞松弛素B来破坏微丝的聚集作用。用免疫组织化学法检测细胞中环氧合酶-2（COX-2）的表达,测定灰度值并进行统计学处理。结果 单纯加力组在18%牵张应变量作用下,COX-2表达随着加载时间的增加而增强;加力+细胞松弛素组在18%牵张应变量作用下,COX-2的表达明显降低,且各加载时间组间表达无差别。结论 微丝的聚合介导了hPDLFs中正畸力信号传导,破坏微丝的聚合作用将阻碍力学信号的传导,从而降低COX-2的表达。     

静态拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞的影响

目的：研究人牙周膜成纤维细胞(PDLF)在机械拉伸应变作用下，细胞和细胞核投影面积及其细胞骨架的改变情况，探讨PDLF的形态、功能和应变之间的关系。方法：采用自制的细胞体外静态机械加载装置用不同的拉伸应变量加力于细胞上，通过激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架的形态及其改变情况，并进行统计分析。结果：在8％、12％、16％力值组，细胞和细胞核投影面积随着加力时间和力值的增加而每天递增，肌动蛋白纤维也随之逐渐增粗，排列更有规律；而在20％力值组，其结果则反之。结论：静态拉伸应变可影响牙周膜成纤维细胞的骨架。     

咬合力改变对牙周膜成纤维细胞凋亡及其凋亡相关基因表达的影响

目的观察咬合力改变对牙周膜成纤维细胞凋亡及其相关基因表达的影响。方法拔除健康雄性SD大鼠右上颌第一、二、三磨牙建立右下颌磨牙咬合力改变动物模型,分别于拔牙后6、12h及1、2、3、5、7、14、28d处死大鼠(n=6),取右下颌磨牙区牙槽骨组织,进行H-E染色和透射电镜观察;免疫组化染色检测牙周膜成纤维细胞Bcl-2和Bax表达。另设正常咬合力大鼠作为对照组(n=6)。免疫组化染色结果采用二级计分法,根据染色强度及阳性细胞的数目进行计分取平均值。结果成功建立咬合力改变SD大鼠模型。H-E染色结果显示实验组牙周膜结构疏松,纤维排列无序,牙槽骨骨壁凹凸不平;透射电镜结果显示实验组牙周膜成纤维细胞出现核固缩、核染色质浓缩、边集。免疫组化染色表明拔牙后12h牙周膜成纤维细胞Bax表达最高(216.83±6.34),而Bcl-2的表达在3d时达峰值(219.33±10.25),此后二者均开始下降,至28d基本恢复正常(7.00±2.37,5.67±2.16,P<0.01)。结论细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax参与了牙周膜的改建过程。     

人牙周膜成纤维细胞增殖与压力关系的初步观察

目的：在体外培养环境下观察压力对人牙周膜成纤维细胞（HPLF）增殖的影响。方法：取第4－6代培养的HPLF,应用可控压力细胞加载装置分别间断性施加30、60、90kPa的压力,分别在培养3、5、7d后用MTT法测定各组的A值。结果：HPLF在30、60、90kPa的压力培养环境下MTT反应的A值显著小于对照组,压力值越大,A值越小。结论：30、60、90kPa间断性压力显著抑制PLF细胞增殖,该抑制作用随压力值增大而增强。     

bFGF和壳聚糖对人牙周膜成纤维细胞的作用

目的:探讨水溶性壳聚糖和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)二者联合应用,对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的生长增殖和成骨性能的影响。方法:原代培养HPDLFs,观察bFGF和壳聚糖联合作用于HPDLFs后,细胞的增殖情况(MTT比色测定法)、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素(OC,放免法检测)的变化情况,并进行统计学分析。结果:bFGF(10ng/ml)和低剂量壳聚糖(0.2mg/ml)组促进细胞增殖,不降低碱性磷酸酶活性,且提高骨钙素合成量。相对bFGF单独作用组,bFGF和壳聚糖联合作用组可上调ALP活性,bFGF(10ng/ml)和高剂量壳聚糖(2mg/ml)组抑制细胞增殖,不降低碱性磷酸酶活性,且有较高的骨钙素合成量。结论:bFGF和低剂量壳聚糖联合作用既可促进细胞增殖,又可促进HPDLFs向成骨细胞转化。bFGF和壳聚糖联合应用可能是一种新型的牙周组织再生的诱导材料。     

Expression of tropoelastin in human periodontal ligament fibroblasts after simulation of orthodontic force

The ability of elastic fibers to respond to mechanical stimuli suggests that they play a central role in physiological adaptation to external stimuli including application of orthodontic force. The purpose of this study was to examine the effect of external pressure simulating orthodontic force on tropoelastin gene expression in cultured human periodontal ligament fibroblasts (hPDLF). External pressure simulation was achieved by centrifugation for 10, 30, 60, 90 and 120 min of hPDLF in a horizontal microplate rotor. Semi-quantitative RT-PCR analysis of tropoelastin mRNA was performed and beta-actin was used as an internal invariant control. While centrifugal force on mRNA levels of beta-actin showed almost no change, the mRNA levels of tropoelastin increased significantly to a peak level of more than four-fold after 30 min. Thereafter, at 60 min, the mRNA levels remained at more than three-fold. After 90 min, mRNA levels decreased to control levels. The finding that no changes in mRNA levels of beta-actin occurred during the first 90 min of centrifugation validates its use as an invariant control gene in such an experimental model. This study demonstrated that tropoelastin is expressed in hPDLF and that the pressure caused significant time-dependent upregulation of the tropoelastin gene. The responsiveness of the tropoelastin gene to force shows its possible clinical importance in orthodontic tooth movement. Further studies, however, are essential in order to learn whether the high expression of the gene in vitro will also be followed by corresponding protein synthesis and deposition in vivo in the extracellular matrix (ECM) of the periodontal ligament (PDL).     

静态机械拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞前列腺素E2分泌量的影响

目的：研究静态机械拉伸应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞前列腺素E2(PGE2)分泌量的影响。方法：实验的拉伸应变量设为0％、8％、12％、16％、20％5种，加力时间为24、48、72h3种，总共分为15组，每组设3个样本。加力完毕后，用RIA ELISA法分析每个样本培养基中PGE2的含量并进行统计分析。结果：在0％力值组，PGE2的每天分泌量与加力时间无关；在8％、12％、16％力值组，PGE2的每天分泌量随着加力时间和力值的增加而递增，但每天递增量随着加力时间的增加而减少；在20％力值组，PGE2的每天分泌量与加力时间成反比；在各个时间组，PGE2的每天分泌量均在16％力值处达到最高值。结论：在细胞的生理应变承受范围(0％、8％、12％、16％)内，静态机械拉伸应变促进人牙周膜成纤维细胞PGE2的分泌，但刺激效应随着加力时间的增加而减少；当拉伸应变量超过了细胞的生理应变承受范围(20％)．则PGE2的分泌量会随着加力时间的增加而减少。     

牙周膜相关蛋白1在人牙周膜细胞成骨分化过程中的表达

目的 研究牙周膜相关蛋白1（PLAP-1）在人牙周膜细胞（PDLC）成骨分化过程中的表达变化,为明确PLAP-1 在牙周组织中的作用奠定基础.方法 酶消化法培养人PDLC,免疫细胞化学染色鉴定其来源和PLAP-1 的表达,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）实验鉴定其成骨分化能力,定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测其成骨分化过程中,PLAP-1、Periostin、RGD-CAP、RUNX2、OCN 和OPN mRNA 表达变化,Western blot 检测PLAP-1、RUNX2 和OCN 蛋白表达变化并进行统计分析.结果 培养的人PDLC 来源于间充质;人PDLC 矿化诱导21 d 后茜素红染色阳性,矿化诱导后7、14、21 d 时ALP 活性较对照组明显增高（P ＜ 0.05）,具有成骨分化能力;PLAP-1 免疫细胞化学染色阳性;定量RT-PCR 和Western blot 结果显示,人PDLC 在mRNA 和蛋白水平均表达PLAP-1,且mRNA 表达量随人PDLC 成骨分化过程发生变化,诱导14 d上调,诱导21 d 下调,较对照组有明显差异（P ＜ 0.05）,Western blot 检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 PLAP-1 在基因及蛋白水平均高表达于人PDLC,其表达量随人PDLC 成骨分化成一定模式,提示其参与调控牙周膜的功能与稳定,但其精细的调控功能还有待进一步深入研究.     

牙周韧带细胞与牙龈成纤维细胞生长特性及其胶原表达的比较研究

利用体外细胞培养技术及四唑盐比色法观察了牙周韧带细胞(PDLC)和牙龈成纤维细胞(GF)在体外生长、增殖的情况,用免疫荧光法观察了其细胞外基质表达的差异。结果显示GF较PDLC更容易成活,其增殖速度更快,且GF中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达均较PDLC强,提示在相同生长环境下,GF较PDLC可能有更强的生长能力。     

咬合力丧失对大鼠磨牙牙周膜bFGF表达的影响

目的 研究咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ，ＰＤＬ）内碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）表达的动态变化，结合其他实验结果初步探讨了ｂＦＧＦ与Ⅱ型胶原ｍＲＮＡ表达的关系。方法 采用拔牙法建立咬合力丧失的动物模型，应用免疫组织化学法研究其磨牙牙周膜内ｂＦＧＦ表达的动态变化。结果 在１天、２天、３天、１周与     

机械压应力条件下人牙周膜成纤维细胞炎症因子表达变化初探

目的 探讨在一定机械压应力条件下人牙周膜成纤维细胞常见炎症相关细胞因子的表达谱变化,初步明确机械压应力对牙周膜成纤维细胞炎症相关细胞因子表达的影响.方法 取健康恒前磨牙牙根中1/3牙周膜组织,采用组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,分为加压组(200 Pa持续加压)与未加压组培养24 h后,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时定量PCR法检测白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、干扰素(interferon,IFN)-γ的mRNA表达量并与管家基因磷酸甘油醛脱氢酶进行对比.加压组与未加压组培养48 h后通过微球流式多因子方法检测上述细胞因子蛋白水平的表达量.结果 加压组人牙周膜成纤维细胞培养24 h后细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β及IFN-γ mRNA相对表达量(分别为0.3633±0.0874、0.4200±0.0285、0.1697±0.0284、0.0983±0.0131、0.2840±0.0676及3.1067±0.2857)显著高于未加压组(分别为0.1173±0.0176、0.1691±0.0174、0.0117±0.0021、0.0243±0.0050、0.0000±0.0000及0.1433±0.0125),P＜0.05;加压组人牙周膜成纤维细胞培养48 h后细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β及IFN-γ的蛋白表达量[分别为(18.21±1.01)、(1634.11±472.41)、(1461.47±50.53)、(20.71±2.52)、(884.11±118.86)以及(1461.47±333.37)ng/L也显著高于未加压组[分别为(5.32±4.97)、(373.56±155.92)、(679.11±141.42)、(4.32±0.73)、(3.56±0.92)及(204.11±35.36)ng/L],P＜0.05;IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及IL-12的mRNA相对表达量及蛋白表达在两组中差异无统计学意义(P＞0.05).结论 人牙周膜成纤维细胞在持续机械压应力作用下可显著上调IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β、IFN-γ等炎症相关细胞因子mRNA及蛋白水平的表达,从而进一步影响局部牙周组织微环境.

Abstract：

Objective To investigate the changes of inflammation-related cytokine expression profiles in human periodontal ligament fibroblasts (hPDLF) under mechanical stress. Methods The periodontal ligament attached to the mid-third part of the fresh root of young premolars extracted for orthodontic treatment was scalped and removed hPDLFs were cultured by the method of digesting by Ⅰ -type collagenase combined with tissue adhering, and then isolated and purified by cells passages. hPDLFs were then divided into two groups, group with mechanical force and group without mechanical force and then cultured for 24 h. Employing cytokine-microarray analysis to assess, in a comprehensive manner compared to the hPDLFs culture system without a static force. The quantity of different cytokine-related genes in hPDLFs was analyzed by means of quantitative with the special primers of up-and down-regulated genes. The mRNA of inflammation-related cytokines was examined by real-time PCR, and the expression of the cytokines in hPDLFs detected by cytokine flowcytomix assay. Results The relative expression of interleukin (IL)-1β,IL-6, IL-8, tumor necrosis factor(TNF)-α, TNF-β and interferon(IFN)-γ mRNA in the hPDLFs with 24 h persistent-pressure (0. 3633 ± 0. 0874, 0. 4200 ± 0. 0285, 0. 1697 ± 0. 0284, 0. 0983 ± 0. 0131, 0. 2840 ±0. 0676 and 3. 1067 ±0. 2857) was significantly higher than the group without mechanical force(0. 1173 ±0.0176, 0. 1691 ± 0.0174, 0.0117 :± 0.0021, 0.0243 ± 0.0050, 0.0000 ± 0.0000 and 0.1433 ±0. 0125) ,P ＜0. 05. The cell culture supernatant cytokines expression of IL-1 β, IL-6, IL-8, TNF-α, TNF-βand IFN-γ after 48 h cultured [(18.21 ± 1.01), (1634. 11 ± 472. 41), (1461.47 ± 50. 53), (20. 71 ±2. 52), (884. 11 ± 118. 86) and (1461.47 ± 333.37) ng/L]was significantly higher than the group without mechanical force [(5. 32 ± 4. 97), (373.56 ± 155.92), (679. 11 ± 141.42), (4. 32 ± 0. 73), (3.56 ±0.92)and(204. 11 ±35.36) ng/L],P ＜0.05. The relative mRNA and protein expression of IL-2, IL-4,IL-5, IL-10 and IL-12 showed no significant difference between the both groups. Conclusions Persistent static mechanical force could regulate the expression of some inflammation-related cytokines. These upregulated cytokines may be invloved in remodeling of hPDLFs, bone resorption and periodontal microenvironment.